УДАЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА УСИЛИВАЕТ СПОНТАННЫЙ ЭКЗОЦИТОЗ В НЕРВНО-МЫШЕЧНОМ СИНАПСЕ МЫШИ ЧЕРЕЗ МЕХАНИЗМ ЗАВИСИМЫЙ ОТ НАДФН-ОКСИДАЗЫ

4.
N. E. Sharanova, S. S. Pertsov, N. V. Kirbaeva, et al., Byull. 

Eksp. Biol. Med., 156, No. 11, 532-535 (2013).
5.
Yang P., Gao Z., Zhang H. et al., Neuropsychiatr. Dis. Treat., 11, 

597-607 (2015).
DOI:10.12737/12444

УДАЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА УСИЛИВАЕТ СПОНТАННЫЙ ЭКЗОЦИТОЗ В НЕРВНО
МЫШЕЧНОМ СИНАПСЕ МЫШИ ЧЕРЕЗ МЕХАНИЗМ ЗАВИСИМЫЙ ОТ НАДФН
ОКСИДАЗЫ

Петров А.М., Касимов М.Р., Сычев В.И., Зефиров А.Л.

Кафедра нормальной физиологии Казанского государственного медицинского 

университета (зав. - чл.-корр. РАН А.Л. Зефиров)

fysio@rambler.ru

Ключевые слова: экзоцитоз, холестерин, активные формы кислорода, синапс
Удаление мембранного холестерина с помощью метил-β-циклодекстрина (МЦД) 
угнетает вызванный, но усиливает спонтанный экзоцитоз синаптических 
везикул [1-4]. Механизм этого феномена изучен недостаточно. In
vivo

снижение содержания холестерина может происходить в синаптических 
мембранах в результате усиления нейрональной активности [5]. В мозжечке 
активация ряда протеинкиназ вносит вклад в опосредованное МЦД усиление 
спонтанного экзоцитоза [4]. В нервно-мышечном синапсе лягушки нами было 
показано, что МЦД стимулирует NADPH-оксидазу, продуцирующую активные 
формы кислорода (АФК), которые стимулируют TRPV1-каналы. Вход Са2+ через 
эти каналы активирует фосфатазу PP2B, что частично отвечает за усиление 
спонтанного экзоцитоза [3]. В данном исследовании мы обнаружили роль 
пути 
NADPH-оксидаза/АФК/TRPV1-каналы 
в 
потенциации 
спонтанного 

экзоцитоза в двигательном нервном окончании мыши.
Методика исследования. Эксперименты проведены на диафрагмальной мышце в 
условиях перфузии раствором Кребса (24С, pH
7.4.). Для оценки 

спонтанного экзоцитоза регистрировали миниатюрные потенциалы концевой 
пластики 
(МПКП) 
и 
изменение 
свечения 
маркера 
FM1-43, 
который 

предварительно загружался в синаптические везикулы стимуляцией нерва 3 мин 20Гц [3]. За внутриклеточной продукцией АФК следили с помощью 
маркера H2DCF. Внеклеточный уровень H2O2 определяли, используя AmplexRed
reagent H2O2 assay kit. [Ca2+]i
измеряли с помощью индикатора Fluo-4AM. 

Результаты. Аппликация 1 мМ МЦД не изменяла частоту МПКП и не вызывала 
выгрузку FM1-43 из нервных окончаний. Однако в ответ на перфузию 10 мМ 
МЦД наблюдалось увеличение частоты МПКП, а FM1-43 начинал выходить из 
нервных окончаний. Это указывает на усиление спонтанного экзоцитоза. 
МЦД 1 мМ не изменял свечение H2DCF в синаптическом  регионе, тогда как в 
ответ на 10 мМ МЦД флуоресценция H2DCF быстро возрастала. Обработка 10 
мМ МЦД увеличивала концентрацию H2O2 во внеклеточной среде. Усиление 
флуоресценции H2DCF
и продукции H2O2, вызванные 10 мМ МЦД, полностью 

блокировались ингибиторами NADPH-оксидазы (200 мкМ апоцин, 1 мМ AEBSF), 
но не ингибитором митохондриального комплекса I (5 мкМ ротенон). Это 
указывает на быструю активацию NADPH-оксидазы при удалении холестерина. 
Для проверки участия АФК в усилении спонтанного экзоцитоза использовали 

антиоксидант N-ацетил-L-цистеин (200 мкМ) и апоцинин. Обработка любым 
из этих агентов значительно (но не полностью) угнетала эффект 10 мМ МЦД 
на частоту МПКП и выгрузку FM1-43. Следовательно, АФК, продуцируемые 
NADPH-оксидазой, частично обеспечивают усиление спонтанного экзоцитоза. 
Иммунофлуоресцентно нами было показано, что изоформа NADPH-оксидазы 2, 
чувствительная к апоцинину, локализуется в синаптическом регионе. Одной 
из мишеней АФК в синапсах могут быть TRPV1-каналы [3]. Ингибирование 
этих каналов рутением красным (2 мкМ) или капсазепином (10 мкМ), не 
влияя на увеличение флуоресценции Н2DCF в ответ на аппликацию 10 мМ МЦД, 
подавляло эффекты 10 мМ МЦД на частоту МПКП и выгрузку FM1-43. Это 
указывает на активацию TRPV1-каналов при действии 10 мМ МЦД и их участие 
в усилении спонтанного экзоцитоза. Причем стимуляция TRPV1-каналов не 
влияет на продукцию АФК. Для проверки возможности вызванной АФК 
стимуляции 
TRPV1-каналов 
использовали 
Са2+индикатор. 
10 
мМ 
МЦД 

увеличивали флуоресценцию Fluo4 в синаптическом регионе, что полностью 
блокировалось капсазепином и антиоксидантом. Следовательно, активация 
TRPV1 каналов и увеличение [Ca2+]i. при действии 10 мМ МЦД происходят 
АФК-зависим путем.
Усиление спонтанного экзоцитоза наблюдается только при значительном 
истощении холестерина (10 мМ МЦД) [1, 2]. В естественных условиях такое 
может происходить при сверхвысокой синаптической активности [5]. 
Следовательно, 
активация 
пути 
NADPH-оксидаза/АФК/TRPV1-каналы, 

обнаруженная нами при удалении мембранного холестерина, может быть 
показателем 
усиленной 
нейропередачи. 
Последующая 
интенсификация 

спонтанного экзоцитоза может ограничивать вызванную синаптическую 
передачу через истощение запаса синаптических везикул, десенситизацию 
рецепторов и ингибирование белкового синтеза в синапсе [3]. Мы 
предполагаем, что таким путем может формироваться холестерин-зависимая 
отрицательная обратная связь, способная угнетать вызванный экзоцитоз, 
усиливая спонтанный. Существование и функционирование такой регуляции 
требует дальнейших исследований. Работа поддержана грантом РФФИ 14-0400094.
Литература.
1. Kasimov M.R., Giniatullin A.R., Zefirov A.L., Petrov A.M. // Biochim
Biophys Acta. 2015. V. 1851. № 5. P. 674-685.
2. Petrov A.M., Naumenko N.V., Uzinskaya K.V. et al. // Neuroscience. 
2011. V. 186. P.1-12.
3. Petrov A.M, Yakovleva A.A., Zefirov A.L. // Journal of Physiology. 
2014. V. 592. № 22, P. 4995-5009.
4. Smith A.J., Sugita S., Charlton M.P. // J. Neurosci. 2010. V. 30. № 
17. P. 6116-6121.
5. Sodero A.O., Weissmann C., Ledesma M.D., Dotti C.G. // Neurobiol 
Aging. 2011. V. 32. № 6. P. 1043-1053.

CHOLESTEROL DEPLETION INCREASES SPONTANEOUS EXOCYTOSIS AT THE 

MOUSE NEUROMUSCULAR JUNCTION BY A NADPH OXIDASE DEPENDENT 

MECHANISM

Petrov A.M., Kasimov M.R. Sychev V.I., Zefirov A.L.

Normal Physiology department of Kazan state medical university (chief. 

– A.L. Zefirov)
fysio@rambler.ru 

Keywords: exocytosis, cholesterol, reactive oxygen species, synapse
Cholesterol depletion using methyl-β-cyclodextrin (MCD) suppresses the 
evoked but enhances spontaneous synaptic vesicle exocytosis [1-4]. 
Little is known about the mechanism of the phenomenon. The decrease in 
cholesterol content in vivo can occur
due to intensified neuronal 

activity [5]. At cerebellum the activation of some protein kinase makes 
a contribution to the MCD-induced increase in spontaneous exocytosis 
[4]. Recently, we have shown that MCD stimulates NADPH-oxidase 
dependent reactive oxygen species (ROS) production then the ROS 
activate an influx of Са2+ via TRPV1-channels. The increase in [Ca2+]i 
promotes phosphatase PP2B activation that partially mediates the 
enhancement of spontaneous exocytosis [3]. Our current work revealed 
that, in the mouse nerve terminals, the effect of cholesterol depletion 
on spontaneous exocytosis is dependent on the NADPH-oxidase / ROS / 
TRPV1-channels pathway. 
Materials and Methods.
Experiments were carried out on the diaphragm. The muscles were 
perfused with Krebs solution (24С, pH 7.4.). To estimate the 
spontaneous exocytosis the miniature end plate potentials (MEPPs) and 
changes in fluorescence of FM1-43, preloaded in the nerve terminals by 
a 3-min 20 Hz stimulus train, were registered [3]. Intracellular ROS or 
extracellular H2O2
were measured using a H2DCF DA dye or AmplexRed 

reagent H2O2 assay kit, respectively. Fluo-4-AM was used for detection 
of [Ca2+]i . 
Results.
Application of 1 mM MCD did not change both the frequency of MEPPs and 
FM1-43 fluorescence. However treatment with 10 mM MCD led to an 
increase in the frequency of MEPPs and unloading of FM1-43 from the 
nerve terminals. It indicates on the enhancement of spontaneous 
exocytosis. MCD at low dose had no influence
on H2DCF fluorescence, 

while 10 mM MCD quickly increased the H2DCF fluorescence. In addition, 
the high dose of MCD increased an extracellular H2O2 concentration. 
These MCD-induced changes in the H2DCF fluorescence and H2O2 production 
were completely prevented by inhibitors of NADPH-oxidase (200µM 
apocynin or 1mM AEBSF), but were not sensitive to inhibitor of 
mitochondrial complex I (5 µM rotenone). Probably, the cholesterol 
depletion rapidly activates NADPH-oxidase. To test the involvement of 
ROS in the enhancement of spontaneous exocytosis we used an antioxidant 
N-acetyl-L-cysteine (200µM) and apocynin. Treatment with any of these 
drugs significantly (buy not completely) reduced the effect of 10 mM 
MCD on the frequency of MEPPs and unloading of FM1-43. So,
NADPH
derived 
ROS 
partially 
mediate 
the 
enhancement 
of 
spontaneous 

exocytosis. 
Immunofluorescently, 
the 
NADPH-oxidase 
isoform, 

characterized by a high sensitivity to apocynin, was localized to 
synaptic region. One of the ROS target may be TRPV1
-channels [3]. 

Inhibition of the channels with rhutenium red (2 µM) or capsazepine (10 
µM) suppressed the effects of 10 mM MCD on the MEPPs frequency and FM1

43 unloading, while the MCD-induced increase in H2DCF fluorescence was 
not changed. The data suggest that the MCD application leads to an 
activation of the TRPV1 channels that is implicated in enhancement of 
the spontaneous exocytosis. In addition the stimulation of these 
channels lies downstream of the ROS production in the MCD action. To 
verify a possibility of the ROS-evoked stimulation of the TRPV1 channels 
the Са2+ indicator was used. At the synaptic region, the fluorescence of 
Fluo4 was increased by 10 mM MCD. Capsazepine or antioxidant completely 
inhibits this increase in the fluorescence. Therefore, the activation 
of TRPV1 channels and the rise in [Ca2+]i occur in response to 10 mM MCD 
treatment in a ROS-dependent manner. 
In sum, the exposure to MCD increases the spontaneous exocytosis at 
mouse neuromuscular junction partially through stimulation of NADPHoxidase/ROS/TRPV1
channels pathway. The enhancement of spontaneous 

exocytosis occurs only after strong cholesterol depletion using 10 mM 
MCD [1, 2]. In natural conditions it can be observed at excessive 
synaptic activity [5]. Accordingly, the activation of the NADPHoxidase/ROS/TRPV1-channels pathway due to plasma membrane cholesterol 
depletion may be a sign of the enhanced excitatory synaptic 
transmission. Subsequent intensification of the spontaneous exocytosis 
could limit evoked synaptic transmission via depletion of the synaptic 
vesicle pool, desensitization of the postsynaptic receptors, and 
inhibition of the local protein synthesis [3]. We speculate that such 
mechanism can provide a cholesterol-dependent negative feedback that is 
able to suppress evoked exocytosis via enhancing spontaneous release. 
Further investigations are needed to identify the presence and 
functioning of this regulation. The study was supported for A.M. Petrov 
by RFBR 14-04-00094.
References.
1. Kasimov M.R., Giniatullin A.R., Zefirov A.L., Petrov A.M. // Biochim 
Biophys Acta. 2015. V. 1851. № 5. P. 674-685.
2. Petrov A.M., Naumenko N.V., Uzinskaya K.V. et al. // Neuroscience. 
2011. V. 186. P.1-12.
3. Petrov A.M, Yakovleva A.A., Zefirov A.L. // Journal of Physiology. 
2014. V. 592. № 22, P. 4995-5009.
4. Smith A.J., Sugita S., Charlton M.P. // J. Neurosci. 2010. V. 30. № 
17. P. 6116-6121.
5. Sodero A.O., Weissmann C., Ledesma M.D., Dotti C.G. // Neurobiol 
Aging. 2011. V. 32. № 6. P. 1043-1053.
DOI:10.12737/12445

ХОЛИНЕРГИЧЕСКИЕ НЕЙРОНЫ В СУСПЕНЗИОННЫХ И ТКАНЕВЫХ 

АЛЛОТРАНСПЛАНТАТАХ ЭМБРИОНАЛЬНОГО СПИННОГО МОЗГА КРЫСЫ, 

РАЗВИВАЮЩИХСЯ В ПОВРЕЖДЕННОМ СЕДАЛИЩНОМ НЕРВЕ

Е.С.Петрова, Е.Н.Исаева, Д.Э. Коржевский

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург

Iemmorphol@yandex.ru