Биотехнология. Практикум по культивированию клеточных культур

БИОТЕХНОЛОГИЯ

ПРАКТИКУМ ПО КУЛЬТИВИРОВАНИЮ 
КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

Москва
ИНФРА-М
2020

УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ

Рекомендовано 
Межрегиональным учебно-методическим советом 
профессионального образования в качестве учебного пособия 
для учебных заведений, реализующих программу среднего 
профессионального образования по специальности 
19.02.01 «Биохимическое производство» 
(протокол № 14 от 30.09.2019)

УДК 576.5(075.32)
ББК 28.05я723
 
Б63

Б63  
Биотехнология. Практикум по культивированию клеточных культур : учебное пособие / М.Ш. Азаев, Т.Н. Ильичева, Л.Ф. Бакулина [и др.]. — Москва : ИНФРА-М, 2020. — 
142 с. + Доп. материалы [Электронный ресурс]. — (Среднее 
профессиональное образование). 

ISBN 978-5-16-015953-9 (print)
ISBN 978-5-16-108343-7 (online)
В учебном пособии представлены основные методические подходы к работе с культурами клеток: ведение клеточных культур, их пассирование, подсчет клеток в единице объема, приготовление раство ров антибиотиков, диспергирующих раство ров 
и питательных сред для работы с клеточными культурами, контаминация клеточных культур и методы ее обнаружения, криоконсервация клеток, техника безопасности при работе в боксовом помещении с клеточными культурами, биобезопасность 
при работе с клеточными культурами.
Соответствует требованиям федеральных государственных 
образовательных стандартов среднего профессионального образования последнего поколения.
Предназначено для специалистов и студентов учреждений 
среднего профессионального и высшего образования, квалифицирующихся в области биотехнологии и вирусологии для решения задач широкого диапазона.
УДК 576.5(075.32)
ББК 28.05я723

Р е ц е н з е н т ы:
Беклемишев А.Б., доктор биологических наук, профессор, 
заведующий лабораторией Научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения Российской академии 
наук;
Полтавченко А.Г., доктор биологических наук, заведующий 
лабораторией Государственного научного центра вирусологии 
и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора

ISBN 978-5-16-015953-9 (print)
ISBN 978-5-16-108343-7 (online)
 © Коллектив авторов, 2020

Материалы, отмеченные знаком 
, 
доступны в электронно-библиотечной системе Znanium.com

Авторский коллектив

Мамедьяр Шакирович Азаев, доктор биологических наук, доцент, заведующий отделом научно-методической подготовки персонала по работе с возбудителями особо опасных инфекций Государственного 
научного центра вирусологии и биотехнологии 
«Вектор» Роспотребнадзора;
Татьяна Николаевна Ильичева, доктор биологических наук, доцент, заведующий лабораторией 
серодиагностики гриппа отдела зоонозных инфекций 
и гриппа Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора;
Людмила Федоровна Бакулина, научный сотрудник отдела научно-методической подготовки 
персонала по работе с возбудителями особо опасных 
инфекций Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора;
Александра Анатольевна Дадаева, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела 
научно-методической подготовки персонала по работе 
с возбудителями особо опасных инфекций Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора;
Екатерина Сергеевна Олейникова, младший научный сотрудник отдела научно-методической подготовки персонала по работе с возбудителями особо 
опасных инфекций Государственного научного центра 
вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора;
Леонид Рудольфович Лебедев, доктор медицинских наук, заведующий лабораторией Государ

Авторский коллектив

ственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора;
Вадим Николаевич Гуреев, кандидат педагогических наук, старший научный сотрудник Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора;
Сергей Викторович Нетёсов, доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент Российской академии наук, заведующий лабораторией 
биотехнологии и вирусологии Новосибирского национального исследовательского государственного университета;
Александр Петрович Агафонов, доктор биологических наук, заместитель генерального директора по 
научной работе Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора.

Список условных сокращений

БМБ — бокс микробиологической безопасности;
ДЖ, % — доля живых клеток, %;
ДМЕМ (DMEM, Dulbecco modified Eagle’s 
medium) — минимальная эссенциальная среда Игла, 
модифицированная по способу Дульбекко;
ДМСО — диметилсульфоксид;
ИП — индекс пролиферации;
КРС — крупный рогатый скот;
ЛВЖ — легковоспламеняющаяся жидкость;
МТТ — 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолий бромид;
ОП — оптическая плотность;
ПБА — патогенный биологический агент;
ПЦР — полимеразная цепная реакция;
РКЭ — развивающийся куриный эмбрион;
СОП — стандартная операционная процедура;
ТЦИД — тканевая цитопатическая инфекционная доза;
УФО — ультрафиолетовое облучение;
ФЭК — фибробласты эмбрионов кур;
ФИО — фамилия, имя, отчество;
хч — химически чистый;
ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота;
MDCK (Madin — Darby canine kidney) — клетки 
Мадин — Дарби почек собак.

Введение

С середины 50-х гг. XX столетия культуры клеток 
широко используются в различных областях биологии, медицины и ветеринарии. За прошедшее время 
культуры клеток, которые служили вначале объектом 
и инструментом исследований, в ходе интенсивного 
развития технологий стали основой для значительной 
части биотехнологических и биофармацевтических 
производств. Во многих исследованиях культуры 
клеток являются адекватной заменой использованию 
лабораторных животных. В настоящее время можно 
получать и культивировать клетки практически 
из любых органов и тканей млекопитающих, рыб, насекомых, растений и других организмов. В результате 
культивируемые клетки применяются во многих наукоемких технологиях, в том числе непосредственно 
в медицине. С применением клеток человека и животных в промышленных масштабах налажено производство вакцин, диагностикумов, гормонов, терапевтических рекомбинантных белков и других биологически активных веществ.
Вместе с тем работа с культурами клеток требует 
высокой квалификации специалистов, специальных 
условий и оборудования для проведения работ, наличия качественных реактивов и посуды. При этом 
квалификация и методические навыки специалистов 
являются крайне важными факторами. По этой причине, а также из-за растущей востребованности работ 
с культурами клеток предлагаемый практикум является актуальным учебно-методическим пособием, 
содержащим детальное описание методов и приемов 

Введение

работ с клеточными культурами. В практикуме представлен широкий ассортимент методик по работе 
с культурами клеток: ведение клеточных культур, 
включая их пассирование и подсчет клеток в единице 
объема; приготовление различных вспомогательных 
раство ров для поддержания жизнедеятельности 
клеток, методы выявления контаминации клеточных 
культур и способы борьбы с ней, криоконсервация 
клеток, техника безопасности при работе в боксовом 
помещении с клеточными культурами, биобезопасность при работе с клеточными культурами в целом. 
Этот практикум будет полезен для получения надежных навыков работы с культурами клеток и в качестве методического пособия для решения тех 
или иных проблем, возникающих в рабочих ситуациях.
Практикум предназначен для специалистов 
и студентов, квалифицирующихся в области биотехнологии для решения задач широкого диапазона.
В результате изучения практикума студенты 
будут:
 
• знать основные требования, предъявляемые к организации вирусологической (микробиологической) 
лаборатории и работе персо нала в ней, к правилам 
оформления лабораторных журналов и прочей отчетной документации;
 
• уметь ориентироваться в реестре санитарно-эпидемиологических докумен тов и инструкций, пользоваться средствами индивидуальной защиты, эксплуатировать лабораторное оборудование (в частности, боксы микробиологической безопасности, 
дозаторы, микроскопы), разводить и тестировать 
раство ры;

Введение

 
• владеть основами работы с культурами клеток 
и лабораторными методиками; правилами обращения с лабораторной посудой, реактивами, соблюдения стерильности процедур на всех этапах исследования.

1. Понятие культуры клеток

Первые опыты по выращиванию клеток в искусственных условиях, т.е. вне организма (in vitro), 
были предприняты в XIX в. Английский физиолог 
С. Рингер (S. Ringer) разработал несколько типов 
солевых раство ров, содержащих хлориды натрия, 
калия, кальция, магния и бикарбонат натрия, 
для поддержания биения сердца животных вне организма. В 1885 г. немецкий ученый В. Ру (Wilhelm 
Roux) сформировал основы культивирования тканей. 
В частности, он извлекал часть костного мозга из куриного эмбриона и держал его в теплом физиологическом растворе в течение нескольких дней без потери 
жизнеспособности и гистологических особенностей. 
Р.Г. Харрисон (Ross Granville Harrison), работавший 
в Медицинской школе Университета Джонса Хопкинса, а затем в Йельском университете, создал методологию культивирования тканей животных и человека и опубликовал в 1907–1910 гг. результаты своих 
эксперимен тов. Данная техника выращивания тканей 
была названа культивированием клеток.
Большой вклад в развитие и совершенствование 
методологии внесли:
 
• французский хирург и биолог А. Каррель (A. Car rel) — в 1912 г. он создал и использовал систему 
строгих правил асептики, которая позволила 
в течение нескольких месяцев культивировать 
фрагмен ты тканей цыпленка;
 
• П. Раус и Ф.С. Джонс (P. Raus, F.S. Jons), которые 
в 1916 г. разработали методику трипсинизации 
и субкультивирования;

1. Понятие культуры клеток

 
• У. Эрл с группой ученых (W.R. Earle, E.L. Schilling, 
T.H. Stark et al.), которые в 1943 г. получили 
первую перевиваемую линию клеток L.

Рис. 1.1. В лаборатории А. Карреля

Организация и технические условия проведения 
эксперимен тов были в то время очень неудобными 
и громоздкими. Ассистенты Карреля были одеты 
в длиннополые резиновые халаты темного цвета 
с капюшонами, полностью закрывавшими голову 
(рис. 1.1).
В 1910 г. американский исследователь П. Раус 
обнаружил, что культура клеток саркомы цыпленка 
способна вызывать образование опухолей у здоровых 
животных. Позже это привело к открытию им и его 
коллегами онкогенных вирусов. За эти открытия 
в 1966 г. доктор П. Раус получил Нобелевскую 
премию.
Клетки, выделенные из раковых опухолей 
или трансформированные в ходе культивирования 
диплоидных клеток, характеризовались как бессмертные. Первые суспензионные культуры клеток 
животных и человека, как правило, формировались 
из клеток злокачественных тканей. Так, первая пере

1. Понятие культуры клеток

виваемая культура клеток HeLa была получена 8 февраля 1951 г. из раковой опухоли шейки матки пациентки по имени Генриетта Лаакс (Henrietta Lacks), 
умершей от этого заболевания 4 октября того же года. 
Получил данную культуру исследователь-онколог 
Д.О. Джей (George Otto Gey) с сотрудниками; она используется по настоящее время во многих лабораториях мира.
Методы культивирования клеток получили значительное развитие в 1940–1950-е гг. в связи с интенсификацией исследований в области вирусологии. 
Размножение вирусов в культурах клеток позволяло 
получать большие количества очищенных вирусных 
препаратов для производства вакцин и диагностикумов, что помогло наладить производство вакцины 
против полиомиелита. За открытие в 1949 г. способности вируса полиомиелита расти в культурах различных тканей американские ученые Дж.Ф. Эндерс, 
Т.Дж. Уэллер и Ф.С. Роббинс (J.F. Enders, T.J. Weller, 
F.C. Robbins) в 1954 г. получили Нобелевскую премию. 
В 1955 г., использовав полученные ими результаты 
на культуре клеток почек обезьян, Д. Солк (J. Salk) 
создал первую противополиомиелитную инактивированную вакцину. Через год А.Б. Сейбин (A.B. Sabin) 
совместно с советским ученым М.П. Чумаковым разработали живую противополиомиелитную вакцину 
для перорального применения.
В итоге культуры клеток, служившие изначально 
объектом и инструментом исследования, а впоследствии включенные в технологию производства полиомиелитной вакцины и способствовавшие дальнейшему развитию сходных технологий, стали основой 
значительной части биотехнологического и биофармацевтического производств.