Молекулярная биология, 2024, № 4

Ɋɨɫɫɢɣɫɤɚɹ ɚɤɚɞɟɦɢɹ ɧɚɭɤ
ɆɈɅȿɄɍɅəɊɇȺə  
ȻɂɈɅɈȽɂə
Ɍɨɦ     ʋ         ɂɸɥɶ±Ⱥɜɝɭɫɬ
Ɉɫɧɨɜɚɧ ɜ  ɝɨɞɭ ȼȺ ɗɧɝɟɥɶɝɚɪɞɬɨɦ
ȼɵɯɨɞɢɬ  ɪɚɡ ɜ ɝɨɞ  
,661 
ɀɭɪɧɚɥ ɢɡɞɚɟɬɫɹ ɩɨɞ ɪɭɤɨɜɨɞɫɬɜɨɦ  
Ɉɬɞɟɥɟɧɢɹ ɛɢɨɥɨɝɢɱɟɫɤɢɯ ɧɚɭɤ ɊȺɇ
Ƚɥɚɜɧɵɣ ɪɟɞɚɤɬɨɪ
ȺȺ Ɇɚɤɚɪɨɜ
Ɋɟɞɚɤɰɢɨɧɧɚɹ ɤɨɥɥɟɝɢɹ
Ⱥȼ Ȼɚɪɚɧɨɜɚ ȼȺ Ƚɜɨɡɞɟɜ Ɇɋ Ƚɟɥɶɮɚɧɞ ɋȽ Ƚɟɨɪɝɢɟɜɚ   
ɆȻ Ƚɨɬɬɢɯ ȼȽ Ⱦɟɛɚɛɨɜ Ɉ Ⱥ Ⱦɨɧɰɨɜɚ
ȼɅ Ʉɚɪɩɨɜ ɡɚɦɟɫɬɢɬɟɥɶ ɝɥɚɜɧɨɝɨ ɪɟɞɚɤɬɨɪɚ ɋɇ Ʉɨɱɟɬɤɨɜ  
Ⱦȼ Ʉɭɩɪɚɲ Ɉɂ Ʌɚɜɪɢɤ ȾȺ Ʌɨɫɶ ɋȺ Ʌɭɤɶɹɧɨɜ ȼȺ Ɇɢɬɶɤɟɜɢɱ  
Ⱥȼ Ɇɨɪɨɡɨɜ ɡɚɦɟɫɬɢɬɟɥɶ ɝɥɚɜɧɨɝɨ ɪɟɞɚɤɬɨɪɚ   
ɋȺ ɇɟɞɨɫɩɚɫɨɜ ȼɋ ɉɪɚɫɨɥɨɜ ɌȺ ɉɪɨɧɢɧɚ ɨɬɜɟɬɫɬɜɟɧɧɵɣ ɫɟɤɪɟɬɚɪɶ
ɈɈ Ɏɚɜɨɪɨɜɚ Ⱥȼ Ɏɢɧɤɟɥɶɲɬɟɣɧ ɉɆ ɑɭɦɚɤɨɜ
Ɋɟɞɚɤɰɢɹ
Ɂɚɜɟɞɭɸɳɚɹ ɪɟɞɚɤɰɢɟɣ ɂȺ ɍɫɚɧɨɜɚ
Ɋɟɞɚɤɬɨɪɵ ȿɘ Ⱦɦɢɬɪɢɟɜɚ Ʌȼ Ɇɨɱɚɥɨɜɚ
ȼɵɩɭɫɤɚɸɳɢɣ ɪɟɞɚɤɬɨɪ ȿɘ Ⱦɦɢɬɪɢɟɜɚ
ɀɭɪɧɚɥ ɜɤɥɸɱɟɧ ɜ ɛɢɛɥɢɨɝɪɚɮɢɱɟɫɤɢɟ ɛɚɡɵ ɞɚɧɧɵɯ
&KHPLFDO $EVWUDFWV &$6 ,QGH[ 0HGLFXV 0HGOLQH %LRORJLFDO DQG $JULFXOWXUHO ,QGH[  
&$% $EVWUDFWV 6&2386 0LFURELRORJ\ $EVWUDFWV 6HFWLRQ % +HDOWK DQG 6DIHW\ 6FLHQFH  
9LURORJ\ DQG $,'6 $EVWUDFWV
Ɍɟɥɟɮɨɧ ɪɟɞɚɤɰɢɢ   (PDLO MUPROELR#JPDLOFRP
 :HE VLWH KWWSZZZPROHFELRUX
Москва
ФГБУ «Издательство «Наука»
‹ Ɋɨɫɫɢɣɫɤɚɹ ɚɤɚɞɟɦɢɹ ɧɚɭɤ 
‹ Ɋɟɞɤɨɥɥɟɝɢɹ ɠɭɪɧɚɥɚ ³Ɇɨɥɟɤɭɥɹɪɧɚɹ ɛɢɨɥɨɝɢɹ´ 
    ɫɨɫɬɚɜɢɬɟɥɶ 

Том 58, номер 4, 2024
СОДЕРЖАНИЕ
ОБЗОРЫ
Современные знания о редактировании оснований и праймированном редактировании 
О. А. Аверина, С. А. Кузнецова, О. А. Пермяков, П. В. Сергиев 
508
Как сместить равновесие репарации разрывов ДНК в пользу гомологичной рекомбинации 
О. А. Аверина, С. А. Кузнецова, О. А. Пермяков, П. В. Сергиев 
525
ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА
Паттерны аминокислотных замен в белках Е6 и Е7 вируса папилломы человека 16 типа: 
филогеография и эволюция  
Е. Е. Зеленова, А. А. Карлсен, Д. В. Авдошина, К. К. Кюрегян, М. Г. Беликова, И. Д. Троценко 
549
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
Способы повышения уровня нокина конструкции, кодирующей пептидный ингибитор слияния 
ВИЧ-1 MT-C34, в локус CXCR4 в Т-клеточной линии CEM/R5  
Д. С. Голубев, Д. С. Комков, М. В. Шепелев, Д. В. Мазуров, Н. А. Круглова 
575
Повышение уровня нокина МТ-С34-кодирующей конструкции в локус CXCR4 с помощью 
модификации донорной ДНК сайтами-мишенями Cas9  
М. В. Шепелев, Д. С. Комков, Д. С. Голубев, С. Е. Боровикова, Д. В. Мазуров, Н. А. Круглова 
590
Чувствительность первичных клеточных линий глиобластомы человека  
к вакцинному штамму вируса паротита    
Е. Ю. Николаева, Ю. Р. Желаева, О. Ю. Сусова, А. А. Митрофанов, В. О. Варачев, Т. В. Наседкина, 
В. В. Зверев, О. А. Свитич, Ю. И. Аммур 
601
Белок CG9609 дрозофилы, содержащий домены цинковых пальцев, взаимодействует 
c деубиквитинирующим (DUB) модулем комплекса SAGA и участвует в регуляции транскрипции 
Ю. В. Николенко, М. М. Куршакова, Д. В. Копытова, Ю. А. Вдовина, Н. Е. Воробьева, А. Н. Краснов 
612
Белки AEF1 и CG10543 дрозофилы, содержащие домены цинковых пальцев, колокализуются 
с комплексами SAGA, SWI/SNF и ORC на промоторах генов и участвуют в регуляции транскрипции 
Ю. В. Николенко, М. М. Куршакова, Д. В. Копытова, Ю. А. Вдовина, Н. Е. Воробьева, А. Н. Краснов 
619
Регуляция трансляции фактора eRF1 человека 
А. В. Шувалов, A. A Клишин, Н. С. Бизяев, Е. Ю. Шувалова, Е. З. Алкалаева 
627
Метаболический профиль кишечной микробиоты и содержание трефоиловых факторов  
у взрослых с различными метаболическими фенотипами ожирения  
И. М. Колесникова, Л. А. Ганенко, И. Ю. Васильев, Т. В. Григорьева,  
Н. И. Волкова, С. А. Румянцев, А. В. Шестопалов 
638
Вирусоподобные частицы на основе Env ВИЧ-1 с модулированным составом гликанов 
Г. А. Каевицер, Е. И. Самохвалов, Д. В. Щебляков, А. Л. Гинцбург, А. Н. Взоров 
655
СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОПОЛИМЕРОВ 
И ИХ КОМПЛЕКСОВ
Молекулярные блокаторы ионных каналов вирусов гриппа A и SARS-CoV-2
Ю. Н. Воробьев 
665

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2024, том 58, № 4, с. 508–524
ВВЕДЕНИЕ
Геномное редактирование CRISPR/Cas – одна 
из наиболее востребованных технологий направленного изменения генома и эпигенома млекопитающих. Благодаря своей простоте, доступности, 
точности, высокой эффективности и огромному 
потенциалу, эта технология активно используется 
для решения различных задач фундаментальной 
биологии, биотехнологии, медицины и сельского 
хозяйства. С помощью геномного редактирования 
DOI: 10.31857/S0026898424040013, EDN: INFPUZ
Современные технологии генной инженерии, такие как редакторы оснований и праймированное 
редактирование, зарекомендовали себя как эффективные и надежные инструменты редактирования 
геномов, которые не требуют внесения двухцепочечных разрывов в молекулу ДНК и наличия 
донорских матриц. Появившись относительно недавно, эти технологии получили быстрое признание 
благодаря своей точности, простоте и возможностям мультиплексирования. В представленном 
обзоре суммированы новые данные об этих технологиях, их архитектуре и методах конструирования 
редакторов, специфичности, эффективности, универсальности. Обсуждаются преимущества, 
недостатки и  перспективы использования редакторов в  фундаментальных и  прикладных 
исследованиях. Сведения, приведенные в обзоре, могут быть востребованы для планирования 
исследований по геномному редактированию и анализа их результатов в ходе решения различных 
задач фундаментальной биологии, биотехнологии, медицины и сельского хозяйства.
Ключевые слова: CRISPR/Cas-технология, редактирование оснований, нуклеозиддезаминазы, 
праймированное редактирование, обратная транскриптаза, системы репарации
Поступила в редакцию 27.11.2023 г.
После доработки 05.01.2024 г.
Принята к публикации 09.01.2024 г.
aИнститут функциональной геномики, Московский государственный университет  
им. М. В. Ломоносова, Москва, 119991 Россия
bНаучно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского,  
Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Москва, 119991 Россия
cХимический факультет, Московский государственный университет  
им. М. В. Ломоносова, Москва, 119991 Россия
*e-mail: svetlana@belozersky.msu.ru
© 2024 г.    О. А. Аверинаa, b, c, С. А. Кузнецоваa, *, О. А. Пермяковa, c, П. В. Сергиевa, b, c
СОВРЕМЕННЫЕ ЗНАНИЯ О  РЕДАКТИРОВАНИИ ОСНОВАНИЙ 
И  ПРАЙМИРОВАННОМ РЕДАКТИРОВАНИИ
УДК 577.21
ОБЗОРЫ
Сокращения: ABE – редактор оснований A→G; BE – редактор оснований (Base Editor); BER – эксцизионная репарация оснований (Base Excision Repair); Cas – CRISPR-ассоциированная нуклеаза; CBE – редактор оснований C→T; 
CGBE – редактор оснований C→G; CRISPR – короткие 
палиндромные повторы, разделенные уникальными последовательностями-спейсерами; crРНК – направляющая 
РНК (crispr RNA); dCas – мутантная форма нуклеазы Cas, 
лишенная ферментативной активности в обоих каталитических доменах (dead или deactivated); DdCBE – редактор 
для замены пары C•G на T•A в дцДНК; EXO1 – экзонуклеаза 1; FEN1 – flap-специфичная эндонуклеаза 1; flap – 
отделенный от основной цепи ДНК “болтающийся/свисающий” олигонуклеотид; HDR – гомологичная рекомбинация (Homologous Recombination); HNH – каталитический 
домен нуклеазы Cas9, вносящий одноцепочечный разрыв 
в целевой участок ДНК и связывающийся со спейсером 
crРНК; MLH1dn  – белок-репрессор MMR-репарации; 
M–MLV RT  – обратная транскриптаза вируса лейкоза 
мышей Молони; MMR – репарация неспаренных нуклеотидов (Mismatch Repair); nCas – мутантная форма нуклеазы Cas, способная разрезать только одну из цепей ДНК 
(nickase); NHEJ – негомологичное соединение концов ДНК 
(Nonhomologous DNA End Joining); NLS – последовательность ядерной локализации; PAM – смежный протоспейсерный мотив (Protospacer Adjacent Motif); PE – праймированное редактирование (Prime Editing); PFS – последовательность нуклеотидов, фланкирующая протоспейсер 
(Protospacer Flanking Sequence); RT – обратная транскриптаза; RuvC – каталитический домен нуклеазы Cas9, вносящий одноцепочечный разрыв в целевой участок ДНК 
(протоспейсер); tracrРНК  – транс-активирующая РНК 
(trans-activating RNA); UGI – ингибитор урацил-ДНК-гликозилазы; UNG – урацил-ДНК-гликозилаза; гРНК – гидовая РНК (sgRNA – single-guide RNA); ДЦР – двухцепочечные разрывы.

 
СОВРЕМЕННЫЕ ЗНАНИЯ О РЕДАКТИРОВАНИИ ОСНОВАНИЙ  
509
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ      том 58      № 4      2024
можно изучать функции генов млекопитающих, 
создавать модели генетических заболеваний и разрабатывать подходы к их коррекции, улучшать значимые для сельского хозяйства виды. Вместе с тем, 
технология CRISPR/Cas не лишена таких недостатков, как относительно высокая вероятность 
образования нецелевых мутаций, зависимость эффективности редактирования целевых участков 
от геномного контекста и структуры хроматина, 
низкая эффективность гомологичной рекомбинации (HDR) и доставки компонентов CRISPR/Cas 
в клетки. Одним из ключевых этапов CRISPR/Cas 
является целенаправленная индукция сайт-специфических двухцепочечных разрывов (ДЦР) в ДНК, 
что приводит к серьезным повреждениям клетки. 
ДЦР могут быть причиной потери сегментов хромосом и хромосомных перестроек, вызывать гибель клеток или возникновение злокачественных 
новообразований. Для повышения эффективности 
и безопасности редактирования разрабатываются новые усовершенствованные версии CRISPR/
Cas. Так, в последние годы появились альтернативные версии редактирования геномов, которые 
не требуют введения ДЦР. К ним относятся новые 
стратегии редактирования оснований и праймированного редактирования, получившие быстрое 
признание благодаря своей точности, простоте 
и возможностям мультиплексирования. Эти подходы основаны на применении химерных белков, 
состоящих из модифицированного белка Cas, не 
способного вносить ДЦР в ДНК, и ковалентно 
связанных с ним ферментов – нуклеозиддезаминазы (редактирование оснований) или обратной 
транскриптазы вируса лейкоза мышей Молони 
(M–MLV RT) (праймированное редактирование). 
В этих технологиях не используются синтетические 
экзогенные донорные молекулы ДНК и дополнительные экзогенные/эндогенные белковые факторы. В настоящем обзоре обобщены современные 
знания о редактировании оснований и праймированном редактировании: описаны общие принципы конструирования редакторов, суммированы 
сведения об их архитектуре, специфичности, эффективности, универсальности. Обсуждаются преимущества, недостатки и перспективы использования этих редакторов в фундаментальных и прикладных исследованиях.
РЕДАКТИРОВАНИЕ ОСНОВАНИЙ
Редактирование оснований – это способ прямого изменения последовательности нуклеотидов 
целевого участка генома. Редактирование проводится путем дезаминирования гетероциклического 
основания в ДНК без введения ДЦР, HDR, в отсутствие донорской матрицы и дополнительных 
экзогенных/эндогенных белковых факторов. Основными составляющими единицами редакторов 
оснований (ВЕ) являются нуклеозиддезаминаза, 
каталитически неактивная Cas-нуклеаза и РНК, 
направляющая комплекс к целевому локусу для 
преобразования пар оснований. Точечные мутации могут быть внесены как в ДНК, так и в транскрипты РНК. В последнем случае происходит прямое редактирование патогенных транскриптов без 
изменения генетической информации. Поскольку 
редактирование РНК носит временный характер, 
в геномной ДНК не возникнут побочные продукты 
или нежелательные мутации, которые могут быть 
переданы дочерним клеткам во время митоза. Такой подход перспективен для лечения заболеваний, 
не имеющих генетического происхождения, и имитации генетических вариантов, которые обеспечивают преимущества для организма [1].
ТРАНСВЕРСИЯ ЦИТИДИНА В ТИМИДИН
Первыми редакторами оснований стали ВЕ, 
обеспечивающие направленное введение замен 
C→T, поскольку природные цитидиндезаминазы, 
входящие в суперсемейство APOBEC/AID, способны на уровне РНК или ДНК дезаминировать C 
до U, имеющего такие же комплементарные свойства, как и T. Первыми охарактеризованными членами этого суперсемейства стали белки APOBEC1 
и AID. Белок APOBEC1 является каталитической 
субъединицей ферментного комплекса, редактирующего мРНК аполипопротеина B. Фермент AID 
играет ключевую роль в соматическом гипермутагенезе и рекомбинации генов иммуноглобулинов 
в В-клетках при переключении классов антител. 
Также в суперсемейство входит группа цитидиндезаминаз APOBEC3 Homo sapiens (hA3), которые 
инактивируют геномы патогенных ретровирусов, таких как вирус иммунодефицита человека, 
с помощью случайных мутаций [2–4]. Цитидиндезаминазы суперсемейства APOBEC/AID сильно различаются по активности дезаминирования 
и  предпочтениям в  отношении нуклеотидного 
окружения мишени. Например, APOBEC1 Rattus 
norvegicus (rAPO1) выбирает ближайших соседей 
в следующем порядке: TC≥CC≥AC>GC [5]. Все 
семь дезаминаз группы hA3, несмотря на их структурное сходство, сильно различаются активностью 
дезаминирования и предпочтениями в отношении 
ДНК-субстрата [6–11]. На базе цитидиндезаминаз 
суперсемейства APOBEC/AID почти одновременно были разработаны три разных ВЕ, которые параллельно прошли схожие пути усовершенствования. Первые ВЕ были сконструированы на основе 
природной rAPO1 и названы редакторами цитидиновых оснований (CBE) [5]. На основе ферментов, 
дезаминирующих ДНК, разработаны редакторы 
Target-AID и TAM. В Target-AID задействован ортолог AID – цитидиндезаминаза Petromyzon marinus 
CDA1 (PmCDA1), объединенная с N-концом каталитической субъединицы dCas или nCas (d/nCas), 
ингибитором урацил-ДНК-гликозилазы (UGI) 

 
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ      том 58      № 4      2024
510 
АВЕРИНА и др.
и гРНК [12]. Редактор TAM сконструирован с использованием цитидиндезаминазы AID, гибридизированной с d/nCas и гРНК, а также при участии 
UGI [13]. Все три ВЕ обладают не только высокой 
эффективностью, но и такими формами индивидуальной специфичности, как температурная чувствительность, размер окна активности, предпочтение нуклеотидной последовательности протоспейсера. Эти различия предполагают, что разные 
редакторы должны дополнять друг друга и обеспечивать возможность выбора [14].
Рассмотрим механизм функционирования первого редактора – CBE [5]. СВЕ первого поколения 
получен путем гибридизации цитидиндезаминазы 
rAPO1 с N-концом неактивной нуклеазы dCas9, 
содержащей мутации, препятствующие образованию ДЦР в ДНК [5]. CBE1 дезаминирует C до 
U, который затем заменяется на T (рис. 1). Однако в технологии CBE1 есть нюанс, снижающий 
эффективность редактирования – это работа урацил-ДНК-гликозилазы (UNG). В нормальных условиях эксцизионная репарация оснований (BER) 
является первичным ответом клетки на несоответствие пары G•U, который инициируется вырезанием U с помощью UNG для предотвращения накопления мутаций в результате спонтанного окислительного дезаминирования C [15]. В процессе 
редактирования оснований промежуточная пара 
G•U может репарироваться клеточной системой 
BER с образованием исходной пары G•C. Поэтому, чтобы защитить урацил, входящий в некомплементарную пару G•U, от удаления с  помощью UNG, CBE1 модифицировали, присоединив 
83-аминокислотный UGI к С-концу комплекса 
rAPO1-dCas9 [5] (рис. 1). UGI включены также 
в Target-AID и TAM [12, 13]. В этой новой версии 
CBE2 урацил не удаляется путем BER с участием 
UNG, что существенно повышает эффективность 
Рис. 1. Схематичное изображение функционирования CBE, осуществляющих трансверсию цитидина в тимидин 
(C→T); ABE, осуществляющих трансверсию аденозина в гуанозин (A→G); CGBE, осуществляющих трансверсию 
цитидина в гуанозин (C→G).

 
СОВРЕМЕННЫЕ ЗНАНИЯ О РЕДАКТИРОВАНИИ ОСНОВАНИЙ  
511
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ      том 58      № 4      2024
редактирования C→T. Для дальнейшего повышения эффективности редактирования разработана 
версия CBE3, в которой вместо неактивной нуклеазы dCas9 используется nCas9 (альтернативное название D10A) [5]. В этом случае разрыв происходит 
в паре G•U недезаминированной (G-содержащей) 
цепи ДНК. Разрыв стимулирует использование дезаминированной (U-содержащей) цепи в качестве 
матрицы для репарации с переходом в промежуточное состояние с  парой A•U, которая в  итоге преобразуется в A•T [16]. Эта модификация, 
а также присоединение второго домена UGI (модификация CBE4) и белка Gam бактериофага Mu, 
который, как известно, защищает концы ДЦР от 
деградации, дополнительно повысило эффективность редактирования C (рис. 1) [17]. Дальнейшее 
усовершенствование ВЕ осуществлено в версии 
CBE4max путем модификации последовательности ядерной локализации (NLS) и оптимизации 
кодонов [18].
Доступный для дезаминазы участок оцДНК-мишени в пределах протоспейсера R-петли, называемый “окном редактирования/активности”, остается критичным звеном целевого редактирования оснований. Классическое окно составляет примерно 
5 из 20 п. н. всего протоспейсера. Это означает, что 
для дезаминирования доступен только C, локализованный между позициями 4 и 8, при этом PAM 
соответствует положениям с 21 по 23 (рис. 1) [5]. 
Расширение окна активности считается одним 
из направлений повышения эффективности редактирования. При этом, если в окне активности 
или в непосредственном окружении присутствуют несколько нуклеотидов-мишеней, то они могут подвергнуться сопутствующей нежелательной 
трансверсии. В связи с этим необходимо учитывать 
оба направления корректировки размера окна активности и выбирать оптимальный в зависимости 
от последовательности протоспейсера в каждом 
эксперименте. На окно активности может влиять 
ряд факторов, например, рядом с целевой последовательностью должен находиться подходящий 
PAM. Так, ВЕ, в которых задействованы d/nCas9 
Streptococcus pyogenes (d/nSpCas9), ограничены редактированием геномных локусов, содержащих 
NGG PAM. Для расширения возможностей редактирования разработаны ВЕ, содержащие ортологи d/nCas9, распознающие PAM, отличные от 
NGG, окно активности которых смещается или 
расширяется до целевых оснований. В  противном случае эти основания становятся недоступными из-за отсутствия оптимального PAM. Варианты ВЕ, созданные на основе разных ортологов 
SpCas9, подробно рассмотрены [14, 19], сопоставлены их активности и размеры окон редактирования. Важно отметить, что у редактора оснований 
Staphylococcus aureus окно редактирования шире, 
чем у S. pyogenes, а именно позиции 3–12, что позволяет редактировать основания, расположенные 
ближе к PAM [20–27]. Интересный вариант Cas9 
с циклической перестановкой (Cas9-CP) изменяет 
локализацию домена нуклеозиддезаминазы по отношению к R-петле и таким образом может обеспечить более эффективное преобразование оснований в более широком окне редактирования [28]. 
BE с  участием Cas12a (Cpf1) распознает TTTV 
PAM для трансверсии C в расширенном до 6 п. н. 
окне редактирования [29]. Напротив, BE, включающий миниатюрный вариант Cas12f (CasMINI), 
имеет очень узкое окно, всего из 2 п. н. [30]. А использование оптимизированной версии nCas12a 
Acidaminococcus sp. демонстрирует улучшенную 
трансверсию C→T [31].
Другим подходом к уменьшению зависимости 
BE от структуры PAM стало создание нуклеазы 
SpRY – структурно модифицированного варианта 
SpCas9. С помощью BE, несущих в своей структуре SpRY, стало возможным воздействовать на гены, 
ранее недоступные для редактирования [32]. Однако такая “релаксация” PAM снижает специфичность и способствует нецелевому редактированию 
оснований ДНК. В таких случаях можно предусмотреть возникновение “опечаток” редактирования и принять ряд мер по нивелированию проблемы. Рассмотрены два типа нецелевых эффектов 
BE: независимые и зависимые от гРНК [33]. Зависимое от гРНК нецелевое редактирование происходит, когда комплекс BE направляется гРНК 
к  последовательностям ДНК, схожим с  протоспейсером. Хотя зависимое от гРНК нецелевое редактирование оснований происходит относительно редко, идентификация этих “опечаток” крайне важна. Для оценки потенциальных нецелевых 
эффектов BE используют полногеномное секвенирование и методы GUIDE-seq [34], Digenomeseq [35] и EndoV-seq [36]. Нивелировать эту проблему можно с  помощью тщательного дизайна 
гРНК с использованием высокоточных вариантов 
Cas и РНП-комплексов для доставки BE в клетки. Возникновение случайных нецелевых мутаций 
также не зависит от гРНК, особенно при высоком 
уровне экспрессии комплекса редактирования, 
и наблюдается существенно реже при использовании дезаминаз AmAPOBEC1, PpAPOBEC1, RrA3F, 
SsAPOBEC3B [37] и YE1 [38]. Сильное влияние 
на уровень нецелевого редактирования оказывает специфика гибридизации дезаминазы с белком 
Cas [39]. Так, при соединении с Cas через N-конец 
опечатки редактирования возникают чаще, чем 
при встраивании редактирующих ферментов в центральную зону (середину) nCas9 (такой вариант 
конструкции называют CE “Cas Embedding”) [40]. 
Логично, что BE с более узкими окнами активности демонстрируют более низкий уровень нецелевого редактирования всего генома, потому что для 
редактирования как в целевых, так и в нецелевых 
сайтах доступно меньше нуклеотидов [38], хотя такой подход часто приводит к компромиссу между 

 
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ      том 58      № 4      2024
512 
АВЕРИНА и др.
эффективностью и  точностью редактирования. 
Как и в случае гРНК-зависимых опечаток BE, снизить независимое от гРНК нецелевое редактирование можно, используя для доставки в клетку РНП 
или мРНК, что ограничивает экспрессию BE по 
времени, уменьшая нецелевое редактирование [37].
На расположение и ширину окна активности, 
точность и специфичность редактирования могут 
влиять различные варианты дезаминазы [11]. Например, классическая дезаминаза rAPO1 в составе 
CBE3 имеет окно активности из 5 п. н. (позиции 
4–8 протоспейсера) [5], но изменения аминокислотных остатков rAPO1, участвующих в катализе 
и связывании ДНК, могут привести к сужению 
окна редактирования. Так, внесение мутаций 
W90Y или W90F в rAPO1 может снижать гидрофобность ее активного центра и, соответственно, 
внутреннее сродство к ДНК. Такие замены уменьшают неспецифическое дезаминирование и  сокращают окно редактирования до 3 п. н., сохраняя 
при этом высокий уровень целевого дезаминирования. Оба варианта мутаций (R126Е и R132Е) 
в rAPO1 влияют на доступность оцДНК, сужают 
окно активности до 3 п. н., но снижают эффективность BE. Показано, что комбинация мутаций 
W90Y и R126E в rAPO1 (эта мутантная rAPO1 названа YE1, или YE), W90Y и R132E (YE2), R126E 
и R132E (EE) приводит к сужению окна активности 
до 2 п. н. при изменении эффективности редактирования в ряду дезаминаз в следующем порядке: 
rAPO1 ≈ YE1 > YE2 ≈ EE. При этом, если пойти 
дальше и ввести в rAPO1 тройную мутацию, объединив W90Y или W90F с R132E и R126E (мутант 
YEE), окно активности не только сократится до 
2 п. н., но область редактирования сконцентрируется на C-6 протоспейсера, если в положении 5 также будет C. В связи с этим упоминается, что у BE, 
в состав которого входит YEE, окно сужается до 1 
п. н. В этой ситуации точность BE сильно повышается, но эффективность при этом резко падает [20]. 
Анализ BE по соотношению “размер окна активности/эффективность редактирования” показал, что 
именно мутация R132E в дезаминазе ответственна 
за снижение эффективности, поэтому исследовали 
и альтернативные варианты мутаций в rAPO1. Так, 
rAPO1 с мутацией Y120F, расположенной вблизи 
активного центра rAPO1 и имеющей решающее 
значение для контакта с  С-мишенью, показала 
высокую эффективность, что подтолкнуло к созданию тройного мутанта rAPO1, аналогичного 
YEE. В итоге эффективность BE, в состав которого 
вошла rAPO1 с мутациями W90Y, Y120F и R126E, 
оказалась сопоставимой с BE4 при сужении окна 
активности до 3 п. н. [41].
Напротив, использование цитидиндезаминазы hA3A расширяет, по разным данным, окно редактирования от 9 (позиции 3–11 протоспейсера) [42] до 12 п. н. (позиции 2–13 протоспейсера) 
и улучшает превращение C→T в метилированных 
областях генома [9]. Включение оцДНК-связывающего домена белка RAD51 между nCas9 и hA3A 
расширяет окно редактирования до 13 п. н. (позиции 3–15(~17) протоспейсера)  [42]. Одновременное включение нескольких доменов дезаминазы в BE увеличивает доступность нуклеотидов 
ДНК-мишени в  R-петле, расширяя тем самым 
окно редактирования. Представителем этой технологии является система “BE-PLUS”, которая включает комплекс nCas9, SunTag, scFv-APOBEC-UGIGB1, гРНК, где SunTag – полипептидный мотив, 
содержащий 10 копий эпитопа GCN4. С SunTag 
специфически взаимодействует одноцепочечный 
вариабельный фрагмент scFv. Таким образом, действующий ВЕ собирается при помощи указанного 
взаимодействия и содержит гРНК, nCas9 и 10 молекул гибридного белка scFv-APOBEC-UGI-GB1. 
При этом для предотвращения агрегации этой 
белковой конструкции используется домен GB1 
G-белка Streptococcus [43]. В свою очередь, аминокислотная замена N57G, привела к повышению 
точности редактирования hA3A. Цитидиндезаминаза eA3A вошла в состав ВЕ третьего поколения 
(BE3). eA3A-BE3 показывает специфичность высокоточного даже по сравнению с описанными ВЕ 
суженного окна редактирования C в мотиве TCR 
(R = A или G) [10]. Вместе с тем проблемой остается высокоточное редактирование C в других мотивах, в частности, в целевых сайтах, содержащих 
несколько остатков C. Решением этой проблемы 
стала модернизация цитидиндезаминазы H. sapiens 
APOBEC3G (hA3G) и создание на базе BE4max редактора eA3G-BE с контекстной специфичностью 
CC. Цитидиндезаминаза hA3G содержит С-концевой каталитический домен и второй псевдокаталитический домен на N-конце, который сохраняет ту 
же пространственную укладку, но не обладает каталитической активностью. В улучшенную версию 
hA3G встроен С-концевой каталитический домен 
(CTD, C-terminal domain), что приводит к образованию hA3G-CTD (eA3G), который преимущественно дезаминирует C в соответствии с иерархией CCC>CCC>CC. Эффективность и точность 
eA3G-BE показана на клетках человека и эмбрионах кролика, что указывает на возможность использования этого редактора в терапии генетических заболеваний и создании животных моделей 
с измененным геномом для фундаментальных и доклинических исследований [44].
Сузить окно редактирования можно также 
с использованием цитидиндезаминазы PmCDA1. 
Target-AID позволяет сузить окно активности до 
4 п. н. (позиции 16–19 протоспейсера) [12]. Кроме того, можно сузить окно редактирования и путем укорачивания дезаминазы PmCDA1 с C-конца, что приводит к  возможности выборочного 
редактирования C в положениях 15 или 16 протоспейсера [45]. Укорачивание PmCDA1 не только 

 
СОВРЕМЕННЫЕ ЗНАНИЯ О РЕДАКТИРОВАНИИ ОСНОВАНИЙ  
513
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ      том 58      № 4      2024
с С-конца, но и с N-конца способствует снижению ее сродства к ДНК, сводя тем самым к минимуму неспецифическое дезаминирование C. Одновременное усечение N- и C-концов приводит 
к уменьшению количества участков с “открытыми” 
гидрофобными остатками, что делает поверхность 
дезаминазы более “гладкой”, а внесение мутаций 
W122E и W139Q в эти гидрофобные остатки значительно повышает активность модернизированной цитидиндезаминазы (tCDA1EQ). В tCDA1EQ 
был удален UGI, в присутствии которого увеличивалась скорость мутаций. Поскольку tCDA1EQ 
имеет низкое сродство к ДНК и менее стабильна, 
чем исходная PmCDA1, архитектура ее присоединения к nCas9 может влиять на редактирующую 
активность. Для минимизации данной проблемы 
tCDA1EQ можно не только соединить с N-концом 
nCas9, но и встроить в середину этого белка. Действительно, tCDA1EQ, присоединенная к N-концу 
nCas9, показала нестабильную эффективность редактирования, тогда как версия, встроенная внутрь 
nCas9, имела стабильно высокую эффективность, 
сравнимую с Target-AID. Cтруктура “tCDA1EQ-Nконец nCas9” была названа AID-2S, где 2S означает “Small & Specific” (маленький и специфичный), 
а встроенная в nCas9 – AID-3S, где 3S это “Small 
& Specific & Superior” (маленький, специфичный 
и улучшенный). Показано, что AID-2S имеет более 
узкую область редактирования, тогда как у AID-3S 
окно активности сдвинуто в сторону последовательности PAM по сравнению с исходным TargetAID. Эффективность AID-2S и AID-3S находилась 
на уровне Target-AID, YE1 и YE2, при этом нецелевые эффекты были значительно снижены [46].
Использование улучшенной цитидиндезаминазы AID в составе ВЕ четвертого поколения, eAIDBE4max, обеспечивает окно редактирования из 11 
п. н. и редактирование C в контексте GC [47], а использование нескольких егРНК (последовательности crРНК, связанные линкерной петлей с каркасной последовательностью tracrРНК), позволяет 
еще больше расширить окно редактирования [13].
Окно редактирования может быть изменено также путем изменения ориентации доменов в составе 
ВЕ и/или свойств связывающего их линкера [11]:
x  В  целом, дезаминазы, присоединенные 
к N-концу d/nCas9, имеют более широкие окна 
редактирования, чем присоединенные к C-концу, 
поскольку эта ориентация обеспечивает, вероятно, более легкий доступ к оцДНК внутри R-петли [48, 49]. В структурах, где дезаминаза встроена в середину nCas, размер окна редактирования 
будет варьировать в зависимости от положения 
дезаминазы в белке [28, 39]. Предполагается, что, 
уменьшение расстояния между дезаминазой и белком Cas9 приводит к более точному позиционированию дезаминазы на последовательности-мишени [45, 48].
x  Модификация линкера между дезаминазой и  белком Cas путем укорачивания линкера 
и/или изменения его свойств, например увеличения жесткости, приводит к сужению окна активности при сохранении высокой эффективности 
редактирования  [11, 48]. Однако укороченный 
линкер не влияет существенно на окно редактирования [10, 20].
С целью внесения случайных мутаций в заранее 
выбранные участки генома разработана стратегия, 
использующая CRISPR-направляемые ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразы способны создавать 
все 12 замен, а также делеции. Так, ДНК-полимеразы, транслирующие одноцепочечный разрыв 
ДНК, способны инициировать синтез на одноцепочечном разрыве дцДНК, замещая расположенные по ходу репликации нуклеотиды, т. е. в сторону 
3'-конца, а их flap-эндонуклеазный домен впоследствии разрушает смещенные нуклеотиды, оставляя 
лигируемый одноцепочечный разрыв. ДНК-полимеразы, транслирующие одноцепочечный разрыв ДНК, участвуют в конструировании новых 
BE. Показано, что введение в nCas9 трех мутаций 
(K848A, K1003A и R1060A), способствующих диссоциации комплекса nCas9 с ДНК после разрыва 
целевого локуса, увеличивает частоту целевых мутаций. Усовершенствованная версия nCas9 названа 
enCas9. В итоге гибридизация enCas9 с N-концом 
ДНК-полимеразы I Escherichia coli (PolI), несущей 
мутации D424A, I709N и A759R (PolI3M), привела 
к созданию enCas9-PolI3M, названной EvolvR. По 
сравнению с использованием направленного мутагенеза на основе dCas9-AIDx, где окно редактирования заключено в пределах 5 п. н., EvolvR способна непрерывно диверсифицировать все нуклеотиды в пределах настраиваемой длины окна, до 
350 п. н., в определяемых локусах. Следовательно, 
nCas9-PolI3M генерирует более широкий спектр 
замещающих мутаций, чем dCas9-AIDx, что применимо для крупномасштабных генетических 
скрининговых исследований [50, 51].
Эффективность направленного мутагенеза дополнительно повышается при использовании 
CRISPR-X. В  CRISPR-X неактивная нуклеаза 
dCas9 и цитидиндезаминаза AID взаимодействуют посредством MS2-шпилек и MS2-связывающих белков. Две шпильки MS2, входящие в состав егРНК, рекрутируют два MS2-связывающих 
белка, которые соединены с  AID, лишенной 
С-конца (ΔAID). Использование MS2-ΔAID ограничивает локализацию AID в  ядре и  улучшает 
эффективность мутагенеза по сравнению с полноразмерным AID. Более того, гиперактивный 
вариант AID с  усиленной активностью соматической гипермутации увеличивал скорость мутагенеза до ~1/1000 оснований. Экспериментально 
показана возможность использования CRISPR-X 
в  направленной эволюции GFP в  усиленный 

 
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ      том 58      № 4      2024
514 
АВЕРИНА и др.
GFP с более высокой интенсивностью излучения 
(eGFP), а также для идентификации вариантов генов, устойчивых к бортезомибу [52]. Кроме того, 
CRISPR-X использовали для получения моноклональных антител человека с повышенной аффинностью к антигену в клетках HEK293 [53].
В  качестве альтернативного подхода к  увеличению точности редактирования можно рассматривать систему нековалентного привлечения цитидиндезаминазы к конкретной геномной 
С-мишени. Этот подход предполагает отход от 
классического ковалентного взаимодействия дезаминазы с Cas9, которое неразрывно связывает события дезаминирования C как на целевых 
участках генома, так и на близлежащих нежелательных мишенях. Напротив, нековалентное связывание должно способствовать разделению событий редактирования на целевом сайте и рядом 
с ним, тем самым повышая вероятность точных 
мутаций с заменой одного основания. Ключевыми игроками этой системы становятся белки, которые связывают дезаминазу, не блокируя активный сайт от взаимодействия с С-мишенью. Эти 
белки, связанные с комплексом Cas9n/гРНК, используются для привлечения коэкспрессируемого 
фермента APOBEC для редактирования. По ассоциации с физическим процессом магнетизма эта 
технология была названа “магнитным редактором” (MagnEdit) [54].
ТРАНСВЕРСИЯ АДЕНОЗИНА В ГУАНОЗИН
Альтернативным подходом в разработке BE стало использование дезаминаз A. Редактор основания A (ABE) включает nCas, аденозиндезаминазу, 
гРНК и функционирует подобно CBE3. Комплекс 
ABE связывается с ДНК-мишенью, после чего аденозиндезаминаза катализирует превращение A→I, 
создавая из T•A пару Т•I, которая путем репарации неспаренных оснований (MMR) последовательно превращается в C•I и затем в C•G. Отсутствие природной ДНК-аденозиндезаминазы для 
нацеливания и перехода A→G привело к созданию 
из тРНК-аденозиндезаминазы E. coli (TadAwt), мутантного варианта TadA*, способного эффективно дезаминировать около 53% остатков A в ДНК 
(рис. 1). Создано несколько поколений ABE, которые различаются вводимыми в гомодимер TadA 
мутациями  [55]. Среди них выделяют наиболее 
эффективные ABE6.3, ABE7.8, ABE7.9 с  окнами редактирования 3 п. н. (позиции 8–10 протоспейсера) и ABE7.10 с окном редактирования из 
4 п. н. (позиции 4–7 протоспейсера). ABE7.10 состоит из гетеродимера TadA*-TadAwt, она обеспечивает высокоэффективное редактирование A 
в линиях клеток мышей [56] и человека [55]. Активность ABE7.10 была дополнительно повышена 
путем модификации NLS и оптимизации кодонов 
до версии ABEmax [18]. Стратегии изменения окна 
активности ABE развивались таким же путем, как 
и в CBE. Окно редактирования в зависимости от 
поставленной экспериментальной задачи можно 
сузить, вводя, например, мутацию F148A в домен 
TadA [57], или расширить, используя Cas9-CP [28], 
а также SpRY [32]. Подход с заменой классического 
SpCas9 ортологами позволил осуществлять трансверсию A→C в геномных сайтах, содержащих неNGG PAM [22, 58]. Например, для создания ABE, 
действующих на сайты, содержащие NNNRRT 
и NGA PAM, соответственно, nSpCas9 был заменен 
на nSaKKH или nSpCas9-VQR в ABE7.10 и ABEmax. 
При этом Sa-ABEmax и SaKKH-ABEmax имеют 
большое окно редактирования (позиции 4–14 протоспейсера), хотя эффективность редактирования 
невысока [28, 59]. Использование xCas9 (вариант 
SpCas9), созданного для работы с широким спектром последовательностей PAM [26], в ABE7.10 
и  ABEmax позволило распознавать широкий 
спектр последовательностей не-NGG PAM, включая 
NR, NG, GAA и GAT [28]. Однако в отличие от усовершенствованных версий CBE, ABE, содержащие 
ортологи SpCas9, имели более низкую эффективность редактирования оснований, чем канонический ABE, потому что белок TadA был изначально 
усовершенствован и представлен в виде гибрида 
с SpCas9. В следующей версии ABE8 гетеродимер 
TadA*-TadAwt не содержит TadAwt, а TadA* дополнен 
восьмью новыми мутациями, что позволило улучшить кинетику дезаминирования. Удаление TadAwt 
не влияет на активность редактирования ABE8 
и указывает на то, что новые аденозиндезаминазы TadA-8e и TadA-8s могут эффективно работать 
как мономеры [34, 60]. Так, эффективность ABE8 
с TadA-8e была выше, чем у ABE7.10 при сочетании 
дезаминазы не только с SpCas9, но и с SpnCas9-NG, 
SaCas9, SaCas9-KKH, LbCas12a, enAsCas12a, а окно 
активности было шире (позиции 3–10 протоспейсера) [60]. ABE8 с TadA-8s также показал высокую эффективность редактирования в сочетании 
с SaCas9 и SpCas9-NG [34]. Менее эффективной по 
сравнению с TadA-8, но не менее интересной является новая версия аденозиндезаминазы, в которую 
добавили мутации V82G и A56G, а также удалили 
TadAwt из гетеродимера. Смысл этой двойной мутации заключается в том, что замена V82G (версия 
miniABE) нивелирует неспецифическое сродство 
к РНК-субстратам [61], представляющее проблему как для ABE, так и CBE, которые могут индуцировать независимое от гРНК редактирование 
оснований РНК в масштабах всего транскриптома  [62]. Однако мутация V82G также снижает 
сродство TadA к ДНК-субстратам, что в результате отрицательно влияет на эффективность редактирования. Поэтому для увеличения сродства 
к ДНК-мишени в miniABE добавили вторую мутацию A56G. Полученная TadA-A56G&V82G эффективно редактировала ДНК-мишени и характеризовалась сниженной нецелевой активностью 

 
СОВРЕМЕННЫЕ ЗНАНИЯ О РЕДАКТИРОВАНИИ ОСНОВАНИЙ  
515
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ      том 58      № 4      2024
дезаминирования РНК [63]. Дополнительно с модификациями ABE можно ознакомиться в работе 
Jeong Y. K. и соавт. [14].
ТРАНСВЕРСИЯ ЦИТИДИНА В ГУАНОЗИН
Следующей ступенью в развитии технологии 
ВЕ стала трансверсия C→G. Сначала был получен 
GBE, состоящий из nCas9, цитидиндезаминазы 
и UNG. После дезаминирования и образования 
остатка дезоксиуридина UNG вырезает урацил, 
что приводит к появлению AP-сайта. В то же самое время nCas9 вносит одноцепочечный разрыв, 
создавая предпосылки для удлинения 3'-конца разрыва с использованием в качестве матрицы цепи 
ДНК, содержащей AP-сайт. В трансверсии C→G 
в клетках млекопитающих участвует rAPO1. Система rAPOBEC-nCas9-UNG показала высокую 
специфичность редактирования в шестой позиции 
протоспейсера, эффективность которой составила 5.3–53.0% [64]. Параллельно на основе платформы BE4max был разработан ВЕ C→G [65]. На 
первом этапе из BE4max удалили две UGI и получили BE4maxΔUGI, что привело к увеличению 
количества трансверсий C→G; при этом также наблюдалось наиболее эффективное редактирование 
в шестом положении протоспейсера [65]. В качестве цитидиндезаминазы была выбрана rAPO1 
с мутацией R33A и сниженной нецелевой активностью редактирования РНК и ДНК [62]. Добавление 
к N-концу BE4maxΔUGI ортолога UNG из E. coli 
(eUNG) привело к формированию BE4max(R33A)
ΔUGI, названной CGBE1 (рис.  1). Однако ВЕ 
CGBE1, несмотря на высокую эффективность целевого редактирования C→G, оказался довольно 
громоздким, поэтому пришлось его значительно уменьшить, удалив домен eUNG, что привело 
к умеренному снижению эффективности и получению нового редактора miniCGBE1 [65].
Кроме UNG-опосредованной трансверсии 
C→G [64, 65], где количество переходов C•G→G•C 
прямо зависит от генерации AP-сайтов, разработан новый редактор CGBE, основанный на манипулировании репарацией ДНК после создания 
AP-сайта. Так, при создании AP-сайта в Cas9-индуцированной R-петле клеточный фермент UNG 
замещается эндонуклеазой APE1, после чего белок 
XRCC1 (X-ray repair cross-complementing protein 1), 
Рис. 2. Схематичное изображение редактирования оснований в дцДНК; синхронной трансверсии A→G и C→T в одном целевом сайте (A&C-BE, ACBE); одновременного введения четырех типов трансверсий: C→G, C→T, C→A, A→G, 
а также InDel на одной и той же цепи ДНК в сайтах-мишенях (AGBE).