Физико-химические методы изучения биологических макромолекул (Модуль 2)

 
 
 
 
 
 
 
 
Физико-химические 
методы изучения 
биологических 
макромолекул 
 
Модуль 2 
 
Учебное пособие 
 

 

 

 

 
 

Москва 

ИНФРА-М 

2021

УДК 577 
ББК 28.070 
Ф50 
 

Учебно-методический совет по биологии Федерального УМО «Биологические науки» 

считает целесообразным издать электронное учебное пособие коллектива авторов под ред. 
Ф.Ф. Литвина «Физико-химические методы изучения биологических макромолекул. Модуль 2» 

и рекомендует использовать в учебном процессе в качестве учебного пособия для 
обучающихся образовательных организаций высшего образования по направлениям 

подготовки 06.03.01 и 06.04.01 «Биология», 06.06.01 «Биологические науки» и смежным 
направлениям и специальностям, а также программам дополнительного образования 

А в т о р ы:  
Л.Я. Сатина, С.В. Чернышов, А.А Иванов, В.Ю. Любимов, М.М. Поцелуева, 

К.А. Крицкая, Н.В. Леконцева 

Р е ц е н з е н т ы: 
И.М. Вихлянцев, доктор биологических наук, заведующий лабораторией 

Института теоретической и экспериментальной биофизики Российской академии наук; 

В.П. Кутышенко, доктор физико-математических наук, профессор, главный 

научный 
сотрудник 
Института 
теоретической 
и 
экспериментальной 
биофизики 

Российской академии наук 

 
 
Ф50 Физико-химические методы изучения биологических макромолекул. 
Модуль 2 : учебное пособие / Л.Я. Сатина, С.В. Чернышов, А.А. Иванов 
[и др.] ; под ред. Ф.Ф. Литвина. — Москва : ИНФРА-М, 2021. — 148 с. 
 
ISBN 978-5-16-109852-3 (online) 
 
Учебное пособие описывает ряд физико-химических методов, используемых в 
современных биологических исследованиях. Представлены теоретические основы методов 
и детальное применение их на практике. Полученные при помощи пособия навыки 
проведения 
лабораторных 
работ 
позволяют 
приобрести 
компетенции 
в 
сфере 
современных методов, применяемых в биохимии, молекулярной биологии, физической 
химии, спектроскопии, физиологии и микробиологии. 
Предназначено для биологов, химиков, студентов, аспирантов и слушателей 
программ дополнительного образования. 

УДК 577 

ББК 28.070 

ISBN 978-5-16-109852-3 (online)                                                 © Коллектив авторов, 2021

ФЗ № 
436-ФЗ

Издание не подлежит маркировке 
в соответствии с п. 1 ч. 2 ст. 1

Оглавление 
1. 
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ В ДЕНАТУРИРУЮЩИХ УСЛОВИЯХ .......... 7 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА ........................................................................................................... 7 

Физический принцип электрофореза .................................................................................................... 7 

Практическое использование электрофореза и его типы .................................................................... 9 

Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) .............................................................................. 13 

Электрофорез в ПААГ с использованием додецилсульфата натрия ................................................. 16 

Электрофорез в геле с прерывистой буферной системой (диск-электрофорез) ............................. 17 

Схематичное изображение электрофореза ........................................................................................ 19 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ............................................................................................................................... 20 

Упражнение 1. Проведение в денатурирующих условиях электрофореза белков, полученных из 
клеток кишечной палочки ..................................................................................................................... 20 

Упражнение 2. Определение молекулярных масс белков, полученных с помощью 
электрофоретического разделения ..................................................................................................... 22 

Анализ результатов ............................................................................................................................... 23 

ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................................................................... 24 

2. 
МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ АМИНОКИСЛОТ. ХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД 

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОЛИНА ............................................................................................................... 25 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА ......................................................................................................... 25 

Структура и свойства стандартных аминокислот............................................................................... 25 

Химические методы и реакция с нингидрином .................................................................................. 38 

Химический метод определения пролина .......................................................................................... 41 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ............................................................................................................................... 43 

Упражнение 1. Определение концентрации пролина в листьях проростков пшеницы в 
нормальных и стрессовых условиях с помощью специфического метода химического анализа; 
ознакомление с принципами работы на спектрофотометре; измерение оптической плотности 
образцов; построение калибровочной кривой и вычисление результатов. .................................... 43 

Ход работы: ............................................................................................................................................ 44 

Проведение анализа. ............................................................................................................................ 44 

ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................................................................... 45 

3. 
ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ БЕЛКОВ ...................................................................... 48 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА ......................................................................................................... 48 

Общие закономерности хроматографических методов .................................................................... 48 

Метод ионообменной хроматографии ................................................................................................ 48 

Особенности ионообменной хроматографии белков ........................................................................ 50 

ЭЛЮЦИЯ .................................................................................................................................................. 56 

СБОР И ОБРАБОТКА ФРАКЦИЙ.............................................................................................................. 58 

Определение количества фермента и его активности ....................................................................... 59 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ............................................................................................................................... 60 

Подготовка колонки .............................................................................................................................. 61 

Нанесение образца ................................................................................................................................ 61 

Упражнение 1. Очистка инвертазы и определение её активности ................................................... 63 

Упражнение 2. Очистка белка от примесей ........................................................................................ 67 

Упражнение 3. Очистка амилазы и определение ее активности ...................................................... 67 

ПРИЛОЖЕНИЕ ............................................................................................................................................. 70 

ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................................................................... 71 

4. 
ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ...................................................................................... 72 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА ......................................................................................................... 72 

Неподвижная фаза ................................................................................................................................. 74 

Выбор адсорбента ................................................................................................................................. 74 

Выбор подвижной фазы ........................................................................................................................ 78 

Приготовления пластинок для ТСХ ....................................................................................................... 79 

Нанесение образца ................................................................................................................................ 80 

Хроматографирование образцов ......................................................................................................... 81 

Детектирование растворенных веществ ............................................................................................. 82 

Выявляющие реагенты .......................................................................................................................... 83 

Количественный и качественный анализ ............................................................................................ 85 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ............................................................................................................................... 87 

Упражнение 1. Разделение пигментов листа методом тонкослойной хроматографии ................. 87 

Упражнение 2. Определение количества пигментов в листе методом тонкослойной 
хроматографии. ...................................................................................................................................... 90 

Упражнение 3. Разделение ароматических компонентов экстракта цедры цитрусовых. .............. 92 

Упражнение 4. Разделение стероидов методом тонкослойной хроматографии. ........................... 93 

Упражнение 5. Полуколичественный метод сопоставления площадей пятен с известными 
количествами веществ и сравнение полученных таким образом эталонов с хроматограммой 
анализируемой смеси. .......................................................................................................................... 93 

ПРИМЕЧАНИЯ ............................................................................................................................................. 94 

ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................................................................... 96 

5. 
КИНЕТИКА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ НА ПРИМЕРЕ КАТАЛАЗЫ .................................. 97 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА ......................................................................................................... 97 

Механизм реакции ................................................................................................................................ 97 

Четвертичная структура апофермента и реакционный центр ........................................................... 98 

Физико-химические свойства каталазы ............................................................................................. 100 

Ферментативная кинетика Михаэлиса-Ментен ................................................................................ 100 

Методы измерения каталазной активности каталазы ..................................................................... 102 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ............................................................................................................................. 104 

Упражнение 1. Измерение каталазной активности фермента в растворе препарата каталазы 
(SIGMA) .................................................................................................................................................. 104 

Упражнение 2. Расчёт скорости ферментативной реакции ............................................................. 104 

Упражнение 3. Изучение зависимости каталазной активности от концентрации пероксида 
водорода .............................................................................................................................................. 105 

ЛИТЕРАТУРА ......................................................................................................................................... 106 

6. МЕТОДЫ ФИЛЬТРОВАНИЯ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА ПО ЛОУРИ ............................................. 107 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА ........................................................................................................ 107 

Простое фильтрование ........................................................................................................................ 108 

Мембранное фильтрование (микрофильтрация) ............................................................................. 111 

Ультрафильтрация ............................................................................................................................... 113 

Лабораторные методы, в которых также используются полупроницаемые перегородки .......... 115 

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА ............................................................................................. 118 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ............................................................................................................................. 121 

Упражнение 1. Концентрирование на ультрафильтре белкового раствора с последующим 
определением его концентрации. ..................................................................................................... 121 

Упражнение 2. Определение белка по методу Лоури ..................................................................... 122 

Упражнение 3. Определение неизвестной концентрации белка в растворе ................................ 123 

ПРИЛОЖЕНИЕ ....................................................................................................................................... 124 

ЛИТЕРАТУРА ......................................................................................................................................... 124 

6. 
ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА БЕЛКА. МЕТОД БРЕДФОРД ................................................. 125 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА ....................................................................................................... 125 

1. Метод определения концентрации белка по поглощению в ближней ультрафиолетовой 
области. ................................................................................................................................................ 125 

2. Метод определения концентрации белка по поглощению в дальней ультрафиолетовой 
области ................................................................................................................................................. 127 

3. Колориметрические методы определения концентрации белка ............................................... 127 

МЕТОД БРЕДФОРД ............................................................................................................................... 130 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ............................................................................................................................. 133 

Упражнение 1 Определение концентрации белка методом Бредфорд ........................................ 133 

Упражнение 2. Построение калибровочной кривой ........................................................................ 133 

Упражнение 3. Определение концентрации белка в порошке спортивного питания .................. 134 

ПРИЛОЖЕНИЕ ....................................................................................................................................... 135 

ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................................................................. 136 

6. 
КРИСТАЛЛИЗАЦИЯ БЕЛКОВ .................................................................................................. 137 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА ....................................................................................................... 137 

Общие положения кристаллизации белков ...................................................................................... 137 

Факторы, влияющие на кристаллизацию .......................................................................................... 139 

Основные методы кристаллизации ................................................................................................... 142 

Поиск условий кристаллизации .......................................................................................................... 145 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ............................................................................................................................. 146 

Упражнение 1.  Получение кристаллов лизоцима методом диффузии паров в висячей капле, . 146 

Упражнение 2. Изучение влияния температуры и различных добавок на кристаллизацию 
данного белка. ..................................................................................................................................... 147 

ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................................................................. 148 

 

 

 

 

 

 

 

 
 

 

 
 

1. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ В 

ДЕНАТУРИРУЮЩИХ УСЛОВИЯХ  

Автор к.б.н. С.В. Чернышов, филиал Института биоорганической химии им. акад 

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА 

Электрофоретическое разделение макромолекул является одним из наиболее часто 

используемых физико-химических методов их исследования.

В основе метода лежит физическое явление электрофореза, которому интернет-ресурс 

“Википедия” даёт следующее определение:

“Электрофорез (от электро- и греч. φορέω — переносить) — электрокинетическое 

явление перемещения заряженных частиц дисперсной фазы (коллоидных или белковых 
растворов) в жидкой или газообразной среде под действием внешнего постоянного 
электрического поля.”

Впервые это явление было открыто известными учёными, профессорами Московского 

университета: химиком и медиком Фёдором Фёдоровичем Рейссом и физиком Петром 
Ивановичем Страховым в 1807 году.

Результатом электрофореза является электрофореграмма – картина, полученная после 

разделения компонентов сложной смеси макромолекул и визуализированная с помощью 
специфического проявления или окраски. 

Физический принцип электрофореза

Находящиеся в буферном растворе макромолекулы обладают некоторым суммарным 

электрическим зарядом, который возникает в результате диссоциации различных 
группировок. Если говорить о белках, то это карбоксильные, амино-, а также имидазольные 
группы, входящие в состав боковых групп аминокислот. Величина и знак заряда 
макромолекулы, которые она приобретает в растворе, зависят от рН среды и её ионной силы. 
Только в очень узком диапазоне значений pH суммарный заряд молекулы равен нулю, т.к. 
положительные и отрицательные заряды её ионизированных групп компенсируют друг друга. 
Это значение pH называют изоэлектрической точкой (pI). При этом значении величины pH
молекула становится электрически нейтральной и теряет способность двигаться под 
действием электрического поля. При всех остальных значениях pH, отличных от pI, молекула 
способна перемещаться либо к катоду, либо к аноду. Для эффективного разделения 
заряженных макромолекул, находящихся в смеси, используют буферные растворы с 
оптимальным значением pH, обеспечивающим максимальное различие зарядов разных 
макромолекул. Как правило, величина pH буфера на 3 – 4 единицы отличается от среднего 

значения pI разделяемых макромолекул. Концентрация буферных растворов обычно бывает 
не менее 0,1 – 0,2 М, чтобы обеспечить существенную их ёмкость.

Если через раствор, заключенный в канал из изолирующего материала, пропускать 

постоянный электрический ток, то вдоль канала установится определенный градиент
напряжения, т. е. сформируется электрическое поле. Его напряженность измеряется 
разностью потенциалов по концам рабочего канала (или его участка), отнесенной к его длине 
(В/см). Скорость движения частицы (см/ч) при напряженности электрического поля 1В/см 
называется электрофоретической подвижностью.

Под действием поля макромолекулы в соответствии со своим суммарным зарядом 

мигрируют в направлении катода или анода. При этом электрическое поле будет действовать 
на молекулу с силой F1, которая пропорциональна его напряженности E, заряду молекулы q и 
зависит от расстояния d между электродами:

d
q
E
F


 
1

Поскольку движение молекул происходит не в вакууме, а в среде, имеющей некоторую 

плотность, то на нее действует также сила сопротивления среды, или сила вязкого трения F2. 
Эта сила зависит от вязкости среды, размеров молекулы и описывается уравнением Стокса: 

V
r
F


6
2 


,

где r – радиус сферической молекулы; η – коэффициент вязкости среды; V – скорость 

движения молекулы.

В конечном итоге трение ограничивает скорость миграции макромолекул, они перестают 

ускоряться и при неизменных параметрах напряженности электрического поля и постоянной 
вязкости среды приобретают характер равномерного движения. Это состояние описывается 
уравнением: 

V
r
d
q
E


6




Преобразовав его, получаем формулу для вычисления скорости движения молекулы: 

d
r
q
E
V


6





Отсюда видно, что скорость движения пропорциональна напряженности поля и заряду 

молекулы и обратно пропорциональна размеру молекулы и вязкости среды. Заряд и размер 
молекулы являются строго индивидуальными характеристиками, поэтому при постоянных 
значениях вязкости среды и напряженности электрического поля молекулы приобретают 
разные скорости, и в этом сущность процесса электрофореза. Постепенно исходный препарат, 
представляющий собой смесь различных макромолекул, разделяется на зоны, в которых 
сконцентрированы одинаковые молекулы, мигрирующие с одной и той же скоростью.

Следует, однако, заметить, что приведенные выше формулы хорошо описывают процесс 

электрофореза в жидкой непроводящей среде, например, в градиенте концентрации сахарозы. 
В реальности для разделения макромолекул используются плотные гели, и поэтому 
фракционируемые молекулы сталкиваются с нитями полимера, образующего трехмерную 
сетку геля, что снижает скорость движения молекул. От соотношения линейных размеров пор 

в геле и размеров мигрирующих молекул зависит и тормозящий эффект, который оказывается 
различным для разных молекул. Этот эффект называют эффектом молекулярного сита. 
Использование гелей в качестве поддерживающей среды при электрофоретическом 
разделении макромолекул позволяет повысить разрешающую способность этого метода.

Как правило, среда, в которой происходит движение молекул, является не изолятором, а 

электролитом, содержащим низкомолекулярные заряженные ионы. Поэтому электрический 
ток в электрофорезной камере обеспечивается не только заряженными биологическими 
макромолекулами, но и ионами среды. Это вносит дополнительную корректировку в описание 
процесса электрофореза. Заряженная макромолекула или частица, находящаяся в электролите, 
притягивая ионы противоположного знака заряда, окружает себя ионной оболочкой 
(атмосферой), экранирующей ее от приложенного внешнего электрического поля. В 
результате этого незначительно изменяются её физические характеристики. Линейные 
размеры за счет ионной оболочки несколько увеличиваются, что неизбежно влечет за собой 
увеличение сопротивления среды (по закону Стокса). Величина же заряда, в свою очередь, 
немного снижается, будучи частично компенсирована близко расположенными ионами 
противоположного знака. В конечном итоге формирование ионной оболочки вокруг 
заряженной макромолекулы способствует снижению скорости её миграции. Однако эта 
оболочка является лабильной структурой, которая может частично разрушаться как самим 
полем, так и движением частицы сквозь плотную среду. Таким образом, можно сказать, что 
состояние макромолекулы при электрофорезе является динамическим, а в результате этого 
имеет место флуктуация скорости её движения.

Существенное влияние на скорость движения макромолекул оказывает также их 

пространственная структура (конформация). Две молекулы, имеющие одинаковые массу и 
заряд, могут, тем не менее, существенно отличаться по подвижности, если они обладают 
различной пространственной конфигурацией. Более компактные молекулы способны 
продвигаться в плотной среде с большей скоростью, испытывая меньшее сопротивление.

Эффект трения зависит также от жесткости макромолекулы. Так, глобулярные белки, не 

способные к агрегации или диссоциации на субъединицы, ведут себя более или менее 
одинаково, хотя их размеры зависят от плотности упаковки глобулы. Рыхлые глобулярные и 
особенно фибриллярные белки могут деформироваться при взаимодействии с гелем и тем 
самым облегчать себе миграцию между нитями его неподвижной фазы. Этот эффект особенно 
сильно выражен у высокомолекулярных нуклеиновых кислот. В частности, молекулы 
плазмидной ДНК в зависимости от формы (суперскрученная, релаксированная кольцевая, 
линейная) будут мигрировать в геле с разными скоростями, хотя все они имеют одинаковые 
молекулярную массу и заряд.

 
 
Практическое использование электрофореза и его типы 

Электрофорез используется в различных областях биологии и химии: физической химии, 

биохимии, молекулярной биологии, генетической инженерии для разделения макромолекул 
— белков, нуклеиновых кислот (а также их фрагментов), заряженных полисахаридов. 
Электрофорез белков применяют как для анализа компонентов смеси белков, так и для 

получения гомогенного белка. Этот метод также может использоваться для определения 
физических параметров макромолекул, таких как молекулярная масса или заряд.

Если говорить о классификации методов электрофореза, то следует отметить, что 

отнесение его к тому или иному типу зависит от принципа, который полагается в основу 
метода. Один и тот же метод может быть классифицирован по различным параметрам.

Электрофоретическое разделение может быть проведено как без использования, так и с 

использованием опорной фазы носителя. В первом случае это будет электрофорез в 
свободном растворе или фронтальный электрофорез, который применим для веществ с 
высокой молекулярной массой, имеющих малую способность к диффузии. Метод 
используется для определения электрофоретической подвижности молекул. Недостатком его 
является то, что после прекращения воздействия электрического поля границы разделенных 
веществ размываются в течение короткого времени.

В отличие от электрофореза в свободном растворе электрофорез с использованием 

поддерживающей фазы не имеет этого недостатка, и поэтому является более 
востребованным и удобным с практической точки зрения методом. В качестве 
поддерживающей среды могут выступать носители самой разной природы, но обладающие 
общим свойством: эффектом молекулярного сита. Применение поддерживающей фазы 
позволяет существенно снизить конвекцию и повысить качество разделения макромолекул.  

Если 
принять 
за 
основу 
качественно-количественный 
принцип, 
то 
все 

электрофоретические методы можно разделить на два типа: 
препаративный и 

аналитический.

Аналитический электрофорез предназначен для установления различия между 

макромолекулами по их физическим параметрам (электрический заряд или молекулярная 
масса), а также для измерения этих параметров.

Препаративный электрофорез позволяет разделить сложную смесь макромолекул до 

отдельных компонентов с целью их практического использования или дальнейшего изучения.

Следующий принцип классификации основан на степени денатурации разделяемых 

макромолекул. Если путём электрофореза происходит разделение нативных молекул, т.е. 
молекул, обладающих естественными (природными) зарядом и конформацией, то можно 
говорить об использовании 
нативного электрофореза. В случае же разделения 

денатурированных молекул имеет место электрофорез в денатурирующих условиях. В 
отличие от нативного электрофореза электрофорез в денатурирующих условиях предполагает 
применение химических веществ, разрушающих пространственную структуру макромолекул. 
Примером нативного электрофореза может служить метод изоэлектрического фокусирования.

Изоэлектрическое фокусирование (IEF) – один из методов разделения белков в 

зависимости от величины и знака электрического заряда. Во время изоэлектрического 
фокусирования между анодом и катодом создается градиент рН за счёт присутствия в среде 
особых веществ, амфолинов (рис.1А). Амфолины представляют собой сложную смесь 
полиамино-поликарбоновых кислот, имеющих разное соотношение положительно и 
отрицательно заряженных групп. Препарат белков, которые следует разделить, компактно 
наслаивают на поверхность геля (рис. 1Б). При включении электрического тока молекулы 
белков мигрируют в соответствии с их фактическим зарядом в направлении противоположно 
заряженного электрода. Если эти молекулы амфотерны, т.е. содержат группы, способные 
нести различный электрический заряд, в зависимости от окружающего рН, то при