Биофизика, 2024, № 4

ɊɈɋɋɂɃɋɄȺə ȺɄȺȾȿɆɂə ɇȺɍɄ
 
ȻɂɈɎɂɁɂɄȺ
 
Ɍɨɦ 69    ɜɵɩ. 4    2024    ɂɸɥɶ—Ⱥɜɝɭɫɬ
ɀɭɪɧɚɥ ɨɫɧɨɜɚɧ ɜ ɹɧɜɚɪɟ 1956 ɝɨɞɚ
ȼɵɯɨɞɢɬ 6 ɪɚɡ ɜ ɝɨɞ
ISSN: 0 
006-3029
1956-1962 ɝɝ. — ɝɥ. ɪɟɞ. Ⱥ.Ɇ. ɄɍɁɂɇ
1962-1976 ɝɝ. — ɝɥ. ɪɟɞ. Ƚ.Ɇ. ɎɊȺɇɄ
19 
76-1977 ɝɝ. — ɝɥ. ɪɟɞ. Ʌ.Ⱥ. ȻɅɘɆȿɇɎȿɅɖȾ
197 
7-1989 ɝɝ. — ɝɥ. ɪɟɞ. Ⱥ.Ⱥ. ɄɊȺɋɇɈȼɋɄɂɃ
1989-2022 ɝɝ. — ɝɥ. ɪɟɞ. ȿ.ȿ. ɎȿɋȿɇɄɈ
ɀɭpɧ 
ɚɥ ɢɡɞɚɟɬɫɹ ɩɨɞ pɭɤɨɜɨɞcɬɜɨɦ
Ɉɬɞɟɥɟɧɢɹ ɛɢɨɥɨɝɢɱɟcɤɢx ɧɚɭɤ ဂȺɇ
Ƚɥɚɜɧɵɣ ɪɟɞɚɤɬɨɪ
ɉ.ə. Ƚɪɚɛɚɪɧɢɤ
Ɋɟɞɚɤ 
ɰɢɨɧɧɚɹ ɤɨɥɥɟɝɢɹ
ȼ.ɋ. Ⱥɤɚɬɨɜ, ȼ.Ƚ. Ⱥɪɬɸɯɨɜ, Ⱥ.Ɏ. ȼɚɧɢɧ, ɂ.Ɇ. ȼɢɯɥɹɧɰɟɜ,
Ɉ.ȼ. Ƚɚɥɡɢɬɫɤɚɹ, ɇ.Ƚ. ȿɫɢɩɨɜɚ (ɨɬɜɟɬɫɬɜɟɧɧɵɣ ɫɟɤɪɟɬɚɪɶ), ȼ.Ɇ. Ʉɨɦɚɪɨɜ,
Ɇ.ɋ. Ʉɨɧɞɪɚɬɶɟɜ, ɇ.ɂ. Ʉɭɤɭɲɤɢɧ, ȼ.ɘ. Ɇɚɤɟɟɜ, Ⱦ.ɘ. ɇɟɱɢɩɭɪɟɧɤɨ,
Ɉ.ɇ. Ɉɡɨɥɢɧɶ, ɇ.ȼ. ɉɟɧɶɤɨɜ, ɋ. ɉɟɬɪɨɜɫɤɢɣ, ɂ.ɘ. ɉɟɬɪɭɲɚɧɤɨ,
Ƚ.ɘ. Ɋɢɡɧɢɱɟɧɤɨ, Ⱥ.Ȼ. Ɋɭɛɢɧ, ȿ.ɂ. ɋɥɨɛɨɠɚɧɢɧɚ, Ⱥ.ɂ. ɋɭɲɤɨɜ,
ȼ.Ⱥ. Ɍɜɟɪɞɢɫɥɨɜ, ȼ.Ƚ. Ɍɭɦɚɧɹɧ, ɋ.ɇ. ɍɞɚɥɶɰɨɜ,
ȿ.ȿ. Ɏɟɫɟɧɤɨ ɦɥ. (ɡɚɦɟɫɬɢɬɟɥɶ ɝɥɚɜɧɨɝɨ ɪɟɞɚɤɬɨɪɚ), ȿ.ə. Ɏɪɢɫɦɚɧ,
Ʉ.ȼ. ɒɚɣɬɚɧ (ɡɚɦɟɫɬɢɬɟɥɶ ɝɥɚɜɧɨɝɨ ɪɟɞɚɤɬɨɪɚ), Ɇ.Ƚ. ɒɚɪɚɩɨɜ
Ɋɟɞɚɤ 
ɰɢɨɧɧɵɣ ɫɨɜɟɬ
Ɏ.ɂ. Ⱥɬɚɭɥɥɚɯɚɧɨɜ, ɘ.Ⱥ. ȼɥɚɞɢɦɢɪɨɜ, ɂ.Ⱦ. ȼɨɥɨɬɨɜɫɤɢɣ,
Ⱥ.ɘ. Ƚɪɨɫɛɟɪɝ, Ⱥ.Ƚ. Ⱦɟɝɟɪɦɟɧɞɠɢ, Ƚ.Ɋ. ɂɜɚɧɢɰɤɢɣ, Ⱥ.Ⱥ. Ʉɪɚɫɧɨɜɫɤɢɣ,
Ⱥ.Ⱥ. Ɇɚɤɚɪɨɜ, Ⱦ.ɂ. Ɋɨɳɭɩɤɢɧ, Ⱥ.Ȼ. Ɋɭɛɢɧ, ȼ.Ɉ. ɋɚɦɨɣɥɨɜ,
ȿ.ȿ. Ɏɟɫɟɧɤɨ, Ⱥ.ȼ. Ɏɢɧɤɟɥɶɲɬɟɣɧ, Ɇ.Ⱦ. Ɏɪɚɧɤ-Ʉɚɦɟɧɟɰɤɢɣ
Ɂɚɜɟɞɭɸɳɚɹ ɪɟɞɚɤɰɢɟɣ Ɇ.Ⱥ. ɉɭɰɟɧɤɨɜɚ
Ⱥɞɪɟɫ ɪɟɞɚɤɰɢɢ: 142290, ɉɭɳɢɧɨ, ɉɪɨɫɩ. ɇɚɭɤɢ, 3, ɨɮ. 226
Ɍɟɥɟɮɨɧ +7(963)698-77-22
E-mail: biophysica1@mail.ru
Ɇɨɫɤɜ 
ɚ
ɎȽȻɍ  
«ɂɡɞɚɬɟɥɶɫɬɜɨ «ɇɚɭɤɚ»
© Ɋɨɫɫɢɣɫɤɚɹ ɚɤɚɞɟɦɢɹ ɧɚɭɤ 2024
© Ɋɟɞɤɨɥɥɟɝɢɹ ɠɭɪɧɚɥɚ
    «Ȼɢɨɮɢɡɢɤɚ» (ɫɨɫɬɚɜɢɬɟɥɶ) 2024

СОДЕРЖАНИЕ
Том 69, номер 4, 2024
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА
Кинетика окисления 3-аминопиридин-2(1H)-онов пероксидом водорода 
в присутствии пероксидазы хрена
В.С. Шубина, Ю.В. Шаталин, А.Л. Шацаускас, А.С. Фисюк 
695
Природа межмолекулярных взаимодействий, влияющих на олигомеризацию 
никазы Nt.BspD6I
В.Н. Антипова, А.К. Юнусова, Р.И. Артюх
701
Влияние катехинов на образование фибрилл коллагена in vitro
Ю.С. Тараховский, С.Г. Гайдин, Ю.А. Ким
707
Инновационные биофизические подходы к экстракции кверцетина 
из растительной клетки
А.Г. Погорелов, Л.Г. Ипатова, А.И. Панаит, А.А. Станкевич,
А.К. Юнусова, В.Н. Погорелова
715
Бесконтактная атомно-силовая микроскопия для исследования биомолекул в жидкости
Т. Мамедов, А. Швирст, М.В. Федотова, Г.Н. Чуев
723
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ
Влияние TRO19622 (олесоксимa) нa функциональную активность изолированных 
митохондрий и выживаемость клеток
А.И. Ильзоркина, Н.В. Белослудцева, А.А. Семёнова,
М.В. Дубинин, К.Н. Белослудцев
737
Эволюция представлений о механизмах гипервозбудимости нейронных сетей 
и пачечной активности при эпилепсии. Вклад активации калием 
калий-проводящих каналов в гиперактивацию сетей
А.С. Галашин, М.В. Конаков, В.В. Дынник
747
Степень специфичности синаптических контактов при нейротрансплантации
З.Н. Журавлева
758
Ротенон, родамин 123 и краситель янус зеленый индуцируют повреждение 
ядерной ДНК в клетках асцитных опухолей мышей, ротенон и родамин 
в Х-облученных клетках спобствуют сохранению целостности генома
Е.А. Кузнецова, Н.П. Сирота
766
Адаптационная самозащита зрелых клеток от повреждений базируется 
на эффекте Варбурга, де-дифференцировке клеток и их устойчивости к гибели 
П.М. Шварцбурд
778
Параптоз и другие типы неапоптотической регулируемой гибели клеток
М.Е. Соловьева, Ю.В. Шаталин, В.С. Акатов
786

Повышение лекарственной устойчивости клеток острого лимфоидного лейкоза 
в трехмерных высокоплотных клеточных культурах
Д.Ю. Штатнова, М.И. Кобякова, Я.В. Ломовская, Е.И. Фетисова,
К.С. Краснов, Р.С. Фадеев
805
БИОФИЗИКА CЛОЖНЫX CИCТЕМ
Белки гепатопанкреаса краба-стригуна и камчатского краба, обладающие 
антибактериальной активностью
В.Г. Молчанов, А.Е. Егоров, Д.А. Осетрина, В.Ю. Новиков, Н.М. Новожилов, 
А.А. Тимченко, Е.А. Согорин, М.А. Тимченко
810
Тета-осцилляции и компараторная функция гиппокампа 
В.Ф. Кичигина
821
Адренергическая регуляция функции миокарда и сосудов в условиях гипотермии
М.Х. Галимова, А.С. Аверин

Сравнительное исследование кардиопротекторных свойств уридин-5>-монофосфата 
и уридина в модели повреждения миокарда крыс с помощью изопреналина
Н.В. Белослудцева, Т.А. Урюпина, Д.А. Хуртин, Н.В. Хундерякова, Г.Д. Миронова
846
1H-ЯМР-спектроскопия плазмы крови для детекции изменений в метаболизме 
при развитии саркомы М-1 у крыс
А.Е. Егоров, А.С. Быков, Т.И. Пономарева, М.В. Молчанов, Н.М. Панкратова,
А.Н. Панкратов, А.Г. Аракелян, С.Н. Корякин, М.А. Тимченко
856
Молекулярные механизмы флэш-эффекта в радиобиологии
С.И. Глухов, Е.А. Кузнецова
868
Результаты флэш-облучения мышей in vivo протонами высокой энергии
А.Е. Шемяков, А.Р. Дюкина, С.И. Заичкина, А.В. Агапов, 
Г.В. Мицын, К.Н. Шипулин

Особенности действия протонов с энергией 90–170 Мэв на органы кроветворения 
при тотальном облучении мышей тонким сканирующим пучком в зависимости 
от линейной потери энергии частиц
О.М. Розанова, Т.А. Белякова, Е.Н. Смирнова, С.С. Сорокина, А.Р. Дюкина, 
А.Е. Шемяков, Н.С. Стрельникова

Проникновение полифенолов через кожу, поврежденную уксусной кислотой 
В.С. Шубина, Ю.В. Шаталин

Эффект синхронизации сердечного ритма человека с вариациями геомагнитного поля: 
существуют ли выделенные частоты?
Т.А. Зенченко, Н.И. Хорсева, А.А. Станкевич

ДИСКУССИИ
Роль биофизики в современных науках о жизни
Г.Р. Иваницкий
927

Contents
Vol. 69, No. 4, 2024
Molecular Biophysics
Kinetics of Oxidation of 3-Aminopyridin-2(1H)-ones by Hydrogen Peroxide 
in the Presence of Horseradish Peroxidase
 V.S. Shubina, Yu.V. Shatalin, A.L. Shatsauskas, and A.S. Fisyuk
695
The Nature of Intermolecular Interactions Affecting Oligomerization 
of Nt.BspD6I Nickase
 V.N. Antipova, А.К. Yunusova, and R.I. Artyukh
701
Effects of Catechins on the Formation of Collagen Fibrils in vitro
 Yu.S. Tarahovsky, S.G. Gaidin, and Yu.A. Kim
707
Innovative Biophysical Approaches for Quercetin Extraction from Plant Cells
 A.G. Pogorelov, L.G. Ipatova, A.I. Panait, A.A. Stankevich,
A.K. Yunusova, and V.N. Pogorelova
715
Noncontact Atomic Force Microscopy for Studying Biomolecules in Liquids
 T. Mamedov, A. Shvirst, M.V. Fedotova, and G.N. Chuev
723
Cell Biophysics
Effect of TRO19622 (Olesoxime) on the Functional Activity of Isolated Mitochondria 
and Cell Viability
 A.I. Ilzorkina, N.V. Belosludtseva, A.A. Semenova, M.V. Dubinin, and K.N. Belosludtsev
737
Evolution of Ideas about the Mechanisms of Neuronal Network Hyperactivation 
and Burst Firing in Epilepsy. Contribution of Potassium-Induced Activation 
of Potassium-Conducting Channels to Network Hyperactivation
 A.S. Galashin, M.V. Konakov, and V.V. Dynnik
747
Degree of Specificity of the Synaptic Contacts during Neurotransplantation
 Z.N. Zhuravleva
758
Rotenone, Rhodamine 123 and Janus Green Induce Damage to Nuclear DNA in Ascites 
Tumor Cells from Mice, Rotenone and Rhodamine in X-Irradiated Cells Contribute
to the Maintenance of Genome Integrity
 E.A. Kuznetsova and N.P. Sirota
766
Adaptive Self-Defense of Mature Cells against Damage Is Based on the Warburg Effect, 
De-Differentiation of Cells and Resistance to Cell Death
 P.M. Schwartsburd
778
Paraptosis and Other Types of Non-Apoptotic Regulated Cell Death
 M.E. Solovieva, Yu.V. Shatalin, and V.S. Akatov
786
Increased Drug Resistance in Acute Lymphoblastic Leukemia Cells
in Three-Dimensional High-Density Cell Cultures
 D.Yu. Shtatnova, M.I. Kobyakova, Y.V. Lomovskaya, E.I. Fetisova,
K.S. Krasnov, and R.S. Fadeev
805

Complex Systems Biophysics
Hepatopancreatic Proteins of Snow Crab and Red King Crab with Antibacterial Activity
 V.G. Molchanov, A.Y. Yegorov, D.A. Osetrina, V.Yu. Novikov, N.M. Novojilov, 
A.A. Timchenko, E.A. Sogorin, and M.A. Timchenko
810
Theta Oscillations and Comparator Function of the Hippocampus
V.F. Kitchigina
821
Adrenergic Regulation of the Functioning of the Cardiovascular System 
under Hypothermic Conditions
 M.H. Galimova and A.S. Averin
836
Study of the Cardioprotective Properties of Uridine-5'-Monophosphate and Uridine 
in a Rat Model of Myocardial Damage Induced by Isoprenaline
 N.V. Belosludtseva, T.A. Uryupina, D.A. Khurtin, N.V. Khunderyakova, and G.D. Mironova
846
 1H-NMR Spectroscopy of Blood Plasma for Detection of Changes in Metabolism 
during the Development of Sarcoma M-1 in Rats
 A.Y. Egorov, A.S. Bykov, T.I. Ponomareva, M.V. Molchanov, N.M. Pankratova, 
A.N. Pankratov, A.G. Arakelyan, S.N. Koryakin, and M.A. Timchenko
856
Molecular Mechanisms of FLASH Effect in Radiobiology
S.I. Glukhov and E.A. Kuznetsova
868
Results of FLASH Irradiation of Mice in vivo with High-Energy Protons
 A.E. Shemyakov, A.R. Dyukina, S.I. Zaichkina, A.V. Agapov, 
G.V. Mitsyn, and K.N. Shipulin
887
Features of the Effects of Exposure to 90–170 MeV Proton Radiation on the Blood-Forming
Organs in Mice under Total Irradiation with Proton Pencil Scanning Beam Depending 
on the Linear Energy Transfer of Particles
 O.M. Rozanova, T.A. Belyakova, E.N. Smirnova, S.S. Sorokina, A.R. Dyukina,
A.E. Shemyakov, and N.S. Strelnikova
895
Penetration of Polyphenols through Acetic Acid-Damaged Skin 
 V.S. Shubina and Yu.V. Shatalin
906
The Effect of Synchronizing the Human Heart Rhythm with Geomagnetic Field Variations: 
Are There Distinguished Frequencies?
 T.A. Zenchenko, N.I. Khorseva, and A.A. Stankevich
915
Discussion
 The Role of Biophysics in Modern Life Sciences
 G.R. Ivanitskii
927

БИОФИЗИКА, 2024, том 69, № 4, с. 695–700
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОФИЗИКА 
УДК 57.037; 547.823
КИНЕТИКА ОКИСЛЕНИЯ 3-АМИНОПИРИДИН-2(1H)-ОНОВ 
ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА В ПРИСУТСТВИИ ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА
© 2024  г.   В.С. Шубина*, #, Ю.В. Шаталин*, А.Л. Шацаускас**, ***, А.С. Фисюк**, ***
*Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН,
Институтская ул., 3, Пущино Московской области, 142290, Россия
**Омский государственный технический университет, просп. Мира, 11, Омск, 644050, Россия
***Омский государственный университет им. Ф.М. Достоевского, просп. Мира, 55а, Омск, 644077, Россия
#E-mail: shubinavictoria@yandex.ru
Поcтупила в pедакцию 12.03.2024 г.
Поcле доpаботки 12.03.2024 г.
Пpинята к публикации 03.07.2024 г.
Целью данного исследования являлась оценка кинетических параметров окисления некоторых
3-аминопиридин-2(1H)-онов пероксидом водорода, катализируемого пероксидазой хрена, и сродства пероксидазы хрена к данным соединениям. Было показано, что окисление 3-аминопиридин2(1H)-онов подчиняется кинетике псевдопервого порядка. Также было обнаружено гиперболическое снижение наблюдаемой константы скорости реакции (kobs) с увеличением исходной концентрации 3-аминопиридин-2(1H)-онов. Зависимость kobs от концентрации фермента носила прямолинейный характер, свидетельствуя в пользу конкурентного ингибирования окисления продуктом
реакции. Было обнаружено, что увеличение полярности заместителя в 4-м положении приводит к
увеличению скорости окисления пиридинонов. Значения Vmax/Km также были выше для соединений, несущих полярные заместители в 4-м положении. Данный кинетический параметр (Vmax/Km)
отражает субстратную специфичность фермента. Полученные данные проясняют механизмы взаимодействия пероксидазы хрена и 3-аминопиридинонов и говорят о том, что 3-аминопиридиноны
могут быть использованы для разработки чувствительных методов детекции пероксида водорода и
модификации методик иммунно-ферментного анализа. 
Ключевые слова: 3-аминопиридин-2(1H)-он, флуоресцентные красители, пероксидаза хрена, кинетика
окисления, субстратная специфичность.
DOI: 10.31857/S0006302924040012,  EDN: NIOTCS
сутствии пероксида водорода. Стехиометрия
HRP-катализируемого окисления 3-аминопиридин-2(1H)-онов пероксидом водорода составляет
1 : 1. Пределы обнаружения пероксида водорода и
HRP (LODH2O2 и LODHRP) в системах, содержащих исследуемые флуорофоры, лежат в диапазоне наномолярных концентраций и сопоставимы с
соответствующими пределами обнаружения в системах, содержащих красители, используемые в
наборах 
для 
иммуноферментного 
анализа
(табл. 1) [2].
Пероксидаза хрена (HRP) представляет собой
гликопротеин, относящийся к суперсемейству
растительных пероксидаз и получивший широкое распространение в медико-биологических
исследованиях. Данный фермент катализирует
одноэлектронное окисление субстратов в присутствии пероксида водорода. Образование/разрушение в результате реакции окрашенных, флуоресцентных или люминесцентных соединений
позволяет использовать данный фермент при иммуноферментном детектировании белков, нуклеиновых кислот и ряда низкомолекулярных соединений [1]. Недавно нами был разработан способ
синтеза новых флуорофоров, обладающих высоким квантовым выходом и изменяющих оптические свойства в процессе их окисления (рис. 1)
[2]. Было установлено, что отдельные соединения
являются субстратами HRP и окисляются в приТаким образом, полученные нами данные свидетельствует о том, что 3-аминопиридиноны могут быть использованы для разработки чувствительных методов детекции пероксида водорода и
модификации методик иммуноферментного анализа. Для выявления структурных особенностей,
необходимых для наиболее эффективного взаимодействия фермента с 3-аминопиридин-2(1H)онами, в рамках данной работы были изучены киСокращение: HRP – пероксидаза хрена.
695

ШУБИНА и др.
Рис. 1. Схема синтеза новых 3-аминопиридин-2(1H)-онов.
тилсульфоксиде, их концентрации определяли
спектрофотометрически, используя следующие
коэффициенты экстинкции [2]: 8.9·103 М–1см–1
нетические параметры HRP-катализируемого
окисления пиридинонов пероксидом водорода и
проведена оценка сродства HRP к данным соединениям.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
(С1), 6.9·103 М–1см–1 (С2), 9.7·103 М–1см–1 (С3),
9.8·103 М–1см–1 (С4), 8.3·103 М–1см–1 (С5) и
8.8·103 (С6) М–1см–1. Свежие растворы красителей, HRP и H2O2 готовили перед каждым экспериментом.
Все растворы были приготовлены на дистиллированной воде, дополнительно очищенной на
установке Milli-Q (Millipore, США). HRP (P8375)
приобретен в компании Sigma-Aldrich (США).
HRP растворяли в 20 мМ фосфатно-солевом буфере, pH 7.4 (A403/A275 = 2.8–3.0), концентрацию
фермента определяли спектрофотометрически
(ε403 = 100 мМ–1см–1) [3]. Пероксид водорода
(30%) приобретен в компании «Реахим» (Россия).
Концентрацию пероксида водорода подтверждали спектрофотометрически (ε240 = 39.4 М–1см–1
HRP-катализируемое окисление 3-аминопиридин-2(1H)-онов пероксидом водорода. Измерения
проводили при 37°С на микропланшетном ридере
Infinite F200 (Tecan, Австрия) в 96 луночных
планшетах (Greiner 655076). Длина волны экстинкции – 360 ± 25 нм, длина волны эмиссии –
465 ± 25 нм. Реакционная смесь содержала
NaH2PO4/Na2HPO4 (20 мМ, pH 7.4), HRP (36 нМ
(0.25 Ед/мл)), исследуемые соединения (6.3, 12.5,
25.0, 50.0 и 100 мкМ), и пероксид водорода (6.3,
12.5, 25.0, 50.0, 85.0 и 100.0 мкМ). Измерения проводили до тех пор, пока интенсивность флуоресценции не достигала некоторого постоянного
[4]). Синтез 3-аминопиридин-2(1H)-онов осуществляли как описано ранее [2]. Стоковые растворы флуорофоров (100 мМ) готовили в димеТаблица 1. Пределы обнаружения пероксида водорода и HRP в системах, содержащих исследуемые флуорофоры [2]
Флуорофор
LODH2O2, нМ
LODHRP, нМ
С1
8.97 ± 1.01
2.45 ± 0.45
С2
11.45 ± 4.61
2.92 ± 0.63
С4
7.78 ± 3.75
3.40 ± 1.06
С5
3.17 ± 0.70
1.58 ± 0.44
С6
6.84 ± 2.79
7.45 ± 2.19
Примечание. В отличие от других соединений стехиометрия HRP-катализируемого окисления С3 пероксидом 
водорода не соответствовала стехиометрии 1 : 1. Поэтому пределы обнаружения пероксида водорода и HRP в 
системе, содержащей С3, не определены [2].
БИОФИЗИКА 
 том 69 
 № 4 
 2024

КИНЕТИКА ОКИСЛЕНИЯ 3-АМИНОПИРИДИН-2(1H)-ОНОВ
697
Рис. 2. Кинетика окисления 3-аминопиридин-2(1H)-онов в присутствии пероксида водорода и пероксидазы хрена.
(а) – Характерные кривые изменения относительной интенсивности флуоресценции соединения 6 во времени в
присутствии различных концентраций пероксида водорода. Концентрация соединения 6 составляла 100 мкМ.
Концентрация пероксидазы хрена составляла 36 нМ (0.25 Ед/мл). (б) – Зависимость наблюдаемой константы
скорости (kobs) от концентрации соединения. Константы скорости псевдопервого порядка определяли по изменению
концентрации соединений во времени в присутствии 50 мкМ пероксида водорода. На врезке – зависимость
наблюдаемой константы скорости (kobs) от концентрации фермента. Концентрация соединений составляла 100 мкМ,
пероксида водорода – 50 мкМ. (в) – Зависимости Лайнуивера–Берка для исследуемых соединений. Концентрация
пероксида водорода составляла 50 мкМ. (г) – Значения Vmax/Km для структурно близких 3-аминопиридин-2(1H)-онов.
Концентрация пероксида водорода составляла 50 мкМ. Представлено среднее значение ± стандартное отклонение в
пяти независимых экспериментах. * – Достоверные различия по сравнению с C1–C3 и C6, p < 0.05; # – достоверные
различия по сравнению с С3 и C6, p < 0.05.
значения или выходила на базовый уровень. В
первом случае H2O2, добавленный к смеси, полностью расходовался в реакции HRP с флуоресцентным соединением. Во втором случае соединение, присутствующее в смеси, практически
полностью окислялось системой HRP/H2O2. Изменения интенсивности флуоресценции соединений были пересчитаны в изменения концентраций соединений. Проведено пять независимых экспериментов.
стант скоростей использовали данные по окислению зондов в присутствии 50 мкМ пероксида водорода. Нелинейная аппроксимация изменения
концентрации флуорофора от времени проводилась по уравнению экспоненциально затухающей
кривой: C = C0e–kt + Скон, где C0 – исходная концентрация флуорофора в растворе в мкМ, k – наблюдаемая константа псевдопервого порядка в
мин–1, t – время в минутах, Скон – остаточная концентрация флуорофора в системе после выхода реакции на стационарный уровень. Расчет параметров аппроксимации осуществляли с использоваОпределение констант скоростей окисления
3-аминопиридин-2(1H)-онов. Для оценки конБИОФИЗИКА 
 том 69 
 № 4
 2024

ШУБИНА и др.
ции 3-аминопиридин-2(1H)-онов (рис. 2б). Такая ситуация, в частности, может наблюдаться,
когда скорость лимитирующей стадией является
мономолекулярный процесс или в случае конкурентного ингибирования продуктом реакции [6].
В пользу последнего свидетельствует прямолинейная зависимость наблюдаемой константы
скорости реакции от концентрации фермента
(врезка на рис. 2б) [6, 7]. Для дальнейшего анализа полученных данных строили график зависимости начальной скорости реакции от концентрации флуоресцентного соединения в координатах
Лайнуивера–Берка. Было показано для всех соединений, что данная зависимость является линейной при различных (но постоянных) концентрациях пероксида водорода. В качестве примера
на рис. 2в приведены графики Лайнуивера–Берка для исследуемых соединений в присутствии
50 мкМ пероксида водорода. Как видно из рисунка, данные соединения можно ранжировать в соответствии с величиной Vmax/Km, которая определяется по тангенсу угла наклона прямой (равному 
Km/Vmax) 
и 
отражает 
субстратную
специфичность фермента. На рис. 3 также представлены графики Лайнуивера–Берка для исследуемых соединений в присутствии различных
концентраций пероксида водорода (6.25, 12.5, 25
и 100 мкМ), а также полученные значения
Vmax/Km.
нием программного пакета QtiPlot 0.9.8.9. Далее
строили график зависимости наблюдаемой константы скорости от концентрации исследуемых
пиридинонов. Так как обнаружено гиперболическое снижение наблюдаемой константы скорости
реакции (kobs) с увеличением исходной концентрации 3-аминопиридин-2(1H)-онов, в дальнейшем для прояснения механизма взаимодействия
пиридинонов с HRP была проведена оценка зависимости наблюдаемой константы скорости реакции от концентрации HRP.
Влияние концентрации HRP на наблюдаемые
константы скорости окисления 3-аминопиридин2(1H)-онов. Для оценки использовались данные
по окислению зондов в присутствии исследуемых
соединений в концентрации 100 мкМ, пероксида
водорода в концентрации 50 мкМ и HRP в различных концентрациях (144, 72, 36, 18 и 9 нМ, что
соответствует 1, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 Ед/мл соответственно). Далее строили график зависимости
наблюдаемой константы скорости от концентрации HRP. Проведено пять независимых экспериментов.
Определение начальной скорости окисления
3-аминопиридин-2(1H)-онов. 
Начальную 
скорость реакции определяли по углу наклона прямолинейного участка зависимости концентрации
флуорофора от времени реакции.
Оценка сродства HRP к 3-аминопиридин2(1H)-онам. Для сравнительной оценки сродства
фермента к исследуемым флуорофорам использовали значения Vmax/Km (константа специфичности (kcat/Km), умноженная на концентрацию
фермента) [5]. Для этого строили зависимость
Лайнуивера−Берка и по углу наклона (Km/Vmax)
определяли соответствующую величину. Данные
представлены как среднее значение ± стандартное отклонение пяти независимых экспериментов, p = 0.05.
Сравнение кинетики окисления 3-аминопиридин-2(1H)-онов пероксидом водорода свидетельствуют об увеличении скорости окисления
при замене фенильного заместителя в 4-м положении (С1) на диметоксифенильный (С4) или
тиофеновый (С5), в этом же ряду увеличивается
специфичность фермента к субстрату (Vmax/Km).
Введение в структуру 3-аминопиридинона (С1)
алкильного заместителя при аминогруппе либо
не влияет на кинетику окисления и стехиометрию
процесса (С2), либо приводит к снижению скорости окисления и увеличению количества окислителя, требуемого для полного окисления зонда
(С3). Введение фурилметильного заместителя
при аминогруппе (С6) также приводит к замедлению процесса окисления. Полученные кинетические данные также свидетельствуют в пользу того, что окисление исследуемых 3-аминопиридин2(1H)-онов конкурентно ингибируется продуктом реакции.
Таким образом, увеличение полярности заместителя в 4-м положении приводит к увеличению
скорости окисления и субстратной специфичности фермента, тогда как наличие заместителей
при аминогруппе в 3-м положении, в целом, приводит к снижению данных параметров (скорости
окисления и субстратной специфичности). В целом, полученные данные проясняют механизмы
взаимодействия HRP и 3-аминопиридинонов и
говорят о том, что 3-аминопиридиноны могут быть
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 2а приведены характерные кривые изменения относительной интенсивности флуоресценции соединения С5 во времени в присутствии
различных концентраций пероксида водорода.
Так как концентрация флуоресцентного соединения уменьшается со временем, уменьшается относительная интенсивность флуоресценции –
I/I0. Однако по истечении некоторого времени
данное соотношение практически перестает изменяться, свидетельствуя о том, что один из компонентов системы полностью расходуется в реакции. Было показано, что окисление данных соединений подчиняется кинетике псевдопервого
порядка. Было обнаружено гиперболическое
снижение наблюдаемой константы скорости реакции (kobs) с увеличением исходной концентраБИОФИЗИКА 
 том 69 
 № 4 
 2024

КИНЕТИКА ОКИСЛЕНИЯ 3-АМИНОПИРИДИН-2(1H)-ОНОВ
699
Рис. 3. Сравнение кинетических параметров окисления 3-аминопиридин-2(1H)-онов в присутствии пероксидазы
хрена и пероксида водорода в различных концентрациях. Левый столбец: зависимости Лайнуивера–Берка для
исследуемых соединений в присутствии различных концентраций пероксида водорода: 6.25 мкМ (а), 12.5 мкМ (в),
25 мкМ (д), 100 мкМ (ж). Правый столбец: значения Vmax/Km, полученные для структурно близких пиридинонов в
присутствии различных концентраций пероксида водорода: 6.25 мкМ (б), 12.5 мкМ (г), 25 мкМ (е), 100 мкМ (з).
Представлено среднее значение ± стандартное отклонение в пяти независимых экспериментах. * – Достоверные
различия по сравнению с C1–C3 и C6, p < 0.05; § – достоверные различия по сравнению с С2, С3 и C6, p < 0.05; # –
достоверные различия по сравнению с С3 и C6, p < 0.05.
БИОФИЗИКА 
 том 69 
 № 4
 2024