НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ТРЕХМЕРНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В МОЗГЕ МЫШЕЙ
Бесплатно
Основная коллекция
Издательство:
НИИ ноpмальной физиологии им. П.К. Анохина
Год издания: 2015
Кол-во страниц: 3
Дополнительно
Скопировать запись
Фрагмент текстового слоя документа размещен для индексирующих роботов
References: 1. Lebedev M.Yu., Sholkina M.N., Znivtsov O.P // Fundamental Research. – 2013. № 12. P. 45-48. 2. Lambert C., Ibrahim M., Iobagiu C., Genin C. // J. Clin. Immunol. – 2005. – Vol. 25, № 5. – P. 418–427. 3. Nascimbeni M., Shin E.C., Chiriboga L. et al., // Blood. – 2004. – Vol. 104, № 2. – P. 478–486. DOI:10.12737/12345 НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ТРЕХМЕРНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В МОЗГЕ МЫШЕЙ Ефимова О.И.*, Анохин К.В.*,** *НИЦ «Курчатовский институт», **ФГБНУ «НИИНФ им. П.К. Анохина», Москва, Россия efimova_oi@nrcki.ru Ключевые слова: мозг, экспрессия генов, оптическое просветление, LUMOS Ориентация современных нейробиологических исследований и биомедицинской диагностики на анализ крупномасшабных нейронных сетей [2,4,5] требует разработки новых методов трехмерной микроскопии, обеспечивающей визуализиацию всего мозга и его структур с клеточным разрешением. Микроскопическая визуализация интактных нейрональных сетей в образцах целого мозга требует их оптической прозрачности и сохранности их трехмерной структуры, тонкой морфологии и флуоресцентных меток. В последнее время был разработан целый ряд методик получения оптически просветленных биологических образцов (напр., Scale, CLARITY, SeeDB, CUBIC, PARS, iDISCO и др.) [1,3]. Однако, у каждого из предлагаемых способов есть определенные ограничения. Для решения этих проблем мы разработали новый просветляющий состав LUMOS (LUminocity Maintaining Opticlearing Solution). LUMOS позволяет быстро проводить трехмерный микроскопический анализ генетически кодируемых флюоресцентных белков в целых структурах (гиппокамп, некортекс, обонятельные луковицы и др.) фиксированного мозга взрослых мышей. В отличие от других способов оптического просветления, при которых наблюдается уменьшение или увеличение линейных размеров биологического образца, водный раствор LUMOS не вызывает деформации ткани, сохраняя нативную трехмерную информацию. LUMOS сохраняет флуоресцентный сигнал репортерных белков в интактных структурах не менее 1 года. Двухстепенчатая процедура оптического просветления LUMOS, не требующая дорогих реактивов и оборудования, менее чем за 2 дня позволяет сделать образцы мозга равномерно прозрачными для последующей трехмерной микроскопии с клеточным разрешением и автоматического подсчета флюоресцентно меченых мишеней. Мы показали, что разработанный подход позволяет визуализировать флюоресцентные репортерные белки в препаратах целого мозга взрослых мышей трансгенных линий Thy1-EGFP, картировать локализацию вирусного вектора, кодирующего GFP, трансдуцированного в мозг мыши, а также проводить количественный анализ индуцированной новым
опытом экспрессии c-Fos-GFP и Zif/268-GFP в мозге взрослых мышей после обучения условно-рефлекторному замиранию. Таким образом, LUMOS позволяет проводить широкомасштабный трехмерный флюоресцентный анализ структур мозга с клеточным разрешением, который может пролить свет на структуру и функции распределенных нейрональных сетей. ЛИТЕРАТУРА 1. Eberle A.L., Selchow O., Thaler M., et al. // Microscopy (Oxf). 2015. V. 64. I.1. P. 45-55. 2. Jorgenson L.A., Newsome W.T., Anderson D.J., et al. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2015. V. 370. I. 1668. P. 20140164. 3. Marx V. // Nat. Meth. 2014. V. 11. P. 1209–1214. 4. Okano H., Miyawaki A., Kasai K. // Philos. Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2015. V. 370. I. 1668. P. 20140310. 5. Vousden D.A., Epp J., Okuno H., et al. // Brain. Struct. Funct. 2015 V. 220. I. 4. P. 2043-57. NEW APPROACHES TO 3D FLUORESCENCE IMAGING OF GENE EXPRESSION IN MOUSE BRAIN Efimova O.I.*, Anokhin K.V.*,** *National Research Center «Kurchatov Institute»; **P.K. Anokhin Research Institute of Normal Physiology, Moscow, Russia efimova_oi@nrcki.ru Key Words: brain, gene expression, optical clearing, LUMOS Development of new 3D imaging methods for visualization of whole organs at cellular resolution should have a great impact on neuroscience research and biomedical diagnostics [2,4,5]. Microscopic visualization of entire neuronal networks in unsectioned brain specimens requires their optical transparency and preservation of their three-dimensional structure and fine morphology. A number of approaches have been recently developed to obtain optically transparent biological samples, including Scale, CLARITY, SeeDB, CUBIC, PARS, iDISCO and etc. [1,3]. However, each of these techniques has certain limitations. To address these problems, we developed a new clearing agent termed LUMOS (LUminocity Maintaining Opticlearing Solution). LUMOS enables fast three-dimensional optical imaging of genetically encoded fluorescent proteins in brain structures (e.g. hippocampus, neocortex, olfactory bulb) from the fixed adult brain. Unlike other clearing methods which may be compromised from shrinkage or expansion of the biological sample, the water-based LUMOS does not cause distortion of the tissue and retains its native three-dimensional information. LUMOS preserves fluorescent signals of reporter proteins in the intact structures for at least 1 year. Two-step low-cost LUMOS clearing procedure requires less than two days and renders brain structures uniformly transparent, allowing their subsequent 3D microscopy with cellular resolution and automatic counting of fluorescently labeled targets. We have shown that this approach enables imaging of the entire adult Thy1-EGFP mouse brain. It also allows three-dimensional localization of GFP-encoding
viral vector transduced into the mouse brain as well as fast quantitation of experience-induced expression of c-Fos-GFP and Zif/268GFP brain after fear conditioning in mice. Thus, LUMOS enables highthroughput 3D fluorescent analysis of brain structures at cellular resolution which may shed light on the structure and functions of large neuronal circuits. ЛИТЕРАТУРА 1. Eberle A.L., Selchow O., Thaler M., et al. // Microscopy (Oxf). 2015. V. 64. I.1. P. 45-55. 2. Jorgenson L.A., Newsome W.T., Anderson D.J., et al. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2015. V. 370. I. 1668. P. 20140164. 3. Marx V. // Nat. Meth. 2014. V. 11. P. 1209–1214. 4. Okano H., Miyawaki A., Kasai K. // Philos. Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2015. V. 370. I. 1668. P. 20140310. 5. Vousden D.A., Epp J., Okuno H., et al. // Brain. Struct. Funct. 2015 V. 220. I. 4. P. 2043-57. DOI:10.12737/12346 ИССЛЕДОВАНИЕ ОБОНЯТЕЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЕЕ ВЛИЯНИЯ НА ВЫРАЖЕННОСТЬ ТРЕВОЖНО-ДЕПРЕССИВНЫХ РАССТРОЙСТВ У ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ ПАРКИНСОНА Жукова И.А., Никитина М.А., Жукова Н.Г., Алифирова В.М., Ижболдина О.П. ¹ Кафедра неврологии и нейрохирургии (зав. – д-р. мед. наук, проф. В.М. Алифирова) ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, Томск irzhukova@inbox.ru Представлены результаты исследования обонятельной дисфункции и ее влияния на выраженность тревожно-депрессивных расстройств у пациентов с болезнью Паркинсона. В ходе исследования было выявлено, что у пациентов с болезнью Паркинсона наиболее часто встречается сочетание гипосмии с субклинически выраженной тревогой и депрессией, а аносмии с более тяжелыми проявлениями тревожно-депрессивных расстройств. Ключевые слова: болезнь Паркинсона, обоняние, тревога, депрессия Болезнь Паркинсона (БП) одна из наиболее распространенных нейродегенеративных патологий, занимающая второе место по частоте встречаемости (после болезни Альцгеймера) у пожилых пациентов [2]. Заболевание характеризуется широким спектром моторных и немоторных проявлений, значительно снижающих качество жизни пациентов, а на поздних стадиях, приводящих к глубокой инвалидизации. В связи с отсутствием общепризнанных специфических инструментальных и лабораторных методов диагностики БП, диагноз выставляется только на основании имеющихся двигательных нарушений, возникающих при гибели более 80% клеток черной субстанции. Литературные данные последних лет свидетельствуют, что у подавляющего большинства пациентов на доклинической стадии присутствуют те или иные немоторные расстройства (вегетативная дисфункция, запоры, депрессия и нарушение обоняния) [1].