Взаимодействие антигенов с антителами и с иммунокомпетентными клетками (количественные аспекты)

Взаимодействие антигенов 

с антителами 

и с иммунокомпетентными 

клетками

(количественные аспекты)

МОНОГРАФИЯ

Москва 

ИНФРА-М 

2022

Н.Г. ТИТОВА

ISBN 978-5-16-015943-0 (print)
ISBN 978-5-16-108335-2 (online)
© Титова Н.Г., 2019

УДК 578(075.4)
ББК 28.074
 
Т45

Титова Н.Г.

Т45 
 
Взаимодействие антигенов с антителами и с иммунокомпетентными 

клетками (количественные аспекты) : монография / Н.Г. Титова. — 
Москва : ИНФРА-М, 2022. — 186 с. — (Научная мысль).

ISBN 978-5-16-015943-0 (print)
ISBN 978-5-16-108335-2 (online)

В монографии представлен новый взгляд на оценку наблюдаемых в экспе
риментах явлений в вирусологической и иммунологической практике с учетом 
дозовой неоднородности взаимодействующих компонентов.

В первой главе рассматривается процесс нейтрализации дискретных час
тиц (одиночных вирионов и их конгломератов). Данный процесс изучен в соответствии с теорией Клотца, учитывающей неоднородность частиц по размеру  
в белковых системах. Определена фактическая сущность ряда явлений, обычно расцениваемых как взаимодействие вируса с антителами большей или 
меньшей авидности. Во второй главе впервые представлены экспериментальные доказательства того, что в иммуноферментном анализе взаимодействие 
антигена со специфическими антителами соответствует известным закономерностям физико-химической адсорбции. На основе этого создана модель 
взаимодействия компонентов при разных количественных соотношениях.  
В третьей главе описана новая концептуальная модель иммунного ответа 
лимфоцитов, учитывающая дозовую неоднородность воздействия и свойства 
антигена. По-новому трактуются процессы, происходящие в герминальных 
центрах.

Предназначена для специалистов в области вирусологии и иммунологии, 

аспирантов и студентов высших учебных заведений биологического и медицинского профилей.

УДК 578(075.4) 

ББК  28.074

Список сокращений

CHO – клетки яичников сирийского хомяка
CMV – цитомегаловирус
ConA – конканавалин А
DLM – минимальная летальная доза
Lf – флокулирующая единица
MHC — главный комплекс гистосовместимости
MTOC – микротубулярный центр Т-клеток
OD – оптическая плотность
PFC – пятнообразующие клетки
PPD – очищенные дериваты туберкулина
Th – Т-хелперы
UA – универсальные рабочие единицы
VSV – вирус везикулярного стоматита
Аг – антиген
АОК – антителообразующая клетка
Ат – антитело
БОЕ – бляшкообразующие единицы
ВИЧ — вирус иммунодефицита человека
ДАТ – дифтерийный анатоксин
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ДТ – дифтерийный токсин
ИК — иммунные комплексы
ИФА – иммуноферментный анализ
КББ – карбонат-бикарбонатный буферный раствор
ЛПС – липополисахарид
МЕ – международные единицы
МкАт — моноклональные антитела
МЦТД – минимальная цитотоксическая доза
ПДС – противодифтерийная сыворотка лошади
ПкАт — поликлональные антитела
ПХ — пероксидаза хрена
РНК — рибонуклеиновая кислота
СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита
Т-10 – антиген Т-клеток

ВВЕДЕНИЕ

Взаимодействию антигенов и антител посвящено много работ  

в различных областях иммунологии. Антитела (в том числе и моноклональные) все чаще становятся инструментом исследования при 
определении структуры антигенов, их эпитопной специфичности. 
При этом наряду с качественными методами часто применяют количественные, например, метод оценки взаимодействия антигенов 
и антител в иммуноферментном анализе (ИФА), а также в реакциях 
конкурентного связывания антител. Кинетику взаимодействия ан-
тигенов и антител наблюдать трудно из-за быстроты протекания 
этого процесса. Однако есть область иммунологии, в которой этот 
процесс рассмотрен в динамике и в различных аспектах. Это взаимодействие вирусов с антителами (глава 1 монографии).

Анализ экспериментальных данных, посвященных указанному 

вопросу, проведен с позиций признания объективно существующей 
(но, как правило, не учитываемой при оценке взаимодействия) неоднородности исследуемых вирусных взвесей (дискретные частицы: 
одиночные вирионы и конгломераты из разного их числа), и, следовательно, неоднородности выявляемых при титровании в культуре 
клеток дискретных очагов поражения (инфекционных единиц).  
С этих позиций рассмотрен процесс нейтрализации вирусов специфическими антителами. Такой подход позволил дать новую оценку 
ряду известных понятий, в частности, авидности вирусов и авидности антител. Представлено новое понимание процессов, которые 
принято считать «созреванием» авидности антител.

Количественные аспекты взаимодействия антигенов и антител 

на молекулярном уровне рассмотрены на примере взаимодействия 
специфических антител с токсином (глава 2 монографии).

Вирус и токсин отличаются по своим размерам и свойствам, 

представляя макромолекулярный и молекулярный уровень. И потому их сравнение представляет особый интерес. Поскольку речь 
идет о количественной оценке взаимодействия, в обоих случаях 
исследованы факторы, влияющие на этот процесс. В данном разделе монографии впервые представлены экспериментальные доказательства того, что в иммуноферментном анализе специфические 
антитела взаимодействуют с антигеном на поверхности планшета  
в соответствии с закономерностями физико-химической адсорбции. На основе выявленных закономерностей создана модель 
взаимодействия при разных количественных соотношениях смешиваемых компонентов. Модель нашла подтверждение в опытах. 

Дана новая интерпретация явлений в экспериментах, обычно расцениваемых как свидетельство «созревания авидности антител»  
в процессе иммунного ответа.

Глава 3 монографии посвящена количественным аспектам взаи
модействия антигенов с иммунокомпетентными клетками.

Впервые анализ работ по изучению взаимодействия иммуноком
петентных клеток и антигена с позиций признания его неоднородного воздействия на клеточном уровне проделан автором в 1982 г. 
В последующем (1996) предложена новая концептуальная модель 
иммунного ответа лимфоцитов, учитывающая дозовую неоднородность антигена и его свойства (тимусзависимый или тимуснезависимый антиген). За истекший с того времени период разными 
исследователями были получены экспериментальные данные, которые свидетельствуют в пользу предложенной новой концепции.  
В монографии предложенная модель нашла дальнейшее обоснование и развитие с учетом новых данных. Представлены собственные экспериментальные данные об индукции первичного 
иммунного ответа в системе in vitro к антигенам возбудителя мелиоидоза.

Глава 1

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ  
С АНТИТЕЛАМИ И КЛЕТКАМИ

Титова Н.Г.

1.1. АДСОРБЦИЯ ВИРУСА КЛЕТКОЙ,  

МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ

Адсорбция вируса клетками — первый этап, от которого зависит 

точность количественной оценки числа дискретных инфекционных 
частиц в суспензии вируса. Установлено, что процесс адсорбции 
определяется наличием у клеток специфических рецепторов  
и имеет физико-химическую природу. Роль клеточных рецепторов 
в специфической адсорбции исследована на модели полиовирусов 
[1–3], вируса вакцины [4–6], энтеровирусов [7], миксовирусов  
[8–11] и других [12].

Адсорбция вируса протекает более эффективно в гомологичной 

системе, т.е. в той, в которой вирус был выращен. Инактивированный вирус адсорбируется так же, как активный. Это очень 
важное наблюдение, так как целый ряд феноменов, оцениваемых 
количественно, является отражением одновременного заражения 
клеток активными, инактивированными и дефектными вирионами, играющими определенную роль в процессе инфекции.

Наиболее полные и объективные результаты количественной 

оценки процесса адсорбции были получены при одновременном 
применении метода электронной микроскопии (подсчет вирионов) 
и биологического титрования (определения числа инфекционных 
единиц БОЕ/мл) [9–14]. В большинстве случаев адсорбцию вируса 
оценивали только с помощью биологического титрования. Такого 
рода биологические характеристики имеют ограниченное применение: они дают представление лишь о том, какое количество 
инфекционных единиц (от общего их числа) может быть адсорбировано при данных конкретных условиях. Такие способы оценки 
не могут быть использованы для сравнительной характеристики 
свойств вирусов, так как заведомо могут содержать ошибку: они 
могут не отражать истинные концентрации (суммарное содержание 
инфекционных и неинфекционных частиц) вирионов в сравниваемых образцах. Между тем известно, что скорость адсорбции 

зависит от концентрации частиц, обладающих одинаковым сродством к данному адсорбенту. В том случае, когда происходит адсорбция смеси компонентов, обладающих одинаковым сродством 
к адсорбенту, скорость их адсорбции определяется их суммарной 
концентрацией.

1.2. ЦИТОМОРФОЛОГИЯ КАК ПРОЯВЛЕНИЕ  

БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВИРУСА

Начальные стадии взаимодействия вируса с клеткой с привле
чением электронной микроскопии, радиобиологических и иммунологических методов исследования изучены на модели вируса 
вакцины [5; 6], миксовирусов [10–13]. Эти исследования показали, 
что возможно проникновение в клетку как небольшого числа вирионов, так и множественное заражение.

Так, например, Nielsen G., Peters D. [13] наблюдали взаимо
действие вируса вакцины с клеткой при высоких дозах вируса  
(100 БОЕ на 1 клетку). Было установлено, что после адсорбции 
вирус погружается в пиноцитические вакуоли. В вакуолях были 
видны как одиночные вирионы, так и группы вирионов (конгломераты) разной величины. Несмотря на высокую множественность 
заражения, авторы не заметили токсического эффекта.

Существует мнение, что посредством пиноцитоза в клетку про
никают лишь достаточно крупные вирионы или их конгломераты. 
Полагают, что мелкие вирусы проникают в клетку без предварительного погружения в вакуоль путем непосредственного взаимодействия оболочки вириона с клеточной мембраной.

Находясь в пиноцитической вакуоли, вирус не претерпевает 

каких-либо структурных изменений: нуклеокапсид сохраняет присущую ему белковую оболочку и внутреннюю структуру, разрушается лишь внешняя фосфолипидная оболочка [5; 6].

Специфическое же взаимодействие находящихся в вакуоли 

вирионов с клеткой и проникновение в цитоплазму так же, как  
и у мелких вирусов, осуществляется путем ассоциации оболочки 
нуклеокапсида с клеточной мембраной. По-видимому, это общий 
способ специфического мембранного взаимодействия для всех вирусов животных. Об этом свидетельствуют многие факты. В частности, явление слияния инфицированных клеток, образование 
симпластов и поликариоцитов, видимо, могут рассматриваться как 
явления такого же рода.

Установлено, что у вируса вакцины ответственными за процесс 

слияния мембран являются тубулы, расположенные на поверхности вириона. Они же являются антигенными детерминантами, 

индуцирующими синтез нейтрализующих вирус антител. Антитела, 
прикрепляясь к тубулам, делают невозможным слияние мембран  
и, следовательно, предотвращают попадание нуклеокапсида вируса 
в цитоплазму.

Электоронно-микроскопические наблюдения [8] говорят о том, 

что нейтрализованный вирус адсорбируется клеткой и подвергается пиноцитозу так же, как не нейтрализованный, но его внутриклеточная судьба иная. В отличие от последнего, он так и остается  
в пиноцитической вакуоли, подвергаясь в дальнейшем деградации. 
Равным образом, вирус вакцины, инактивированный нагреванием, 
хорошо адсорбируется клеткой, подвергается пиноцитозу, но в цитоплазму клетки не проникает. Видимо, изменившиеся при нагревании тубулярные структуры утрачивают способность взаимодействовать с клеточной мембраной. Аналогичные данные получены  
и для других вирусов [11].

1.3. КОМПЛЕКС «ВИРУС — АНТИТЕЛА»,  

ЕГО ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ СУДЬБА

Во взвеси вируса с антителами в физиологических условиях про
исходит взаимодействие антител с поверхностью вириона. Электронно-микроскопические исследования позволили определить, 
как осуществляется это взаимодействие. Установлено, что молекулы антител могут прикрепляться к поверхности вириона либо 
одним концом, либо обоими концами (паратопами), либо образуют мостики между соседними вирусными частицами, объединяя 
их в иммуноагрегат [14; 15]. В зависимости от используемых концентраций антител в реакционной смеси на поверхности вириона 
находили разное число молекул [15–17]. До сих пор остается открытым вопрос о том, какое количество антител необходимо для 
того, чтобы вирус оказался нейтрализованным. По данным некоторых авторов на поверхности вируса гриппа может быть связано 
от 1200 до 6000 молекул антител [17]. Учитывая данные о процессе 
проникновения в клетку (слияние мембран), можно полагать, что 
для нейтрализации вирусов животных необходимо прикрепление 
такого количества антител, которое было бы надежным препятствием для слияния вирусной и клеточной мембран, т.е. достаточно 
большое количество.

Комплекс «вирус — антитела» при физиологической ионной 

силе стабилен, но изменение pH среды, обработка ультразвуком 
могут привести к диссоциации комплекса [18–21]. Освободившийся от антител вирус не утрачивает инфекционную активность 

и способен быть вновь нейтрализованным. Это говорит о том, что 
антитела не обладают вирулицидным действием и о том, что нейтрализованный вирус какое-то время остается потенциально активным.

Довольно подробно исследован процесс адсорбции нейтра
лизованных комплексов клетками. С помощью изотопной метки  
и биологического титрования было показано, что нейтрализованные комплексы адсорбируются клеткой почти в той же степени, 
что и не нейтрализованный вирус [22]. Более того, нейтрализованные комплексы были найдены внутри пиноцитических вакуолей [23; 24]. Биохимические и электронно-микроскопические исследования показали, что нейтрализованный вирус кроличьей оспы 
и вакцины остается внутри пиноцитической вакуоли, не проникая 
в цитоплазму. При этом он полностью лишается фосфолипидной 
оболочки и далее подвергается деструкции.

Все эти факты говорят о том, что антитела каким-то образом 

препятствуют проникновению нуклеоида в цитоплазму клеток. 
Учитывая известные данные о механизме проникновения вируса  
в клетку, можно полагать, что антитела так модифицируют оболочку вириона, что она оказывается неспособной к слиянию с клеточной мембраной.

Таким образом, установлено, что образующиеся в результате ре
акции нейтрализованные комплексы адсорбируются клеткой, попадают в пиноцитические вакуоли, и там вирус прекращает свое 
существование. Так, электронно-микроскопические наблюдения 
ряда исследователей [8–12] говорят о том, что внутри пиноцитических вакуолей нейтрализованные комплексы подвергаются деградации, по-видимому, за счет клеточных ферментов. Об этом свидетельствует обнаруживаемая расплывчатость структур вириона. 
Образно характеризуя эту ситуацию, можно сказать, что клетка воспринимает нейтрализованный вирус как чужеродную субстанцию  
и переваривает ее в вакуоли.

1.4. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ РЕАКЦИИ 

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСА И АНТИТЕЛ

В сущности, реакция взаимодействия вируса и антител — это 

качественная реакция, демонстрирующая соответствие молекул антител антигенным детерминантам вириона. Может быть найдено 
наличие такого соответствия или отсутствие его. Однако возможность существования у вириона не одного, а нескольких, разных 
по специфичности антигенов, т.е. антигенной мозаики, и вместе 
с тем возможность разных количественных соотношений этих антигенов у разных штаммов вирусов позволяли надеяться выявить 

эти различия с помощью некоторых количественных методов. Такими методами могут быть, с одной стороны, исследование кинетики нейтрализации, а с другой, — определение величины устойчивой не нейтрализуемой фракции вируса, образующейся в конце 
реакции. Наконец, в последние годы развиты методы определения 
антигенной мозаики на поверхности вириона с помощью моноклональных антител к эпитопам поверхности.

1.5. КИНЕТИКА РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ

Наиболее ранние и систематические исследования кинетики ре
акции нейтрализации вирусов произведены Andrews C.H., Elford W.J. 
[25; 26], а также Burnet F. [27] на модели фагов и вируса вакцины. Кинетика реакции нейтрализации была исследована у многих других 
вирусов животных и человека [19–21; 28–33]. Исследуя процесс 
нейтрализации вируса, обычно используют большие концентрации 
антител, в избытке по отношению к вирусу. Это позволяет считать 
концентрацию антител постоянной в ходе реакции и рассматривать процесс только по отношению к вирусу. О том, что антитела  
в смесях были в избытке, судили на основании эксперимента: добавление к реакционной смеси свежей порции вирионов и последующее определение кинетики нейтрализации добавленного вируса 
позволяло убедиться в том, что кинетика нейтрализации и уровень 
устойчивой фракции в обеих порциях вируса были одинаковыми 
[21; 28]. То есть концентрация антител в начале и конце реакции 
(независимо от использованной концентрации вируса) остается 
(в известных пределах) практически неизменной. В большинстве 
случаев реакция нейтрализации происходит быстро, без лаг-фазы  
и характеризуется экспоненциальным снижением активности вируса в первые минуты взаимодействия [18; 28; 30]. Характер кривой 
нейтрализации и отсутствие лаг-фазы в начале реакции некоторыми 
исследователями расценивались как свидетельство того, что одной 
молекулы антител было достаточно для нейтрализации вируса. Однако другие исследователи при изучении процесса нейтрализации 
в серии разведений антител показали, что вирусная частица может 
адсорбировать много антител и при этом остаться инфекционной. 
Лишь в немногие первые минуты реакция нейтрализации протекает как реакция первого порядка. В дальнейшем наблюдаются замедление процесса, формирование устойчивой не нейтрализуемой 
фракции, уровень которой и время формирования зависят от концентрации используемых в реакции антител [17; 18; 20; 28; 31].