ЦИРКУЛИРУЮЩАЯ ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК В СИСТЕМНЫХ МЕХАНИЗМАХ СТРЕССОРНЫХ РЕАКЦИЙ

ЦИРКУЛИРУЮЩАЯ ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК В СИСТЕМНЫХ МЕХАНИЗМАХ 

СТРЕССОРНЫХ РЕАКЦИЙ

Конорова И.Л., Горностаева Г.В., Ершова Е.С., Костюк С.В.,

Вейко Н.Н., Варакин Ю.Я.

ФГБНУ «Научный центр неврологии» (руководитель – член-корр. РАН, 

М.А.Пирадов), Москва, Россия

konorova.irina@yandex.ru

Ключевые слова: внеклеточная ДНК, стресс, эссенциальная артериальная 
гипертензия
Одной из реакций сердечно-сосудистой системы на стресс является 
повышение уровня АД, в хронических случаях приводящее к развитию 
эссенциальной артериальной гипертензии (ЭАГ). В последнее время 
патогенез ЭАГ связывают с воспалением [4]. Критическую роль в инициации 
врожденного иммунитета и воспалительных реакций играют Toll-подобные 
рецепторы, включая рецептор 9 типа (TLR9) [2], который распознаёт 
неметилированные 
CpG-богатые 
последовательности 
бактериальной 
и 

эндогенной ДНК [3]. Мы обнаружили, что у больных ЭАГ циркулирующая в 
крови внеклеточная ДНК (цДНК) обогащена фрагментами транскрибируемой 
области рибосомного повтора (рДНК), который является маркером CpGбогатых последовательностей генома [5]. В экспериментах in
vivo

показано, что только у животных, склонных к эмоциональному стрессу, пул 
цДНК обогащён рДНК, а при стрессе значительно повышается концентрация 
цДНК [1]. В опытах in
vitro
показано, что рДНК в зависимости от 

концентрации 
может 
либо 
усиливать, 
либо 
подавлять 
синтез 
NO

эндотелиальными 
и 
иммунокомпетентными 
клетками. 
Целью
настоящего 

исследования 
было 
выяснение 
вопроса, 
участвуют 
ли 
CpG-богатые 

последовательности генома, накапливающиеся в пуле  цДНК, в системных 
механизмах формирования ЭАГ.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалом служили образцы крови 25 здоровых доноров и 18 больных 

ЭАГ Iи II-й степени по уровню АД (классификация ВОЗ-МОАГ, 1999), 

неотягощенной атеросклерозом, проходивших обследование и лечение в 
ФГБНУ «Научный центр неврологии» (ФГБНУ НЦН). От каждого донора было 
получено письменное согласие на забор крови и использование результатов 
обследования в научных целях. Дизайн исследования образцов крови 
рассмотрен и одобрен этической комиссией ФГБНУ НЦН. В плазме крови 
исследовали концентрацию цДНК методом флуориметрии; концентрацию рДНК и 
содержание рДНК в 1 нг цДНК –
количественной нерадиоактивной дот
гибридизацией; сопротивление току крови (СТК) – по времени протекания 
образцов через стеклянный капилляр в стандартных условиях турбулентного 
потока (Re=8000); агрегацию тромбоцитов, индуцируемую адреналином 
(АТадр) – на лазерном агрегометре «Биола» (Россия). В опытах in vitro
методами флуоресцентной микроскопии и спектрофлуориметрии, используя 
флуоресцентный краситель CuFL, оценивали количество NO
в культуре 

эндотелиальных клеток (HUVEC) после добавления образцов цДНК от 
здоровых доноров и больных ЭАГ. Обработку данных проводили в программе 
“Statistica 6.0”, результаты - в виде Me[25%;75%]. 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

У здоровых доноров
концентрация цДНК составляла 189[117;240] 

нг/мл,  рДНК 0,42[0,32;0,56] нг/мл плазмы, а содержание рДНК в 1 нг 
цДНК – 2,15[1,5;3,7] пг/нг; АТадр составила 40+3%. При этом СТК обратно 
коррелировало с концентрацией цДНК (r= –0,58, p<0,02). У больных ЭАГ Iй степени концентрация цДНК оставалась в пределах нормальных значений 
(101[56; 192] нг/мл), однако концентрация рДНК и ее содержание в 1 нг 
цДНК были значительно повышены (1,12[0,64;1,21] нг/мл и 9,5[2,0;9,9] 
пг/нг, p<0,01 для обоих случаев). Рост концентрации рДНК прямо 
коррелировал с повышением АТадр (r=0,68, p=0,02), составлявшей 52+5%. У 
больных ЭАГ II-й степени
концентрация цДНК значительно превосходила 

нормальные значения (290[179;890] нг/мл, p<0,05), коррелировала с 
повышением АТадр (r=0,62, p=0,004) и сочеталась с высоким уровнем СТК 
(P<0,001).

Добавление в культуру клеток эндотелия 1-5 нг/мл цДНК контрольных 

доноров стимулировало увеличение в 4 раза концентрации NO
как в 

клетках, так и во внеклеточной среде, а цДНК больных ЭАГ, наоборот, 
снижало её в 1,3 –
28 раз. Выявлена обратная экспоненциальная 

зависимость между содержанием рДНК в составе цДНК и концентрацией NO в 
культуре клеток эндотелия (коэффициент линейной регрессии k= –
0,98, 

p<0,0001).

Таким 
образом, 
CpG-богатые 
последовательности 
генома, 

накапливающиеся 
в 
пуле 
цДНК, 
участвуют 
в 
системных 
механизмах 

стрессорных реакций, приводящих к развитию ЭАГ. В норме цДНК 
способствует улучшению кровоснабжения органов и поддержанию нормального 
уровня АД посредством улучшения текучести крови, с одной стороны, и 
стимуляции 
эндотелиальных 
рецепторов 
и 
опосредованной 
NO

вазорелаксации, с другой. Значительное же увеличение содержания CpGбогатых повторов генома в пуле цДНК, с одной стороны, подавляет NOсинтезирующую 
функцию 
эндотелия, 
способствуя 
дефициту 
NO, 

вазоконстрикции и, возможно, являясь причиной эндотелиальной дисфункции 
вначале формирования ЭАГ, а с другой –
повышает АТадр, препятствуя 

кровообращению и способствуя ещё большему повышению АД.

ЛИТЕРАТУРА 

1. Конорова И.Л., Вейко Н.Н. // Бюл. Экспер. Биол. 2012. Т. 153, №3. С. 

281-285.

2. Hanke M.L., Kielian T. // Clin. Sci (Lond). 2011. Vol. 121. P. 367
387.

3. Kumagai Y, Takeuchi O, Akira S. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2008. Vol. 

60. P. 795–804.

4. Montecucco F., Pende A., Quercioli A., Mach F. // JNEPHROL. 2011. 

Vol. 24, N 01. P. 23- 34.

5. Вейко Н.Н., Конорова И.Л.. Неверова М.Е. // Биомедицинская химия. 

2010. Т. 56, вып. 6. С. 686-699. 

CIRCULATING CELL-FREE DNA IN SYSTEMIC MECHANISMS OF STRESS 

REACTIONS

Konorova I.L., Gornostaeva G.V., Ershova E.S., Kostuk S.V.,

Veiko N.N., Varakin Iu.Ia.

*Research Center of Neurology (Director - Сorresponding Member of the 

Russian Academy of Sciences – Piradov M.A.), Moscow, Russia

konorova.irina@yandex.ru

Keywords: cell-free DNA, stress, essential hypertension

Increase 
in 
blood 
pressure 
is 
one 
of 
reactions 
of 
the 

cardiovascular system to stress, leading to the development of 
essential 
hypertension 
(EH) 
in 
chronic 
cases. 
Recently, 
the 

pathogenesis of EH became associated with inflammation [4]. Toll-like 
receptors (TLRs), including the type of receptor 9 (TLR9) [2], which 
recognizes unmethylated CpG-DNA from bacteria and endogenous DNA [3], 
play
the critical role in the induction of innate immune and 

inflammatory responses. We found that in patients with EH cell-free DNA 
(cfDNA) circulating in blood plasma is enriched by transcribed region 
of the ribosomal repeat (rDNA), which is a marker of the genome CpGrich sequences [5]. The in vivo experiment showed that only animals 
predisposed to emotional stress, demonstrate a pool of cfDNA enriched 
rDNA, and stress is accompanied by a significant increase in cfDNA 
concentration [1]. It was shown that the
rDNA depending on the 

concentration can either enhance or inhibit the NO synthesis by 
endothelial and immune cells in vitro. The aim of this study was to 
clarify the question, whether accumulated in pool of cfDNA CpG-rich 
genome sequences are involved in the system mechanisms forming EH.

MATERIALS AND METHODS

Blood samples were obtained from 25 healthy donors and 18 patients 

with EH of the I-st and the II-nd degree on the level of blood pressure 
(WHO classification-ISH 1999), without atherosclerosis, examined and 
treated in Research Center of Neurology (RCN). Written approval for 
blood sampling and the use of survey results for scientific purposes 
was received from each blood donor. Working with blood samples was 
considered and approved by the ethics committee of RCN. Plasma cfDNA 
concentration was examined by fluorimetry; rDNA concentration and 
content of rDNA in 1 ng of cfDNA – by quantitative non-radioactive dot 
hybridization; drug resistance (DR) of blood samples (blood fluidity) –
by the time they pass through a glass capillary under standard 
conditions of turbulent flow (Re = 8000); platelet aggregation induced 
by epinephrine (PA) – using laser aggregometer "Biola" (Russia). In in 
vitro experiments, the amount of NO was evaluated by fluorescence 
microscopy and spectrofluorometry using CuFL fluorescent dye in 
endothelial cell cultures (HUVEC) after addition to the culture medium 
cfDNA samples obtained from healthy donors and patients with EH. The 
data were processed by Statistica 6.0 software, the results
were 

presented as medians and interquartile range (Me[25%;75%]).

In blood plasma of healthy donors the concentration of cfDNA was 

189 [117; 240] ng / ml, of rDNA was 0.42 [0.32; 0.56] ng / ml; the 
content of rDNA in 1 ng of cfDNA was 2.15 [1,5- 3 7] pg / ng; PA was 40 
± 3%. The DR was inversely with the concentration of cDNA (r = -0,58, p 
<0,02). In the blood plasma of patients with the I-th degree EH, cDNA 
concentration remained within normal limits (101 [56; 192] ng / ml), 
but the concentration and content of rDNA in 1 ng of cDNA were 

significantly increased (1.12 [0.64; 1.21] ng / ml and 9.5 [2.0, 9.9] m 
/ ng, p <0,01 in both cases). The increasing concentration of rDNA 
directly correlated with increased PA (r = 0,68, p = 0,02), which was 
52 ± 5%. In the blood plasma of patients with the II-nd degree EH, 
cfDNA concentration was much higher than the normal values (290 [179; 
890] ng / ml, p <0,05 p <0,01), correlating with an increase PA (r = 
0,62, p = 0.004) and combining with an increase in DR (P <0,001).

Addition of cfDNA samples 1-5 ng /ml from the control donors into 

the culture of endothelial cells stimulated 4-fold increase in the NO 
concentration in both cells and extracellular medium, but addition of 
cfDNA samples from hypertensive patients, conversely, reduces it to 
1,3-28 times. There was an inverse exponential relationship between the 
rDNA content in the pool of cfDNA and NO concentration  in the 
endothelial cells culture (linear regression coefficient is k = - 0,98, 
p <0,0001).

Thus, CpG-rich genome sequences accumulating in the pool of cfDNA, 

participate in the system mechanisms of stress reactions that lead to 
the development of EH. Normally, cfDNA promotes to improving blood 
supply to organs and maintaining normal blood pressure, by improving 
the blood flow, on the one hand, and by stimulation of endothelial 
receptors 
and 
NO-mediated 
vasorelaxation, 
on 
the 
other 
hand. 

Significant accumulation of CpG-rich genome repeats in the pool of 
cfDNA inhibits synthesis of NO by endothelial cells, promoting 
vasoconstriction and deficiency of NO, possibly being the cause of 
endothelial dysfunction at the beginning of EH, on the one hand, and 
increases the PA, inhibiting blood circulation and contributing to a 
greater increase in blood pressure, on the other hand.

LITERATURE

1. Konorova I.L., 5.
Veiko N.N. // Bull Exp Biol Med. 2012. Vol. 153, 

No 3. P. 305-308.

2. Hanke M.L., Kielian T. // Clin. Sci (Lond). 2011. Vol. 121. P. 367
387.

3. Kumagai Y, Takeuchi O, Akira S. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2008. Vol. 

60. P. 795–804.

4. Montecucco F., Pende A., Quercioli A., Mach F. // JNEPHROL. 2011. 

Vol. 24, No 01. P. 23- 34.

5. Veiko N.N., Konorova I.L., Neverova M.E. et al. // Biochemistry 

(Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. 2010. Vol. 4, 
No. 3. P. 269-278. 

DOI:10.12737/12385

ПРОЛИФЕРАЦИЯ КЛЕТОК В МОЗГЕ МЫШЕЙ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ 

ОБСТАНОВОЧНОГО УСЛОВНО-РЕФЛЕКТОРНОГО СТРАХА

Копаева М.Ю.*, Ефимова О.И.*, Анохин К.В.*,**

*НИЦ «Курчатовский институт», **ФГБНУ «НИИНФ им. П.К. Анохина», Москва, 

Россия

efimova_oi@nrcki.ru