Вирусология и биотехнология

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

Департамент научно-технологической политики и образования

Федеральное государственное бюджетное образовательное 

учреждение высшего профессионального образования

«Волгоградский государственный аграрный университет»

Г. М. Фирсов
С. А. Акимова

ВИРУСОЛОГИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ

Учебное пособие 

Издание 2-е дополненное

Волгоград

Волгоградский ГАУ

2015

УДК 619:616.9
ББК 48.43
Ф-62

Рецензенты:

доктор биологических наук, заведующий кафедрой «Анатомия и физиология животных» ФГБОУ ВПО Волгоградский ГАУ А. А. Ряднов;
главный государственный ветеринарный инспектор, старший консультант инспекторского отдела комитета ветеринарии Волгоградской 
области, кандидат ветеринарных наук Ю. А. Горькавский

Фирсов, Григорий Михайлович

Ф-62
Вирусология и биотехнология: учебное пособие / Г.М. Фирсов, 

С.А. Акимова. – Издание 2-е дополненное. – Волгоград: ФГБОУ ВПО 
Волгоградский ГАУ, 2015. – 232 с.

Даны рекомендации по выполнению лабораторно-практических 

работ по дисциплине «Вирусология и биотехнология», приведены методы индикации вирусов в патологическом материале и их идентификации, выделения и титрования вирусов, включая правила работы с вирусами и культурами клеток, а также задания и контрольные вопросы.

Для студентов факультета биотехнологий и ветеринарной меди
цины, очной и заочной формы обучения по направлению подготовки 
36.05.01 «Ветеринария».

УДК 619:616.9
ББК 48.43

© ФГБОУ ВПО Волгоградский государственный аграрный университет, 2015
© Г. М. Фирсов, С. А. Акимова, 2015

ВВЕДЕНИЕ

Дисциплина «Вирусология и биотехнология» является комплекс
ной и условно делится на курсы «Вирусология» и «Биотехнология».

Цель курса «Вирусология» – овладение теоретическими основа
ми вирусологии и приобретение знаний и навыков профилактики и 
диагностики вирусных болезней животных.

Цель преподавания курса «Биотехнология» – дать студентам 

теоретические знания и практические навыки по основным промышленным методам производства биопрепаратов, выявления, выделения, 
разделения, очистки и конструирования биологически активных веществ, а также создания новых активных форм организмов, отсутствующих в природе.

Задачами дисциплины являются:
- ознакомление студентов с природой и многообразием биотех
нологических процессов, достижениями биотехнологии в области ветеринарии;

- изучение технологии получения производственных питатель
ных сред для культивирования различных микроорганизмов;

- изучение условий, влияющих на скорость микробиологических 

процессов и развитие микробных популяций;

- оптимизация микробного процесса;
- отработка практических навыков по выделению производст
венных штаммов микроорганизмов, их селекции, хранения, использования для промышленного изготовления вакцин и антигенов, изучение технологии приготовления терапевтических и диагностических 
сывороток, гаммаглобулинов, пробиотиков, антибиотиков, ферментов, 
витаминов;

- изучение технологии получения рекомбинантных ДНК, генно
инженерных вакцин, моноклональных антител и их использование в 
ветеринарной медицине;

- изучение методов контроля, стандартизации и сертификации 

биологических препаратов и аттестации производственных линий;

- изучение устройств основного производственного оборудова
ния для приготовления питательных сред и лекарственных форм препаратов;

- ознакомление с подразделениями биопредприятий, организа
цией и управлением биологическим производством с использованием 
современной электронной техники;

- изучение перспективных и экологически безопасных техноло
гических процессов, основанных на использовании микроорганизмов.

ВИРУСОЛОГИЯ

1 ПРАВИЛА РАБОТЫ С ВИРУССОДЕРЖАЩИМИ 

МАТЕРИАЛАМИ. УСТРОЙСТВО 

ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Цель занятия

Ознакомиться с вирусологической лабораторией кафедры, обо
рудованием. Изучить правила и технику безопасности при работе с 
вируссодержащим материалом.

Оборудование и материалы

Таблицы – схемы устройства вирусологической лаборатории, 

настольный бокс, люминесцентный и инвертированный микроскопы, 
центрифуги, холодильники, магнитные мешалки, термостаты, спиртовки, стеклянная посуда (груши, пробирки, флаконы, матрасы, чашки 
Петри, пипетки), аппараты Такачи, основные реактивы и питательные 
среды, журнал регистрации студентов, получавших инструктаж по 
технике безопасности, документация лаборатории и основные утвержденные инструкции по правилам работы в ветеринарных учреждениях, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power
Point по теме занятия.

Методика проведения занятия и методические указания по теме.

Объяснение преподавателя

Цели и задачи вирусологических лабораторий, оборудование, 

режим работы вирусологических лабораторий, предупреждения лабораторных заражений, методы хранения и уничтожения вирусов в лабораториях, консервирование, документация в вирусологических лабораториях, техника безопасности при работе студентов с вируссодержащим материалом, с лабораторными животными.

Инструктаж и роспись в журнале по технике безопасности.
Сотрудники вирусологической лаборатории и студенты обязаны 

соблюдать правила работы, предупреждающие загрязнения вируссодержащего материала посторонней микрофлорой, обеспечить личную 
безопасность и не допустить рассеивания вирусов во внешней среде.

1.1 ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ И ПРАВИЛА РАБОТЫ 

С ВИРУССОДЕРЖАЩИМ МАТЕРИАЛОМ

При работе с вируссодержащим материалом необходимо вы
полнять следующие требования:

 не допускать рассеивания вирусов во внешней среде;
 предотвратить контаминацию (загрязнение) вируссодержаще
го материала посторонней микрофлорой;

 обеспечить личную безопасность.

Режим работы вирусологической лаборатории регламентируется 

законами Российской Федерации, международными правилами проведения диагностических лабораторных исследований, правилами 
внутреннего распорядка. Весь персонал лаборатории проходит инструктаж и обучение безопасным методам труда, обеспечивается спецодеждой, спецобувью, средствами санитарной защиты и защитными 
приспособлениями в соответствии с действующими нормами. Вход в 
производственные помещения посторонним лицам категорически запрещен. Сотрудники вирусологической лаборатории обязаны соблюдать правила работы, предупреждающие загрязнения бактериями и 
грибами исследуемого материала, возможность заражения персонала 
и распространения инфекции.

Запрещено выходить за пределы лаборатории в халатах и спец
обуви или надевать верхнюю одежду на халат, курить, принимать пищу в производственных помещениях и хранить в них продукты питания. В боксе работают в стерильном халате, маске, шапочке, в некоторых случаях надевают очки и перчатки. Обязательно меняют обувь. 
Не допускаются хождение и разговоры во время работы.

Весь материал, поступающий в лабораторию на исследование, 

должен рассматриваться как инфицированный!

С инфекционным материалом следует обращаться крайне осто
рожно. При распаковке его банки необходимо протирать снаружи дезинфицирующим раствором и ставить их на поднос или в кювет. Рабочее место на столе покрывают несколькими слоями марли, увлажненной 3-5 % раствором хлорамина. Жидкости, содержащие вирусы, 
переливают над кюветами с дезинфицирующим раствором. При работе с пипеткой пользуются грушей. Пипетки, предметные стекла, стеклянную посуду и резиновые изделия, задействованные в работе с инфекционным материалом, обеззараживают погружением в 5 % раствор хлорамина или растворы фенола, лизола, серной кислоты. Запрещается выносить из лаборатории оборудование, инвентарь, материалы и т. д. без предварительной их дезинфекции. По окончании работы рабочее место приводят в порядок и дезинфицируют. Вируссодержащий материал, необходимый для дальнейшей работы, ставят на 
хранение в холодильник и опечатывают. Руки в перчатках промывают 
в банке с 5 % раствором хлорамина, затем перчатки снимают, обеззараживают вторично, дезинфицируют и моют.

1.2 ТРЕБОВАНИЯ К РАБОЧИМ ПОМЕЩЕНИЯМ 

И ОБЕСПЕЧЕНИЕ УСЛОВИЙ РАБОТЫ

Современные требования к лабораторным диагностическим 

комплексам и отдельным составляющим (полы, стены, потолки, системы отопления, вентиляции, водоснабжения и канализации) изложены в правилах лабораторной практики GLP.

Вирусологические 
отделы 
лабораторий 
и 
научно
исследовательских ветеринарных станций призваны осуществлять лабораторную диагностику вирусных инфекций, контролировать заболеваемость животных, вызываемую вирусами в межэпизоотический 
период, а также учитывать состояние и напряженность специфического постинфекционного и поствакцинального противовирусного иммунитета, участвовать в организации и проведении профилактических 
мероприятий в борьбе с вирусными и хламидийными заболеваниями 
животных в обслуживаемом регионе.

Структура вирусологической лаборатории определяется задача
ми и особенностями ее деятельности. Размещать лабораторию желательно в двухэтажном здании или в изолированном отсеке. Боксы 
предпочтительнее располагать с северной, теневой стороны здания, 
чтобы избежать попадания в них прямых солнечных лучей, или следует застеклить окна боксов молочным или матовым стеклом. Полы в 
коридорах и комнатах для сотрудников могут быть паркетными, покрытыми лаком; в остальных помещениях – из плотного, влагонепроницаемого, устойчивого к дезинфектантам материала. Деревянные 
полы покрывают пластиком. Стены и потолки лаборатории должны 
быть также устойчивыми к дезинфектантам, легко подвергаться мойке. В боксах всю площадь целесообразно отделывать кафельной плиткой. Двери боксов должны быть раздвижными. Это позволяет сэкономить площадь и избежать колебания воздуха. В плоскости двери устраивают окошко с небольшой площадкой. Целесообразно иметь боксы 
следующего назначения: для получения и культивирования клеток –
1-2 бокса; для заражения культуры клеток – 1-2; для заражения куриных эмбрионов – 1-2 бокса; для заражения подопытных животных – 1 
бокс; для вскрытия подопытных животных – 1 бокс; для склада стерильного стекла – 1 помещение.

Основные диагностические работы должны проводиться в на
стольных или стационарных ламинарных боксах (разного класса) с 
системой защиты оператора, предупреждения контаминации исследуемого материала, защиты окружающей среды от вредных и опасных 
выбросов.

Помещения несколько больших размеров (примерно 4 х 4 м) 

выделяют для серологических исследований, уничтожения инфекционного материала, приготовления и стерилизации лабораторной посуды и других материалов, приготовления питательных сред и растворов, а также для сотрудников.

Лаборатория (отдел) вирусологии должна быть обеспечена хо
лодной и горячей водой, желательны подача пара и газа, наличие централизованного вакуум-провода и подачи воздуха под давлением.

Каждый бокс комплектуют соответствующей мебелью и обору
дованием. Примерная схема размещения оборудования и приборов 
представлена на рисунке 1. Наиболее важен стол, размер которого зависит от выполняемых на нем работ. В связи с тем, что многие работы 
приходится выполнять вдвоем, стол рекомендуется располагать параллельно стене, чтобы два работника сидели друг против друга, или 
ставить его к стене в виде буквы Т, что позволяет более экономно использовать площадь стола. Шкафчики для стеклянной посуды и мелкого инвентаря можно устроить под столом или повесить на стену. 
Покрытие лабораторного стола должно быть устойчивым к действию 
дезинфицирующих веществ. Лабораторные стулья лучше всего металлические, так как они легко очищаются и дезинфицируются. Над рабочим местом устанавливают бактерицидные лампы (БУВ-30). У входа в бокс кладут резиновый губчатый коврик, пропитанный дезраствором. В предбокснике находятся стерильные халаты, колпаки, косынки, маски и тапочки, перчатки, которые надевают перед работой в 
боксе, и, в зависимости от назначения бокса, соответствующее оборудование (термостат, холодильник, водяная баня, центрифуга и пр.).

Рисунок 1 – Схема размещения оборудования: а – для работы с культурами 

клеток; б – для изготовления сред и растворов для культур клеток

Рисунок 2 – Микробиологический защитный бокс I класса:

1 – вытяжной вентилятор; 2 – высокоэффективный воздушный 

фильтр; 3 – смотровая стеклянная панель; 4 – открытый проем для рук 

работающего; 5 – штуцера для подводок воды, воздуха

Рисунок 3 – Бокс с ламинарной подачей стерильного воздуха:

1 – газовая горелка; 2 – матрас; 3 – резиновая груша

Ограничить численность бактерий можно с помощью бактери
цидных ламп БУВ-15 и БУВ-30. Значительного снижения количества 
бактерий в воздухе боксов и предбоксников, на поверхности столов и 
другого оборудования можно достигнуть обработкой аэрозолем перекиси водорода и некоторых других веществ. Уборку помещений проводят влажным способом: полы, стены, мебель протирают марлей, увлажненной дезраствором.

Для вирусологической лаборатории любого типа обязательной 

частью оборудования должен быть настольный бокс, содержащий 
бактерицидную лампу, еще лучше – ламинарный шкаф с подачей стерильного воздуха (рис. 2, 3).

При работе в вирусологической лаборатории необходимо стро
го соблюдать методы и правила асептики и антисептики!

Асептика – система мероприятий и приемов работы, предупре
ждающих попадание микроорганизмов и вирусов из окружающей 
среды в организм человека, а также в исследуемый материал. Она 
предусматривает использование стерильных инструментов и материалов, обработку рук сотрудников, соблюдение особых санитарногигиенических правил и приемов работы.

Антисептика – комплекс мероприятий, направленных на унич
тожение микроорганизмов и вирусов, способных вызвать инфекционный процесс при попадании на поврежденные или интактные участки 
кожи и слизистые оболочки. В качестве антисептиков используют 
различные химические вещества: 70-процентный этиловый спирт; 5процентный спиртовой раствор йода; 0,5-3-процентный раствор хлорамина;
0,1-процентный
раствор 
перманганата 
калия;
0,5-1
процентный раствор формалина; 1-2-процентный спиртовые растворы 
метиленового синего или бриллиантового зеленого.

Дезинфекция – обеззараживание объектов окружающей среды 

путем уничтожения патогенных для человека и животных микроорганизмов и вирусов физическими способами и с помощью химических 
веществ: растворами хлорной извести (0,1-10-процентным), формалина, хлорамина (0,5-5-процентным), фенола (3-5-процентным), лизола 
(3-5-процентным), едкой щелочи (2-3-процентным) и др. Выбор дезинфицирующего вещества и его концентрации зависит от материала, 
подлежащего дезинфекции.

В лабораториях для дезинфекции боксов чаще всего применяют 

пары формалина (30-35 мл 40-процентного раствора формальдегида 
на 1 м3 помещения), ß-пропиолактон (1,1 л на 100 м3 помещения) или 
испаряют карболовую кислоту (не реже одного раза в неделю) и ежедневно делают влажную уборку с применением растворов хлорамина, 
гидроксида натрия и др.

Стерилизация – обеспложивание, т. е. полное уничтожение 

микроорганизмов и вирусов в различных материалах. Стерилизацию 
проводят физическими (воздействием высокой температуры, путем 
ультрафиолетового облучения, фильтрацией жидкостей через бактериальные фильтры) и химическими методами.

Физические методы стерилизации:
а) прокаливание в пламени спиртовки или горелки. Данный спо
соб применяют для стерилизации препаровальных игл, петель из аппарата Такачи, пинцетов, горловин культуральных сосудов и т. д.;

б) стерилизация кипячением. Этим методом стерилизуют шпри
цы, мелкий хирургический инструмент, предметные и покровные 
стекла и другие предметы. Кипятят не менее 30 мин. Однако данный 
метод не обеспечивает полной стерилизации, так как некоторые вирусы, например вирус гепатита, и споры бактерий могут остаться при 
этом жизнеспособными;

в) стерилизация сухим жаром в сушильном шкафу. Метод осно
ван на действии нагретого до 165-180 °С воздуха. Сухим жаром стерилизуют стеклянную посуду;

г) стерилизация в автоклаве паром под давлением. Это один из 

наиболее эффективных методов стерилизации, поэтому он широко 
применяется;

д) стерилизация в аппарате Коха или автоклаве текучим паром 

(давление 100-150 кПа (1-1,5 ат), экспозиция 30 мин). Применяют для 
стерилизации материалов, не выдерживающих воздействия высокой 
температуры, например питательных сред с витаминами и углеводами;

е) стерилизация ультрафиолетовыми лучами. Метод основан на 

бактерицидном действии УФ-лучей с длиной волны 260-300 мкм. Для 
стерилизации воздуха в боксах используют лампы БУВ-15, БУВ-30. 
Обычно облучение проводят 1-2 ч;

ж) фильтрование жидкостей через бактериальные фильтры. 

Этим методом пользуются для освобождения питательных сред, сыворотки крови, витаминов и т. д. от бактерий, но не от вирусов.

Химические методы стерилизации.
При этом методе используют различные химические вещества.

1.3 ХРАНЕНИЕ ВИРУСОВ И ДРУГИХ МАТЕРИАЛОВ, 

УЧЕТ И ЭТИКЕТИРОВКА ИХ В ЛАБОРАТОРИИ

В настоящее время чрезвычайно актуален вопрос биологической 

безопасности работы диагностической лаборатории, который в соответствии с Федеральным законом «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения», санитарно-эпидемиологическими правилами 
«Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности 
(опасности)» СП 1.3.1285-03 и «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами» СП 1.2.731-99, Международным ветеринарным кодексом (2002 г.), Ветеринарным законодательством РФ (М., 2000 г.) с учётом требований санитарно