Применение молекулярных методов исследования в генетике

Москва

ИНФРА-М

202ПРИМЕНЕНИЕ

МОЛЕКУЛЯРНЫХ

МЕТОДОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ

В ГЕНЕТИКЕ

УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ

Л.Н. НЕФЕДОВА

Рекомендовано

в качестве учебного пособия для студентов 

высших учебных заведений, обучающихся 

по направлению подготовки 06.03.01 «Биология» 

(квалификация (степень) «бакалавр») 

и УГС 30.00.00 «Фундаментальная медицина» 

(квалификация (степень) «специалист»)

УДК 57(075.8)
ББК 28.04я73
 
Н58

Нефедова Л.Н.

Применение молекулярных методов исследования в гене
тике : учебное пособие / Л.Н. Нефедова. — Москва : ИНФРА-М, 
2023. — 104 с. — (Высшее образование: Бакалавриат).

ISBN 978-5-16-009872-2 (print)
ISBN 978-5-16-101433-2 (online)

Настоящее пособие знакомит читателя с более чем двадцатью раз
личными молекулярными методами анализа, применяемыми в современной генетике. На примерах продемонстрированы возможности 
применения отдельных методов и их комбинаций для исследования 
организации, полиморфизма, экспрессии и функции генов.

Соответствует требованиям Федерального государственного обра
зовательного стандарта высшего образования последнего поколения. 

Пособие разработано к курсу лекций «Современные методы гене
тики», читаемому автором на биологическом факультете Московского 
государственного университета им. М.В. Ломоносова, и предназначено 
для студентов кафедры генетики, а также может быть рекомендовано 
для студентов, аспирантов и преподавателей других биологических 
и медицинских специальностей. 

УДК 57(075.8) 
ББК 28.04я73

ISBN 978-5-16-009872-2 (print)
ISBN 978-5-16-101433-2 (online)
© Нефедова Л.Н., 2012

Н58

Рекомендовано к опубликованию решением Ученого 

и Учебно-методического советов биологического факультета 

Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

ПРЕДИСЛОВИЕ 

 
К настоящему времени в генетике сложились две стратегии 

генетического анализа: «классическая» – исследование генетической 
обусловленности признака (путь от признака к гену) и «обратная» – 
исследование фенотипических эффектов отдельных генов (путь от гена к 
признаку). Как классическая, так и обратная генетика располагают 
широким 
арсеналом 
методов. 
Основной 
метод 
классического 

генетического анализа со времен Менделя – гибридологический. Этот 
метод сводится к генетическому анализу мутантной особи путем 
постановки специально подобранных скрещиваний. Таким способом 
можно определить число генов, участвующих в формировании 
исследуемого фенотипа; выявить, в каких хромосомах – в половых или 
аутосомах – локализован ген (или гены); характер проявления мутации 
(рецессивный или доминантный) и взаимодействия генов; положение 
гена на карте. Гипотезы о схеме наследования признака (признаков) 
строят на основе статистического и вероятностного анализа данных, 
полученных в расщеплениях. Таким образом, гибридологический метод 
тесно связан с методами математики.  

На математических методах основаны и популяционные методы 

генетики. 
Они 
позволяют 
определять 
частоты 
встречаемости 

различных аллелей и генотипов в популяции, исследовать факторы, 
влияющие на частоты аллелей, прогнозировать количество особей с 
мутантным проявлением действия гена. 

С 
недавнего 
времени 
в 
генетику 
активно 
внедряются 

компьютерные методы, развивается новая область информатики – 
биоинформатика. Биоинформатические методы приобретают все 
большее значение с увеличением количества секвенированных 
геномов. 
Они 
позволяют 
идентифицировать 
гены 
в 

последовательности ДНК, предсказывать белки, кодируемые этими 
генами, выявлять консервативные домены в белках, предсказывать 
биохимические 
и 
физические 
свойства 
белков, 
проводить 

сравнительный анализ генов и их продуктов между различными 
организмами.  

Анализ структуры и сегрегации хромосом позволяет проводить 

цитогенетический 
метод, 
представляющий 
собой 
синтез 

гибридологического 
и 
цитологического 
методов. 
В 
основе 

цитогенетических методов лежит сопоставление генетических явлений 
со структурой и поведением хромосом и их участков. 

Значительная часть генов в геноме кодирует ферменты, 

принимающие 
участие 
в 
обменных 
процессах 
организма. 

Биохимические методы позволяют исследовать функции гена, 
кодирующего фермент, анализируя метаболические пути, в которых 
он задействован. Этот метод применяют как на уровне организма, так 
и на молекулярном уровне. Молекулярный анализ биохимических 
процессов клетки позволил идентифицировать целый ряд ферментов, 
которые стали применять для направленной модификации ДНК в 
искусственных условиях (in vitro). 

Широкие перспективы для решения как фундаментальных, так и 

прикладных 
биологических 
задач 
открывает 
применение 

молекулярных методов анализа, которые позволяют манипулировать с 
наследственным материалом на уровне молекул ДНК. Бурное развитие 
молекулярная генетика претерпела во второй половине двадцатого 
века после открытия структуры ДНК, расшифровки генетического 
кода, открытия механизмов транскрипции и трансляции генов. У 
прокариотических организмов обнаружили явление горизонтального 
переноса генетической информации с помощью транспозонов, 
плазмид и фагов, что позволило применять их в качестве векторов, 
доставляющих гены в реципиентные клетки. Разработана технология 
получения рекомбинантных молекул ДНК, которые образуются в 
результате объединения нескольких фрагментов ДНК, выделенных из 
различных 
источников. 
Появились 
методы 
молекулярной 

гибридизации нуклеиновых кислот и полимеразной цепной реакции 
(ПЦР).  

В настоящем пособии речь пойдет об использовании основных 

молекулярных методов исследования в генетике. На различных 
примерах будут продемонстрированы подходы к анализу генов на 
уровне ДНК, РНК и белка. 

ОБРАБОТКА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ 

ФЕРМЕНТАМИ 

К концу 1960-х – началу 1970-х гг. был открыт ряд уникальных 

ферментов, использующих в качестве субстрата ДНК. Их применение 
существенно облегчило решение задач молекулярной генетики и 
генной 
инженерии. 
Рассмотрим 
ферменты, 
наиболее 
часто 

применяемые в молекулярно-генетических исследованиях. 

РЕСТРИКТАЗЫ 

Благодаря высокой специфичности и простоте в использовании 

эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы) стали одним из самых 
популярных инструментов молекулярной генетики и генетической 
инженерии. В середине 1950-х гг. было обнаружено явление 
«хозяйской специфичности», при которой бактериальная клетка 
способна специфично расщеплять фаговую, но не свою ДНК. 
«Хозяйскую 
специфичность» 
определяет 
система 
рестрикции
модификации, в которой участвуют два фермента бактериальной 
клетки 
– 
рестриктаза 
и 
метилаза. 
Рестриктаза 
определяет 

специфическую нуклеотидную последовательность ДНК бактериофага 
и расщепляет ее в определенном сайте: гидролизует фосфодиэфирную 
связь между двумя соседними нуклеотидами. Метилаза узнает ту же 
самую последовательность нуклеотидов в ДНК клетки-хозяина, 
модифицирует ее путем метилирования определенных нуклеотидов и 
таким образом защищает от ферментативного расщепления своей 
собственной 
эндонуклеазой. 
Если 
ДНК 
бактериофагов, 

инфицирующих 
клетку, 
не 
модифицирована, 
то 
она 
будет 

гидролизована рестриктазами бактериальной клетки.  

К настоящему времени описано более 3500 систем рестрикции
модификации у разных микроорганизмов. Название фермента 
рестрикции складывается из первой буквы рода бактерии и двух 
первых букв вида. Например, Eco – Escherichia coli, Hin – Haemophilus 
influenzae, Sma – Serratia marcescens. Обычно штамм имеет несколько 
систем 
рестрикции-модификации. 
Поэтому 
в 
название 
могут 

добавляться числовые и буквенные обозначения, характеризующие 
данный штамм. Существует несколько типов систем рестрикциимодификации. 
Из 
них 
широкое 
применение 
в 
молекулярно
генетическом анализе нашли рестриктазы типа II. Они расщепляют 
ДНК непосредственно в сайте узнавания. Более половины рестриктаз 
типа 
II 
узнают 
палиндромы 
(одинаковые 
антипараллельные 

последовательности нуклеотидов на обеих нитях ДНК) или 
несовершенные палиндромы.  

Рестриктазы могут расщеплять ДНК, оставляя выступающие 

однонитевые 5'- или 3'-концевые последовательности (такие концевые 
последовательности называют липкими): 

 
5’-…GAATTC…-3’  EcoRI 
5’-…G        AATTC…-3’ 

3’-…CTTAAG…-5’       
3’-…CTTAA        G…-5’ , 

 
5’-…GCATGC…-3’  SphI 
5’-…GCATG        C…-3’ 

3’-…CGTACG…-5’       
3’-…C        GTACG…-5’ , 

 
либо оставляя ровные (тупые) концевые последовательности: 
 
5’-…CCCGGG…-3’  SmaI 
5’-…CCC        GGG…-3’ 

3’-…GGGCCC…-5’       
3’-…GGG        CCC…-5’ . 

ДНК-ЛИГАЗЫ 

ДНК-лигаза восстанавливает фосфодиэфирную связь между двумя 

соседними нуклеотидами. С помощью ДНК-лигаз можно объединять 
либо выступающие одноцепочечные концевые последовательности 
при условии, что они полностью комплементарны, либо ровные 
концевые последовательности двух фрагментов ДНК. На практике 
обычно применяют две ДНК-лигазы – E. coli и фага Т4. Последнюю 
обычно выделяют в рекомбинантной форме из клеток E. coli, несущих 
плазмидную конструкцию для экспрессии гена лигазы фага Т4. ДНКлигазы различаются по потребности к кофакторам: ДНК-лигазе E. coli 
необходим никотинамидадениндинуклеотид (НАД), а ДНК-лигазе Т4 – 
аденозинтрифосфат (АТФ). Кроме того, они обладают разной 
способностью лигировать липкие и тупые концы ДНК: ДНК-лигаза 
E. coli может воссоединять фрагменты ДНК только с липкими 
концами, в то время как ДНК-лигаза Т4 способна осуществлять 
реакцию соединения фрагментов ДНК как с липкими, так и с тупыми 
концами. Именно поэтому в генно-инженерных экспериментах 
предпочитают 
использовать 
ДНК-лигазу 
фага 
Т4 
как 
более 

универсальный фермент. 

Объединение 
«липких» 
концевых 
последовательностей, 

образованных одной рестриктазой (например, SphI), приводит к 
восстановлению сайта рестрикции:  

5’-…G     +  AATTC…-3’  ДНК-лигаза Т4 
5’-…GAATTC…-3’   

3’-…CTTAA        G…-5’      АТФ       
3’-…CTTAAG…-5’ .   

Некоторые рестриктазы, например BamHI (G|GATCC) и BclI 

(T|GATCA), 
образуют 
одинаковые 
выступающие 
концевые 

последовательности. 
Однако 
если 
объединять 
фрагменты, 

образованные такими рестриктазами, получится гибридный сайт, 
который не будет узнаваться ни BamHI, ни BclI: 

 
     BamHI       BclI 
5’-…G     +  GATCA…-3’ ДНК-лигаза Т4 
5’-…GGATCA…-3’   

3’-…CCTAG        T…-5’     АТФ       
3’-…CCTAGT…-5’  . 

 
 
 
 
 
 
 Гибридный сайт 

 
Тупые концевые последовательности можно объединять вне 

зависимости от того, какой рестриктазой они образованы. При этом, 
как и в случае липких концевых последовательностей, сайты 
рестрикции могут восстанавливаться или становиться гибридными.  

ДНК- И РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ 

Основное 
свойство 
ДНК-полимеразы 
– 
способность 
вести 

матричный 
синтез 
ДНК 
в 
направлении 
5'→3' 
с 
праймера 

(олигонуклеотидной затравки) со свободной 3'-ОН-группой. Наиболее 
широкое применение в молекулярно-генетическом анализе нашли 
ДНК-полимераза I E. coli, продукт ее ферментативного расщепления – 
фрагмент Кленова, термостабильные полимеразы и РНК-зависимая 
ДНК-полимераза (обратная транскриптаза). 

ДНК-полимераза I (ДНКП I) E. сoli имеет три активности: 5'→3' 

полимеразную, 5'→3' и 3'→5' экзонуклеазные. ДНКП I может 
связываться с одноцепочечной ДНК, с двухцепочечной ДНК в местах 
одноцепочечных разрывов, а также с концами двухцепочечных 
молекул ДНК.  

Полимеразная активность 5'→3' на одноцепочечной матрице 

обеспечивает 
присоединение 
нуклеотидов 
к 
3'-ОН-концу 

комплементарной нити-затравки. Реакция полимеризации происходит 
в присутствии дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ) и ионов 
Mg2+: 

 
5’–…GAATG–3’  
     ДНКП I 
5’–…GAATGGCAATGA–3’→ 

3’–…CTTACCGTTACTGC…–5’  дНТФ,Mg2+ 
3’–…CTTACCGTTACTGC…–5’. 

 
3'→5' 
экзонуклеазная 
активность 
приводит 
к 
отщеплению 

нуклеотидов с 3'-концов одно- и двухцепочечных молекул ДНК. 
Происходит это только в неспаренных участках ДНК. Одномоментно 
может отщепляться только один нуклеотид: 

 
 
5’–…GAATA–3’  
     ДНКП I 
5’–…GAAT–3’← 

3’–…CTTACCGTTACTGC…–5’   Mg2+ 
3’–…CTTACCGTTACTGC…–5’. 

5’–…GAATGGCAATGA–3’      ДНКП I 
5’–…GAATGGCA–3’← 

3’–…CTTACCGT–5’           Mg2+ 
3’–…CTTACCGT–5’  . 

 
Экзонуклеазная активность 5'→3' приводит к отщеплению 

нуклеотидов со свободных 5'-концов двухцепочечных молекул ДНК. 
Происходит это только в спаренных участках ДНК. При этом ДНКП I 
может одномоментно отщеплять до 10 нуклеотидов: 

 
   5’–ATGGCAATGA…–3’    ДНКП I 
     →5’–GCAATGA…–3’ 

3’–…CTTACCGTTACT…–5’      Mg2+ 
 3’–…CTTACCGTTACT…–5’. 

 
Фрагмент Кленова ДНКП I представляет собой ДНКП I, 

лишенную экзонуклеазного домена 5'→3'. Отсутствие экзонуклеазной 
активности 5'→3' позволяет использовать фермент для «затупления» 
выступающих 5'-концевых нуклеотидов двухцепочечной ДНК путем 
достраивания второй нити в направлении 5'→3' в присутствии дНТФ и 
ионов магния или для «затупления» выступающих 3'-концевых 
нуклеотидов двунитевой ДНК путем их гидролиза. 

Открытие термостабильных ДНК-полимераз, выделенных из 

термофильных бактерий, способствовало разработке метода ПЦР и его 
разнообразных приложений, широко используемых в молекулярногенетическом анализе. Наибольшее распространение получила Taqполимераза. В отличие от ДНКП I, Taq-полимераза не обладает 3'→5' 
экзонуклеазной активностью, что приводит к появлению ошибок в 
копируемой ею последовательности. Поэтому, если необходимо 
провести амплификацию фрагмента ДНК и при этом получить 
амплификат с наименьшим количеством ошибок, используют 
термостабильные полимеразы, обладающие 3'→5'-экзонуклеазной 
(корректирующей) активностью, например, Pfu-полимеразу. 

Терминальная 
дезоксирибонуклеотидилтрансфераза 

(терминальная 
трансфераза) 
катализирует 
последовательное 

присоединение нуклеотидов к 3'-концам ДНК в присутствии в 
качестве кофактора ионов Mg2+. На двухцепочечной ДНК с 
выступающими 3'-концами реакция проходит наиболее эффективно, 
однако она может идти с небольшой эффективностью даже в том 
случае, когда фрагмент имеет тупые или выступающие 5'-концевые 
последовательности. 
Для 
реакции 
необходимо 
присутствие 
в 

реакционной смеси ионов Со2+. 

Поли(А)-полимераза 
– 
фермент 
E. сoli, 
катализирующий 

присоединение к свободному 3'-концу молекул мРНК поли(А)последовательностей. 
Этот 
фермент 
требует 
присутствия 
в 

реакционной смеси АТФ и кофакторов – ионов Mg2+ и Mn2+. 

ДНК-зависимая РНК-полимераза – фермент, осуществляющий 

синтез РНК на матрице ДНК. Обычно для синтеза РНК in vitro 
используют рекомбинантные формы РНК-полимераз фагов SP6, Т3 
или Т7, выделяемые из клеток E. сoli. Для синтеза РНК-полимеразе 

необходимо 
наличие 
на 
матрице 
ДНК 
промотора 

соответствующего фага. 

РНК-зависимая 
ДНК-полимераза 
(обратная 
транскриптаза), 

выделяемая 
из 
ретровирусов, 
позволяет 
осуществлять 
синтез 

комплементарной ДНК (кДНК) на мРНК, то есть получать ДНК-копию 
мРНК (рис. 1). кДНК отличается большей стабильностью, чем РНК, 
кроме того, ее можно амплифицировать в ПЦР. Для синтеза кДНК 
обратной транскриптазе необходимы затравка, ионы Mg2+ и дНТФ. В 
качестве затравки может выступать специфичный олигонуклеотидный 
праймер, комплементарный определенному участку мРНК, или 
неспецифичный «случайный» праймер (смесь олигонуклеотидов 
длиной 6−10 н. со случайной последовательностью нуклеотидов), 
который будет отжигаться на РНК неспецифично. И тот, и другой 
праймер 
используют 
для 
получения 
кДНК, 
соответствующих 

фрагментам мРНК. Для получения небольших полноразмерных кДНК 
или 3'-концевых областей кДНК эукариот используют олиго(дТ)праймер длиной 12−20 н., комплементарный поли(А)-«хвосту» мРНК. 
Этот же праймер можно применить для получения полноразмерной 
кДНК прокариот, мРНК которых необходимо предварительно 
полиаденилировать на 3'-конце с помощью поли(А)-полимеразы. 

 
 

 

 

Рисунок 1. Схема вариантов синтеза кДНК 

КИНАЗЫ И ФОСФАТАЗЫ 

Если фрагмент нуклеиновой кислоты получен путем гидролиза, 

например, в реакции рестрикции, на его 5'-концах присутствуют 
фосфатные группы. Свободные ОН-группы на 5'-концах нуклеиновых 
кислот возникают либо вследствие реакций их синтеза in vitro с 
синтетической затравки-праймера, например, ПЦР или обратной 
транскрипции, либо в результате их дефосфорилирования. Наличие на 
5'-конце ОН-группы препятствует реакции лигирования. 

Полинуклеотидкиназа (ПНК) – фермент, катализирующий перенос 

концевой гамма-фосфатной группы АТФ на 5'-ОН группу ДНК или 
РНК. С помощью ПНК можно не только проводить фосфорилирование 
5'-концов нуклеиновых кислот, но и вносить на их 5'-концы 
модифицированные фосфаты (Р*), например содержащие изотоп 
фосфора 32Р. Чаще всего для фосфорилирования нуклеиновых кислот 
используют ПНК фага Т4: 

 
5’–ОН-GAATGGCA…–3’   ПНК, Mg2+ 
 5’–Р*-GAATGGCA…–3’ 

 3’–ОН-TTACCGT…–5’ АТФ (А-Р-Р-Р*)    3’–ОН-TTACCGT…–5’      . 
 
ПНК фага Т4, помимо реакции фосфорилирования свободных 5'
ОН групп, способна осуществлять обмен концевых 5'-фосфатов между 
5'-концом нуклеиновой кислоты, АДФ и АТФ. Обменная реакция идет 
менее эффективно, чем прямая, и требует присутствия в реакционной 
смеси избытка АДФ, который будет «забирать» с 5'-концов 
нуклеиновых 
кислот 
фосфатные 
группы 
и 
освобождать 

гидроксильные: 

 

5’–Р-GAATGGCA…–3’ 
ПНК, Mg2+ 
5’–Р*-GAATGGCA…–3’ 

3’–ОН-TTACCGT…–5’ АДФ (избыток)        3’–ОН-TTACCGT…– 5’ +АТФ+АДФ. 
      
           АТФ (А-Р-Р-Р*) 

 
 

 
Чтобы избежать обменной реакции, можно подготовить 5'-концы 

нуклеиновых кислот к фосфорилированию путем удаления 5'фосфатных групп с помощью щелочной фосфатазы, являющейся по 
своей каталитической активности антагонистом ПНК. 

 
 

Помимо 
рассмотренных 
выше, 
в 
молекулярно-генетических 

экспериментах используют много других ферментов нуклеинового 
обмена. Мы рассмотрели лишь основные ферменты, о применении 
которых речь пойдет далее.