Применение молекулярных методов исследования в генетике

Москва

ИНФРА-М

2022

ПРИМЕНЕНИЕ

МОЛЕКУЛЯРНЫХ

МЕТОДОВ

ИССЛЕДОВАНИЯ

В ГЕНЕТИКЕ

УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ

Л.Н. НЕФЕДОВА

Рекомендовано

в качестве учебного пособия для студентов 

высших учебных заведений, обучающихся 

по направлению подготовки 06.03.01 «Биология» 

(квалификация (степень) «бакалавр») 

и УГС 30.00.00 «Фундаментальная медицина» 

(квалификация (степень) «специалист»)

УДК 57(075.8)
ББК 28.04я73
 
Н58

Нефедова Л.Н.

Применение молекулярных методов исследования в гене
тике : учебное пособие / Л.Н. Нефедова. — Москва : ИНФРА-М, 
2022. — 104 с. — (Высшее образование: Бакалавриат).

ISBN 978-5-16-009872-2 (print)
ISBN 978-5-16-101433-2 (online)

Настоящее пособие знакомит читателя с более чем двадцатью раз
личными молекулярными методами анализа, применяемыми в современной генетике. На примерах продемонстрированы возможности 
применения отдельных методов и их комбинаций для исследования 
организации, полиморфизма, экспрессии и функции генов.

Соответствует требованиям Федерального государственного обра
зовательного стандарта высшего образования последнего поколения. 

Пособие разработано к курсу лекций «Современные методы гене
тики», читаемому автором на биологическом факультете Московского 
государственного университета им. М.В. Ломоносова, и предназначено 
для студентов кафедры генетики, а также может быть рекомендовано 
для студентов, аспирантов и преподавателей других биологических 
и медицинских специальностей. 

УДК 57(075.8) 
ББК 28.04я73

ISBN 978-5-16-009872-2 (print)
ISBN 978-5-16-101433-2 (online)
© Нефедова Л.Н., 2012

Н58

Рекомендовано к опубликованию решением Ученого 

и Учебно-методического советов биологического факультета 

Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

ПРЕДИСЛОВИЕ

К
настоящему
времени
в
генетике
сложились
две
стратегии

генетического анализа: «классическая» – исследование генетической
обусловленности признака (путь от признака к гену) и «обратная» – 
исследование фенотипических эффектов отдельных генов (путь от гена к
признаку). Как классическая, так и обратная генетика располагают
широким
арсеналом
методов. 
Основной
метод
классического

генетического анализа со времен Менделя – гибридологический. Этот
метод сводится к генетическому анализу мутантной особи путем
постановки специально подобранных скрещиваний. Таким способом
можно
определить
число
генов, участвующих
в
формировании

исследуемого фенотипа; выявить, в каких хромосомах – в половых или
аутосомах – локализован ген (или гены); характер проявления мутации
(рецессивный или доминантный) и взаимодействия генов; положение
гена на карте. Гипотезы о схеме наследования признака (признаков) 
строят на основе статистического и вероятностного анализа данных, 
полученных в расщеплениях. Таким образом, гибридологический метод
тесно связан с методами математики.  

На математических методах основаны и популяционные методы

генетики. 
Они
позволяют
определять
частоты
встречаемости

различных аллелей и генотипов в популяции, исследовать факторы, 
влияющие на частоты аллелей, прогнозировать количество особей с
мутантным проявлением действия гена. 

С
недавнего
времени
в
генетику
активно
внедряются

компьютерные методы, развивается новая область информатики – 
биоинформатика. Биоинформатические
методы
приобретают
все

большее
значение
с
увеличением
количества
секвенированных

геномов. 
Они
позволяют
идентифицировать
гены
в

последовательности ДНК, предсказывать белки, кодируемые этими
генами, выявлять консервативные домены в белках, предсказывать
биохимические
и
физические
свойства
белков, 
проводить

сравнительный анализ генов и их продуктов между различными
организмами.  

Анализ структуры и сегрегации хромосом позволяет проводить

цитогенетический
метод, 
представляющий
собой
синтез

гибридологического
и
цитологического
методов. 
В
основе

цитогенетических методов лежит сопоставление генетических явлений
со структурой и поведением хромосом и их участков. 

Значительная
часть
генов
в
геноме
кодирует
ферменты, 

принимающие
участие
в
обменных
процессах
организма. 

Биохимические
методы
позволяют
исследовать
функции
гена, 

кодирующего фермент, анализируя метаболические пути, в которых
он задействован. Этот метод применяют как на уровне организма, так
и на молекулярном уровне. Молекулярный анализ биохимических
процессов клетки позволил идентифицировать целый ряд ферментов, 
которые стали применять для направленной модификации ДНК в
искусственных условиях (in vitro). 

Широкие перспективы для решения как фундаментальных, так и

прикладных
биологических
задач
открывает
применение

молекулярных методов анализа, которые позволяют манипулировать с
наследственным материалом на уровне молекул ДНК. Бурное развитие
молекулярная генетика претерпела во второй половине двадцатого
века после открытия структуры ДНК, расшифровки генетического
кода, открытия механизмов транскрипции и трансляции генов. У
прокариотических организмов обнаружили явление горизонтального
переноса
генетической
информации
с
помощью
транспозонов, 

плазмид и фагов, что позволило применять их в качестве векторов, 
доставляющих гены в реципиентные клетки. Разработана технология
получения рекомбинантных молекул ДНК, которые образуются в
результате объединения нескольких фрагментов ДНК, выделенных из
различных
источников. 
Появились
методы
молекулярной

гибридизации нуклеиновых кислот и полимеразной цепной реакции
(ПЦР).  

В настоящем пособии речь пойдет об использовании основных

молекулярных методов исследования в генетике. На различных
примерах будут продемонстрированы подходы к анализу генов на
уровне ДНК, РНК и белка. 

ОБРАБОТКА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

ФЕРМЕНТАМИ

К концу 1960-х – началу 1970-х гг. был открыт ряд уникальных

ферментов, использующих в качестве субстрата ДНК. Их применение
существенно облегчило решение задач молекулярной генетики и
генной
инженерии. 
Рассмотрим
ферменты, 
наиболее
часто

применяемые в молекулярно-генетических исследованиях. 

РЕСТРИКТАЗЫ

Благодаря высокой специфичности и простоте в использовании

эндонуклеазы
рестрикции (рестриктазы) стали
одним
из
самых

популярных инструментов молекулярной генетики и генетической
инженерии. В
середине 1950-х
гг. было
обнаружено
явление

«хозяйской
специфичности», при
которой
бактериальная
клетка

способна
специфично
расщеплять
фаговую, но
не
свою
ДНК. 

«Хозяйскую
специфичность» 
определяет
система
рестрикции
модификации, в которой участвуют два фермента бактериальной
клетки 
– 
рестриктаза
и
метилаза. 
Рестриктаза
определяет

специфическую нуклеотидную последовательность ДНК бактериофага
и расщепляет ее в определенном сайте: гидролизует фосфодиэфирную
связь между двумя соседними нуклеотидами. Метилаза узнает ту же
самую
последовательность
нуклеотидов
в
ДНК
клетки-хозяина, 

модифицирует ее путем метилирования определенных нуклеотидов и
таким образом защищает от ферментативного расщепления своей
собственной
эндонуклеазой. 
Если
ДНК
бактериофагов, 

инфицирующих
клетку, 
не
модифицирована, 
то
она
будет

гидролизована рестриктазами бактериальной клетки.  

К настоящему времени описано более 3500 систем рестрикции
модификации
у
разных
микроорганизмов. Название
фермента

рестрикции складывается из первой буквы рода бактерии и двух
первых букв вида. Например, Eco – Escherichia coli, Hin – Haemophilus
influenzae, Sma – Serratia marcescens. Обычно штамм имеет несколько
систем
рестрикции-модификации. 
Поэтому
в
название
могут

добавляться числовые и буквенные обозначения, характеризующие
данный штамм. Существует несколько типов систем рестрикциимодификации. 
Из
них
широкое
применение
в
молекулярно
генетическом анализе нашли рестриктазы типа II. Они расщепляют
ДНК непосредственно в сайте узнавания. Более половины рестриктаз
типа 
II 
узнают
палиндромы 
(одинаковые
антипараллельные

последовательности нуклеотидов на обеих нитях ДНК) или
несовершенные палиндромы.  

Рестриктазы
могут
расщеплять
ДНК, оставляя
выступающие

однонитевые 5'- или 3'-концевые последовательности (такие концевые
последовательности называют липкими): 

5’-…GAATTC…-3’  EcoRI 
5’-…G        AATTC…-3’ 

3’-…CTTAAG…-5’       
3’-…CTTAA        G…-5’ , 

5’-…GCATGC…-3’  SphI 
5’-…GCATG        C…-3’ 

3’-…CGTACG…-5’       
3’-…C        GTACG…-5’ , 

либо оставляя ровные (тупые) концевые последовательности: 

5’-…CCCGGG…-3’  SmaI 
5’-…CCC        GGG…-3’ 

3’-…GGGCCC…-5’       
3’-…GGG        CCC…-5’ . 

ДНК-ЛИГАЗЫ

ДНК-лигаза восстанавливает фосфодиэфирную связь между двумя

соседними нуклеотидами. С помощью ДНК-лигаз можно объединять
либо выступающие одноцепочечные концевые последовательности
при условии, что они полностью комплементарны, либо ровные
концевые последовательности двух фрагментов ДНК. На практике
обычно применяют две ДНК-лигазы – E. coli и фага Т4. Последнюю
обычно выделяют в рекомбинантной форме из клеток E. coli, несущих
плазмидную конструкцию для экспрессии гена лигазы фага Т4. ДНКлигазы различаются по потребности к кофакторам: ДНК-лигазе E. coli
необходим никотинамидадениндинуклеотид (НАД), а ДНК-лигазе Т4 – 
аденозинтрифосфат (АТФ). Кроме
того, они
обладают
разной

способностью лигировать липкие и тупые концы ДНК: ДНК-лигаза
E. coli может воссоединять фрагменты ДНК только с липкими
концами, в то время как ДНК-лигаза Т4 способна осуществлять
реакцию соединения фрагментов ДНК как с липкими, так и с тупыми
концами. Именно
поэтому
в
генно-инженерных
экспериментах

предпочитают
использовать
ДНК-лигазу
фага
Т4 
как
более

универсальный фермент. 

Объединение 
«липких» 
концевых
последовательностей, 

образованных одной рестриктазой (например, SphI), приводит к
восстановлению сайта рестрикции:  

5’-…G     +  AATTC…-3’  ДНК-лигаза Т4 
5’-…GAATTC…-3’   

3’-…CTTAA        G…-5’      АТФ       
3’-…CTTAAG…-5’ .   

Некоторые рестриктазы, например BamHI (G|GATCC) и BclI 

(T|GATCA), 
образуют
одинаковые
выступающие
концевые

последовательности. 
Однако
если
объединять
фрагменты, 

образованные такими рестриктазами, получится гибридный сайт, 
который не будет узнаваться ни BamHI, ни BclI: 

BamHI       BclI 

5’-…G     +  GATCA…-3’ ДНК-лигаза Т4 
5’-…GGATCA…-3’   

3’-…CCTAG        T…-5’     АТФ       
3’-…CCTAGT…-5’  .
Гибридный сайт

Тупые
концевые
последовательности
можно
объединять
вне

зависимости от того, какой рестриктазой они образованы. При этом, 
как
и
в
случае
липких
концевых
последовательностей, сайты

рестрикции могут восстанавливаться или становиться гибридными.  

ДНК- И РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

Основное
свойство
ДНК-полимеразы 
– 
способность
вести

матричный
синтез
ДНК
в
направлении 
5'→3' 
с
праймера

(олигонуклеотидной затравки) со свободной 3'-ОН-группой. Наиболее
широкое применение в молекулярно-генетическом анализе нашли
ДНК-полимераза I E. coli, продукт ее ферментативного расщепления – 
фрагмент Кленова, термостабильные полимеразы и РНК-зависимая
ДНК-полимераза (обратная транскриптаза). 

ДНК-полимераза I (ДНКП I) E. сoli имеет три активности: 5'→3' 

полимеразную, 5'→3' и 3'→5' экзонуклеазные. ДНКП I может
связываться с одноцепочечной ДНК, с двухцепочечной ДНК в местах
одноцепочечных
разрывов, а также
с концами двухцепочечных

молекул ДНК.  

Полимеразная
активность 5'→3' на
одноцепочечной
матрице

обеспечивает
присоединение
нуклеотидов
к 
3'-ОН-концу

комплементарной нити-затравки. Реакция полимеризации происходит
в присутствии дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (дНТФ) и ионов
Mg2+: 

5’–…GAATG–3’ 
ДНКП I 
5’–…GAATGGCAATGA–3’→

3’–…CTTACCGTTACTGC…–5’  дНТФ,Mg2+ 
3’–…CTTACCGTTACTGC…–5’. 

3'→5' 
экзонуклеазная
активность
приводит
к
отщеплению

нуклеотидов с 3'-концов одно- и двухцепочечных молекул ДНК. 
Происходит это только в неспаренных участках ДНК. Одномоментно
может отщепляться только один нуклеотид: 

5’–…GAATA–3’ 
ДНКП I 
5’–…GAAT–3’←

3’–…CTTACCGTTACTGC…–5’   Mg2+ 
3’–…CTTACCGTTACTGC…–5’. 

5’–…GAATGGCAATGA–3’ 
ДНКП I 
5’–…GAATGGCA–3’←

3’–…CTTACCGT–5’           Mg2+ 
3’–…CTTACCGT–5’  . 

Экзонуклеазная
активность 5'→3' приводит
к
отщеплению

нуклеотидов со свободных 5'-концов двухцепочечных молекул ДНК. 
Происходит это только в спаренных участках ДНК. При этом ДНКП I 
может одномоментно отщеплять до 10 нуклеотидов: 

   5’–ATGGCAATGA…–3’    ДНКП I 
     →5’–GCAATGA…–3’ 

3’–…CTTACCGTTACT…–5’      Mg2+
3’–…CTTACCGTTACT…–5’. 

Фрагмент
Кленова
ДНКП I
представляет
собой
ДНКП I, 

лишенную экзонуклеазного домена 5'→3'. Отсутствие экзонуклеазной
активности 5'→3' позволяет использовать фермент для «затупления» 
выступающих 5'-концевых нуклеотидов двухцепочечной ДНК путем
достраивания второй нити в направлении 5'→3' в присутствии дНТФ и
ионов
магния или
для «затупления» выступающих 3'-концевых

нуклеотидов двунитевой ДНК путем их гидролиза. 

Открытие термостабильных ДНК-полимераз, выделенных из

термофильных бактерий, способствовало разработке метода ПЦР и его
разнообразных приложений, широко используемых в молекулярногенетическом анализе. Наибольшее распространение получила Taqполимераза. В отличие от ДНКП I, Taq-полимераза не обладает 3'→5' 
экзонуклеазной активностью, что приводит к появлению ошибок в
копируемой
ею
последовательности. Поэтому, если
необходимо

провести амплификацию фрагмента ДНК и при этом получить
амплификат
с
наименьшим
количеством
ошибок, используют

термостабильные
полимеразы, обладающие 3'→5'-экзонуклеазной

(корректирующей) активностью, например, Pfu-полимеразу. 

Терминальная
дезоксирибонуклеотидилтрансфераза

(терминальная
трансфераза) 
катализирует
последовательное

присоединение нуклеотидов к 3'-концам ДНК в присутствии в
качестве
кофактора
ионов Mg2+. На
двухцепочечной
ДНК
с

выступающими 3'-концами реакция проходит наиболее эффективно, 
однако она может идти с небольшой эффективностью даже в том
случае, когда фрагмент имеет тупые или выступающие 5'-концевые
последовательности. 
Для
реакции
необходимо
присутствие
в

реакционной смеси ионов Со2+. 

Поли(А)-полимераза 
– 
фермент
E. сoli, 
катализирующий

присоединение
к свободному 3'-концу молекул
мРНК
поли(А)
последовательностей. 
Этот
фермент
требует
присутствия
в

реакционной смеси АТФ и кофакторов – ионов Mg2+ и Mn2+. 

ДНК-зависимая РНК-полимераза – фермент, осуществляющий

синтез РНК на матрице ДНК. Обычно для синтеза РНК in vitro
используют рекомбинантные формы РНК-полимераз фагов SP6, Т3 
или Т7, выделяемые из клеток E. сoli. Для синтеза РНК-полимеразе

необходимо
наличие
на
матрице
ДНК
промотора

соответствующего фага.

РНК-зависимая
ДНК-полимераза 
(обратная
транскриптаза), 

выделяемая
из
ретровирусов, 
позволяет
осуществлять
синтез

комплементарной ДНК (кДНК) на мРНК, то есть получать ДНК-копию
мРНК (рис. 1). кДНК отличается большей стабильностью, чем РНК, 
кроме того, ее можно амплифицировать в ПЦР. Для синтеза кДНК
обратной транскриптазе необходимы затравка, ионы Mg2+ и дНТФ. В
качестве затравки может выступать специфичный олигонуклеотидный
праймер, комплементарный
определенному
участку
мРНК, или

неспецифичный «случайный» праймер (смесь
олигонуклеотидов

длиной 6−10 н. со случайной последовательностью нуклеотидов), 
который будет отжигаться на РНК неспецифично. И тот, и другой
праймер
используют
для
получения
кДНК, 
соответствующих

фрагментам мРНК. Для получения небольших полноразмерных кДНК
или 3'-концевых областей кДНК эукариот используют олиго(дТ)праймер длиной 12−20 н., комплементарный поли(А)-«хвосту» мРНК. 
Этот же праймер можно применить для получения полноразмерной
кДНК
прокариот, мРНК
которых
необходимо
предварительно

полиаденилировать на 3'-конце с помощью поли(А)-полимеразы. 

Рисунок 1. Схема вариантов синтеза кДНК

КИНАЗЫ И ФОСФАТАЗЫ

Если фрагмент нуклеиновой кислоты получен путем гидролиза, 

например, в реакции рестрикции, на его 5'-концах присутствуют
фосфатные группы. Свободные ОН-группы на 5'-концах нуклеиновых
кислот возникают либо вследствие реакций их синтеза in vitro с
синтетической затравки-праймера, например, ПЦР или обратной
транскрипции, либо в результате их дефосфорилирования. Наличие на
5'-конце ОН-группы препятствует реакции лигирования. 

Полинуклеотидкиназа (ПНК) – фермент, катализирующий перенос

концевой гамма-фосфатной группы АТФ на 5'-ОН группу ДНК или
РНК. С помощью ПНК можно не только проводить фосфорилирование
5'-концов
нуклеиновых
кислот, но
и
вносить
на
их 5'-концы

модифицированные фосфаты (Р*), например содержащие изотоп
фосфора 32Р. Чаще всего для фосфорилирования нуклеиновых кислот
используют ПНК фага Т4: 

5’–ОН-GAATGGCA…–3’   ПНК, Mg2+ 
 5’–Р*-GAATGGCA…–3’ 

 3’–ОН-TTACCGT…–5’ АТФ (А-Р-Р-Р*)    3’–ОН-TTACCGT…–5’      . 

ПНК фага Т4, помимо реакции фосфорилирования свободных 5'
ОН групп, способна осуществлять обмен концевых 5'-фосфатов между
5'-концом нуклеиновой кислоты, АДФ и АТФ. Обменная реакция идет
менее эффективно, чем прямая, и требует присутствия в реакционной
смеси
избытка
АДФ, который
будет «забирать» с 5'-концов

нуклеиновых
кислот
фосфатные
группы
и
освобождать

гидроксильные: 

5’–Р-GAATGGCA…–3’ 
ПНК, Mg2+ 
5’–Р*-GAATGGCA…–3’ 

3’–ОН-TTACCGT…–5’ АДФ (избыток)       3’–ОН-TTACCGT…– 5’ +АТФ+АДФ. 

АТФ (А-Р-Р-Р*)

Чтобы избежать обменной реакции, можно подготовить 5'-концы

нуклеиновых
кислот
к
фосфорилированию
путем
удаления 5'
фосфатных групп с помощью щелочной фосфатазы, являющейся по
своей каталитической активности антагонистом ПНК. 

Помимо
рассмотренных
выше, 
в
молекулярно-генетических

экспериментах используют много других ферментов нуклеинового
обмена. Мы рассмотрели лишь основные ферменты, о применении
которых речь пойдет далее.