Перспективы использования метода гальваностатической кулонометрии для оценки интегральной антиоксидантной активности молока и кисломолочной продукции

Министерство науки и высшего образования Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего образования

«Казанский национальный исследовательский

технологический университет»

Ю. В. Щербакова, Ф. Ю. Ахмадуллина, Е. А. Егорова 

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ 
МЕТОДА ГАЛЬВАНОСТАТИЧЕСКОЙ 

КУЛОНОМЕТРИИ ДЛЯ ОЦЕНКИ 

ИНТЕГРАЛЬНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ 

АКТИВНОСТИ МОЛОКА 

И КИСЛОМОЛОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ

Монография

Казань

Издательство КНИТУ

2019

УДК 137.1:543
ББК 36.95:Г46

Щ61

Печатается по решению редакционно-издательского совета 

Казанского национального исследовательского технологического университета

Рецензенты:

д-р биол. наук, ст. науч. сотр. А. Б. Выштакалюк

канд. биол. наук, доц. А. Р. Каюмов

Щ61

Щербакова Ю. В.
Перспективы использования метода гальваностатической кулонометрии для оценки интегральной антиоксидантной активности молока и кисломолочной продукции : монография / Ю. В. Щербакова, 
Ф. Ю. Ахмадуллина, Е. А. Егорова; Минобрнауки России, Казан. 
нац. исслед. технол. ун-т. – Казань : Изд-во КНИТУ, 2019. – 128 с.

ISBN 978-5-7882-2789-4

Обобщены и систематизированы данные по антиоксидантной системе 

молока, включающей соединения различной природы, и механизмам их действия, а также представлена информация о методах определения интегральной 
антиоксидантной активности в сравнительном аспекте. Приведены методика 
выполнения измерений интегральной антиоксидантной активности на основе 
метода гальваностатической кулонометрии и полученные на ее основе экспериментальные данные для молочного сырья казеинового типа и кисломолочной продукции. Предложены рекомендации по реализации данного метода 
в производственных условиях. 

Предназначена студентам, аспирантам и специалистам ряда отраслей 

пищевой промышленности, разработчикам новых видов молочной продукции, 
в том числе продуктов функционального назначения, а также широкой аудитории читателей, отдающих предпочтение здоровому типу питания.

Подготовлена на кафедре промышленной биотехнологии.

ISBN 978-5-7882-2789-4
© Щербакова Ю. В., Ахмадуллина Ф. Ю., 

Егорова Е. А., 2019

© Казанский национальный исследовательский 

технологический университет, 2019

УДК 137.1:543
ББК 36.95:Г46

С О Д Е Р Ж А Н И Е

Введение ................................................................................................................. 4
Глава 1. СВОБОДНО-РАДИКАЛЬНОЕ  ОКИСЛЕНИЕ И АНТИОКСИДАНТЫ............ 6
Глава 2. АНТИОКСИДАНТНАЯ СИСТЕМА  МОЛОКА............................................ 13
2.1. Антиоксиданты белковой природы ............................................................. 13

2.1.1. Казеиновая фракция молока ............................................................ 14
2.1.2. Сывороточные белки......................................................................... 15
2.1.3. Ферменты ........................................................................................... 21

2.2. Витамины — компоненты  антиоксидантной системы молока................. 32

2.2.1. Провитамины ..................................................................................... 32
2.2.2. Жирорастворимые витамины........................................................... 35
2.2.3. Водорастворимые витамины............................................................ 40
2.2.4. Витаминоподобные вещества .......................................................... 46

2.3. Низкомолекулярные компоненты  антиоксидантной защитной 
системы молока.................................................................................................... 50
2.4. Гормоны ......................................................................................................... 58
Глава 3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ  АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ:  
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ................................................................................... 62
3.1. Люминесцентный анализ ............................................................................. 64
3.2. Фотометрические методы ............................................................................ 71
3.3. Электрохимические методы......................................................................... 77
Глава 4. ГАЛЬВАНОСТАТИЧЕСКАЯ  КУЛОНОМЕТРИЯ ДЛЯ ОЦЕНКИ 
ИНТЕГРАЛЬНОЙ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ МОЛОКА 
И МОЛОЧНОЙ ПРОДУКЦИИ................................................................................. 91
4.1. Методика определения интегральной  антиоксидантной 
активности молочной  продукции и рекомендации по реализации 
метода в производственных условиях ............................................................... 91
4.2. Экспериментальное подтверждение  перспективности применения 
метода  кулонометрического титрования  электрогенерированным 
бромом на практике............................................................................................. 95

4.2.1. Стадия приемки молока.................................................................... 95
4.2.2. Стадия пастеризации молока ........................................................... 97
4.2.3. Сравнительный мониторинг качества  кисломолочных 
продуктов различных  производителей .................................................... 99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................ 103

В В Е Д Е Н И Е

Неблагоприятная экологическая обстановка, напряженный жиз
ненный ритм, высокие психоэмоциональные нагрузки в современных 
условиях – основные причины резкого всплеска заболеваний, обусловливающих активное стремление человека улучшить свое здоровье и 
укрепить иммунную систему. Учитывая свободнорадикальный механизм большинства патологий [1, 2], к ключевым проблемам сегодняшнего дня следует отнести разработку и расширение ассортимента продуктов здорового питания, обладающих антиоксидантными свойствами, позволяющими сохранить необходимый баланс между свободными радикалами и антиокислителями иммунной системы и обеспечить нормальное функционирование организма человека.

Продукты здорового питания, или функциональные продукты, 

являясь продуктами естественного происхождения [3, 4] способны при 
систематическом употреблении оказывать регулирующее действие на 
организм из-за повышения его устойчивости к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, а также общеукрепляющих 
свойств и, как следствие, предупредить болезни и преждевременное 
старение человека в сложившейся среде обитания. Поэтому сохранение 
здоровья населения, в том числе опосредованно через пищевые продукты функционального назначения, – приоритетное направление государственной политики РФ.

Отечественные разработчики [5] выделяют три категории про
дуктов функционального питания:

1. Традиционные продукты, содержащие в нативном виде значи
тельное количество антиоксидантов различной природы, что, в первую 
очередь, касается молока и молочной продукции.

2. Традиционные продукты, в которых снижено содержание 

вредных для здоровья компонентов, например гидрогенизированного 
масла и др.

3. Продукты, обогащенные биологически активными веще
ствами, включая антиоксиданты.

Однако объем информации об ингредиентах продуктов питания, 

доступный для потребителей, явно недостаточен ввиду отсутствия данных по их физиологическому воздействию. Поэтому изучение антиоксидантной активности – важнейшая задача при разработке продуктов 
питания функционального назначения, включая лечебно-профилактические.

В связи с этим возникает необходимость достоверно контролиро
вать антиоксидантную активность пищевых продуктов и ее изменение 
как при переработке сельскохозяйственного сырья, так и при хранении 
продукции, которая может претендовать на роль современного качественного показателя [6]. Но многообразие и полифункциональный характер антиокислителей природных сырьевых источников, роль которых может существенно различаться в разных условиях активации свободно-радикальных процессов, и невозможность их отдельного определения из-за недостаточного развития инструментально-аналитической базы диктуют необходимость изыскания и разработки методов 
определения интегральной антиоксидантной активности пищевой продукции и в особенности молочной и кисломолочной, содержащей большой природный комплекс биологически активных веществ, проявляющих антиокислительные свойства [7, 8]. 

Разработанные на сегодняшний день методики определения ан
тиоксидантной активности (фотометрические, люминесцентные, электрохимические методы) отличаются различной степенью интегральности, и информация в этой области имеет разобщенный характер. Поэтому очевидна актуальность исследований в области изучения, обобщения и систематизации данных по антиокислительным свойствам молочного сырья и влияния на компоненты антиоксидантной системы молока различных факторов, а также скрининга перспективных методов 
определения интегральной антиоксидантной активности и оценки 
уровня их применимости в молочной промышленности.

Г л а в а  1 .  С В О Б О Д Н О - Р А Д И К А Л Ь Н О Е  

О К И С Л Е Н И Е  И  А Н Т И О К С И Д А Н Т Ы

Основная причина патологических процессов в организме чело
века, вызывающих преждевременное старение и развитие многих болезней, – избыточное накопление в организме активных форм кислорода [9, 10], представляющих собой в основном свободные радикалы. 
Под свободными радикалами понимают молекулу или ее часть, имеющую неспаренный электрон на молекулярной или на внешней (валентной) атомной орбитали, что свидетельствует о наличии у молекулы свободной валентности.

Свободный радикал (СР) с одним неспаренным электроном назы
вается монорадикалом, а с двумя – бирадикалом, причем число неспаренных электронов соответствует числу свободных валентных связей. 
Радикал может нести электрический заряд, и тогда его называют ионрадикалом. Это происходит при одноэлектронных окислительно-восстановительных реакциях, когда образуются анион- или катион-радикалы [11]. Для СР характерна большая реакционная способность по отношению ко многим нейтральным молекулам.

Активные формы кислорода (АФК) включают ряд химически ак
тивных молекул, производных молекулярного кислорода, являющихся 
нормальными метаболитами, и рассматриваются в настоящее время 
многими авторами в качестве сигнальных молекул, участвующих в регуляции различных клеточных процессов [10]. При этом молекула кислорода, выступая в роли акцептора, претерпевает 4 этапа восстановления с образованием АФК [12]:

O2+1e = O2

•−
супероксид-анион

O2

•− +1e + 2Н+= Н2 О2
пероксид водорода

Н2 О2 +1e + Н+= Н2 О + ОН•
гидроксильный радикал

ОН• +1e + Н+= Н2 О
Однако в биологических системах наряду с АФК образуются дру
гие активированные кислородные структуры, являясь нормальными 
продуктами обмена веществ или возникая при изменении условий жизнедеятельности, в том числе при действии на клетку ионизирующих и 
ультрафиолетовых излучений, ультразвуковых колебаний, различных 
экотоксикантов, а также при многих заболеваниях: 𝑂2

ʹ , 𝐻2𝑂2, 𝑂𝐶𝑙−, 𝑅𝑂2

•

и др. Среди последних можно выделить как свободные радикалы, так и 

кислородсодержащие молекулы, синглентный кислород, гипогалоиды, 
которые не являются радикалами, но взаимодействуют с органическими молекулами через радикальные механизмы.

Кроме того, неспаренный электрон может быть локализован на 

атомах углерода, серы, азота: для живых организмов важное значение 
имеют тиильные радикалы глутатиона (𝐺𝑆•) или радикалы мочевой 
кислоты с локализацией электрона на атомах S и N [13].

Для объединения в единую систему вышеуказанных реакцион
ных форм была предложена классификация активных кислородных метаболитов (АКМ) [14] (рис. 1.1).

Рис. 1.1. Свободные радикалы и активные кислородные соединения

АКМ – это высокореакционноспособные кислородсодержащие 

соединения, образующиеся в живых организмах в результате неполного восстановления молекулярного кислорода [13].

Другая классификация реакционных кислородных форм приве
дена в работах Ю. А. Владимирова [15–17], где выделяются три категории активных форм кислорода: первичные, вторичные и третичные. 

Первичные радикалы образуются из молекул за счет реакций од
ноэлектронного окисления с участием металлов переменной валентности. Это компоненты дыхательной цепи, такие как радикалы убихинона 
(коэнзима Q), супероксид и окись азота (NO). Вторичными радикалами 
называются те, которые образуются из перекиси водорода, липоперекисей и гипохлорита в присутствии ионов двухвалентного железа, потому что сами эти радикал-продуцирующие молекулы образуются, как 
правило, из первичных радикалов. К вторичным радикалам относятся 
прежде всего гидроксильный радикал и (с некоторыми оговорками) липидные радикалы, участвующие в реакциях цепного окисления ненасыщенных жирнокислотных цепей липидов биологических мембран и 

липопротеинов плазмы крови. Наконец, в качестве третичных можно 
рассматривать радикалы, которые образуются при действии вторичных 
радикалов на молекулы антиоксидантов и других легкоокисляющихся 
соединений [16].

Следует подчеркнуть принципиальную разницу в биологическом 

действии первичных и вторичных радикалов. Первичные радикалы 
специально вырабатываются нашим организмом и выполняют жизненно важные функции переноса электрона в дыхательной цепи (убихинон), защиты от микроорганизмов (супероксид) и регуляции кровяного давления (окись азота), тогда как вторичные радикалы оказывают 
цитотоксическое действие и, как правило, наносят организму большой 
вред. Роль третичных радикалов может быть разной [17].

Избыток АКМ (в литературе чаще используют термин АФК) пред
ставляет большую опасность вследствие способности повреждать молекулы жизненно важных биополимеров и других компонентов клетки 
[10], вызывая окислительный или оксидативный стресс.  Окислительный 
стресс – важный патогенетический фактор многих заболеваний, особенно бронхолегочных и сердечно-сосудистых [18, 19], связанных с 
функциональными нарушениями биологических барьеров [13].

Защита клеток, тканей и других биоструктур от токсического 

действия АФК и органических свободных радикалов осуществляется 
[10] антиоксидантами, или антиокислителями. 

В настоящее время отсутствует единое определение понятия «ан
тиоксидант», что подтверждает нижеприведенная информация.

Согласно определению [20], под такими веществами понимаются 

соединения различной химической природы, способные тормозить или 
устранять свободнорадикальное окисление органических веществ молекулярным кислородом, что согласуется с определением, приведенным в обзорной литературе [21]. 

Более подробное определение термина «антиоксидант» приве
дено в [22]. По нему «антиоксиданты – это молекулы, способные блокировать реакции свободнорадикального окисления, восстанавливая 
разрушенные соединения. Когда антиоксидант отдает свой электрон 
окислителю и прерывает его разрушительное действие, он сам окисляется и становится неактивным. Для того чтобы вернуть его в рабочее 
состояние, его надо снова восстановить». 

Или антиоксидант – это молекула, которая ингибирует оксидиро
вание других молекул [23].

Применительно к молоку и молочной продукции авторы работ 

[24, 25] под антиоксидантами, или ингибиторами окисления, понимают 
«химические соединения, которые замедляют или предотвращают 
окисление липидов молока и молочных продуктов кислородом воздуха, 
в результате которого образуются нежелательные, а порой и токсичные 
вещества, например, различные пероксиды, альдегиды, кетоны, оксокислоты, низкомолекулярные жирные кислоты, снижающие пищевую 
и биологическую ценность продукта».

Для природных антиоксидантных систем характерны различные 

механизмы действия [10]:

1. Ингибирование радикальных форм АКМ, способных отрывать 

атом водорода с образованием органических радикалов.

2. Изменение структурной организации, затрудняющее окисле
ние.

3. Локальное снижение концентрации О2 и предотвращение его 

включения в окисление.

4. Взаимодействие с органическими радикалами и предотвраще
ние развития цепных окислительных процессов.

5. Связывание или окисление ионов металлов переменной ва
лентности, инициирующих разложение перекисей и образование радикалов;

6. Перевод перекисей в стабильные продукты окисления: спирты, 

альдегиды, кетоны.

Надо отметить, что основную массу антиоксидантов составляют 

вещества, содержащие подвижный атом водорода. Среди таких антиоксидантов можно выделить две большие группы соединений, содержащих 
функциональные ОН-группы (гидроксильные) или SH-группы (тиольные) [10].

Эффективными перехватчиками радикалов являются фенольные 

антиоксиданты, к которым относятся соединения, имеющие в своей 
структуре ароматическое кольцо, связанное с одной или несколькими 
гидроксильными группами Ar(OH)n. В зависимости от природы ароматического фрагмента (Ar) различаются собственно фенолы, а также 
нафтолы и оксипроизводные других гетероароматических соединений. 
В зависимости от числа ОН-групп, присоединенных к одному ароматическому ядру, различают моно- и полифенолы, а от числа фрагментов 
Ar(OH)n – моно- и полиядерные [10].

Главным действующим началом, обеспечивающим фенольным 

антиоксидантам 
способность 
тормозить 
радикальные 
процессы 

окисления, является гидроксильная группа, присоединенная к ароматическому ядру. Благодаря наличию в структуре ароматического кольца 
обобщенной системы -электронов происходит смещение отрицательного заряда на кислород, результатом чего становится достаточно легкий 
отрыв атома водорода от гидроксила с образованием разных изомерных 
форм фенокси-радикала. Такие соединения выступают перехватчиками 
перекисных и алкоксильных радикалов в реакциях:

RO + ArOH → ROH + ArO,

RO2 + ArOH → ROOH + ArO.

Взаимодействие фенольных антиоксидантов с органическими ра
дикалами приводит к образованию феноксильных радикалов (ArO), которые в дальнейшем могут участвовать в реакциях диспропорционирования с образованием хинолидных перекисей:

ArO + RO2 → RO2ArO,

ArO + ArO → Ar2O2.

В результате распада хинолидных перекисей возникают хинонные 

формы молекул, которые в нормальных условиях не обладают антиоксидантными свойствами, однако при дефиците О2 могут тормозить окисление посредством взаимодействия с алкильными радикалами, например, 
в такой реакции [13]:

Как правило, синтез ароматического кольца возможен только у 

высших растений и микроорганизмов, в то время как животные преимущественно только преобразовывают различные ароматические соединения, за исключением синтеза убихинона и эстрогенов. Поэтому многие 
из фенольных антиоксидантов входят в группу так называемых «пищевых антиоксидантов», т. е. соединений, потребность организма в которых удовлетворяется поступлением с пищей.