Биохимия, 2024, № 3

Российская академия наук
БИОХИМИЯ
том 89 №  3 2024 март
Журнал основан А.Н. БАХОМ в 1936 г.
Выходит 12 раз в год
ISSN 0320-9725
Издается под научно-методическим руководством
Отделения биологических наук РАН
Главный редактор
О.А. ДОНЦОВА (Москва) 
Редакционная коллегия: 
А.А. БАЙКОВ (Москва), Д. БАЛТИМОР (Нью-Йорк), А.А. БОГДАНОВ (Москва), 
Е.А. БОНЧ-ОСМОЛОВСКАЯ (Москва), В.И. БУНИК (Москва), А.В. БУРАКОВ (Москва), 
А.Б. ВАРТАПЕТЯН (Москва), С.Д. ВАРФОЛОМЕЕВ (Москва), А.В. ВОРОТНИКОВ (Москва), 
А.Г. ГАБИБОВ (Москва), А. ГАЛКИН (Нью-Йорк), В.А. ГВОЗДЕВ (Москва), Н.В. ГНУЧЕВ (Москва), 
Н.В. ГУЛЯЕВА (Москва), Н.Б. ГУСЕВ (Москва), С.Е. ДМИТРИЕВ (зам. главного редактора, Москва), 
А.В. ЖЕРДЕВ (Москва), А.А. ЗАМЯТНИН (Москва), Р.А. ЗИНОВКИН (Москва), 
О.В. КАРПОВА (Москва), Ю.А. КНИРЕЛЬ (Москва), П.Б. КОПНИН (Москва), А. КОТЛЯР (Тель-Авив), 
Д.В. КУПРАШ (Москва), В. МАРШАНСКИЙ (Бостон), С.А. МОШКОВСКИЙ (Геттинген, Германия), 
Х. МИХЕЛЬ (Франкфурт-на-Майне), Р.Д. ОЗРИНА (отв. секретарь, Москва), Е.Ю. ПЛОТНИКОВ (Москва), 
В.О.ПОПОВ (Москва), С.В. РАЗИН (Москва), А. СТАРКОВ (Нью-Джерси), 
В.И. ТИШКОВ (Москва), Б.В. ЧЕРНЯК (Москва), Р. ЮСЕФИ (Шираз)
Редакция:
Зав. редакцией А.Е. ЕВСТИГНЕЕВА
Научные редакторы А.И. СОРОЧКИНА, Е.Р
. ШУВАЛОВА
Журнал включен в библиографические базы данных Biochemistry 
and Biophysics Citation Index, Biological Abstracts, BIOSIS Database, 
Chemical Abstracts, Chemical Title, Current Contents/Life Science, Excerpta 
Medica, Index Internacional de Cardiologie, Index Medicus (MEDLINE), 
International Abstracts of Biological Sciences, The ISI Alerting Services, 
Science Citation Index, Science Citation Index Expanded, SCOPUS, Compendx
Электронная почта: biochem@pran.ru
Москва
ФГБУ «Издательство «Наука»
© Российская академия наук, 2024
© Редколлегия журнала «Биохимия» (составитель), 2024

СОДЕРЖАНИЕ
Том 89, № 3, 2024
Механизм ингибирования алармонсинтетаз микобактерий синтетическим 
аналогом эрогоргиаена
Р.Ю. Сидоров, А.Г. Ткаченко	
383
Провоспалительная активация подавляет TRAIL-индуцированный апоптоз клеток острого 
миелоидного лейкоза
М.И. Кобякова, А.С. Сенотов, К.С. Краснов, Я.В. Ломовская, И.В. Одинокова, А.А. Колотова, 
А.М. Ермаков, А.И. Звягина, И.С. Фадеева, Е.И. Фетисова, В.С. Акатов, Р.С. Фадеев	
395
Причина токсичности имидазолиевых ионных жидкостей – 
их действие на плазматическую мембрану
C.С. Соколов, Е.А. Смирнова, Т.И. Рокицкая, Ф.Ф. Северин	
406
Роль аминокислот каталитического домена интегразы ВИЧ-1, I182, R187, K188, в процессах 
обратной транскрипции и интеграции
Т.Ф. Кихай, Ю.Ю. Агапкина, Т.А. Приказчикова, М.В. Вдовина, С.П. Шехтман, C.В. Фомичева, 
С.П. Королев, М.Б. Готтих	
418
Влияние экспрессии киназы фокальных контактов и винкулина на параметры миграции 
нормальных и опухолевых эпителиоцитов
Е.С. Соломатина, А.В. Ковалева, А.В. Творогова, И.А. Воробьев, А.А. Саидова	
432
Сыворотка крови человека препятствует действию EGFR/HER2-таргетного препарата 
лапатиниба на рост и экспрессию генов клеток плоскоклеточной карциномы SK-BR-3
Н.А. Шабан, М.М. Раевский, Г.С. Захарова, В.О. Шипунова, С.М. Деев, М.В. Сунцова, 
М.И. Сорокин, А.А. Буздин, Д.Э. Камашев	
447
Структурно- и катион-зависимый механизм взаимодействия трициклических 
антидепрессантов с NMDA-рецептором по данным молекулярного моделирования
Д.А. Белинская, Н.Н. Шестакова	
469
Роль микробиома кишечника и амилоидов бактерий в развитии синуклеинопатий (обзор)
Н.П. Трубицина, А.Б. Матиив, Т.М. Рогоза, А.А. Зудилова, М.Д. Безгина, 
Г.А. Журавлева, С.А. Бондарев	
487
Связь повышенного уровня гомоцистеина с нарушением метаболизма фолатов 
и дефицитом витаминов группы B при раннем дебюте рассеянного склероза
В.И. Людыно, Е.А. Цымбалова, Е.А. Чернявская, Е.Ю. Скрипченко, Г.Н. Бисага, 
А.В. Дмитриев, И.Н. Абдурасулова	
509
Протективная активность инактивированной вакцины против бешенства 
с использованием адъюванта на основе флагеллина
О.О. Сокол, Н.А. Никитин, Е.А. Евтушенко, О.В. Карпова, И.Н. Матвеева, С.А. Гринь, 
В.М. Попова, И.В. Иванов, Ю.Н. Федоров, И.Ю. Литенкова	
523

CONTENTS
Vol. 89, Issue 3, 2024
The Mechanism of Mycobacterial (p)ppGpp Synthetase Inhibition by Synthetic Erogorgiaene Analog
R. Y. Sidorov and A. G. Tkachenko	
383
Pro-Inflammatory Activation Suppresses TRAIL-Induced Apoptosis of Acute Myeloid Leukemia Cells
M. I. Kobyakova, A. S. Senotov, K. S. Krasnov, Ya. V. Lomovskaya, I. V. Odinokova, A. A. Kolotova, 
A. M. Ermakov, A. I. Zvyagina, I. S. Fadeeva, E. I. Fetisova, V. S. Akatov, and R. S. Fadeev	
395
The Imidazolium Ionic Liquids Toxicity Is Due to Their Effect on the Plasma Membrane
S. S. Sokolov, E. A. Smirnova, T. I. Rokitskaya, and F. F. Severin	
406
Role of I182, R187 and K188 Amino Acids of the Catalytic Domain of HIV-1 Integrase 
in the Processes of Reverse Transcription and Integration
T. F. Kikhai, Yu. Yu. Agapkina, T. A. Prikazchikova, M. V. Vdovina, S. P. Shekhtman, S. V. Fomicheva, 
S. P. Korolev, and M. B. Gottikh	
418
Suppression of FAK Kinase Expression Decreases the Lifetime of Focal Adhesions 
and Inhibits Migration of Normal and Tumor Epitheliocytes in a Wound Healing Assay
E. Solomatina, A. Kovaleva, A. Tvorogova, I. Vorobjev, and A. Saidova	
432
Human Blood Serum Antagonizes Effects of EGFR/HER2-Targeted Drug Lapatinib 
on Squamous Carcinoma SK-BR-3 Cell Growth and Gene Expression
N. Shaban, M. Raevskiy, G. Zakharova, V. Shipunova, S. Deyev, M. Suntsova, M. Sorokin, 
A. Buzdin, and D. Kamashev	
447
Structure- and Cation-Dependent Mechanism of the Interaction of Tricyclic Antidepressants 
with NMDA Receptor According to Molecular Modeling Data
D. A. Belinskaia and N. N. Shestakova	
469
Role of the Gut Microbiome and Bacterial Amyloids in the Development of Synucleinopathies (Review)
N. P. Trubitsina, A. B. Matiiv, T. M. Rogoza, A. A. Zudilova, M. D. Bezgina, 
G. A. Zhouravleva, and S. A. Bondarev	
487
Association of Increased Homocysteine Level with Impaired Folate Metabolism 
and Vitamins B Deficiency in Early Onset of Multiple Sclerosis
V. I. Lioudyno, E. A. Tsymbalova, E. A. Chernyavskaya, E. Y. Scripchenko, G. N. Bisaga, 
A. V. Dmitriev, and I. N. Abdurasulova	
509
Protective Activity of Inactivated Rabies Vaccine Using Flagellin-Based Adjuvant
O. O. Sokol, N. A. Nikitin, E. A. Evtushenko, O. V. Karpova, I. N. Matveeva, S. A. Gryn, 
V. M. Popova, I. V. Ivanov, Y. N. Fedorov, and I. Y. Litenkova	
523

БИОХИМИЯ, 2024, том 89, вып. 3, с. 383 – 394
УДК 579.222.3
МЕХАНИЗМ ИНГИБИРОВАНИЯ АЛАРМОНСИНТЕТАЗ 
МИКОБАКТЕРИЙ СИНТЕТИЧЕСКИМ АНАЛОГОМ ЭРОГОРГИАЕНА
© 2024 Р.Ю. Сидоров1,2*, А.Г. Ткаченко1,2
1 Институт экологии и генетики микроорганизмов, 
Пермский федеральный исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук, 
614000 Пермь, Пермский край, Россия; электронная почта: sidorov.r@iegm.ru
2 Пермский государственный национальный исследовательский университет, 
614990 Пермь, Пермский край, Россия
Поступила в редакцию 29.06.2023
После доработки 09.01.2024
Принята к публикации 09.01.2024
Синтез алармонов (p)ppGpp (гуанозинтетрафосфата и гуанозинпентафосфата) вносит значительный вклад в процессы торможения метаболизма бактерий, контроля над скоростью их роста, 
вирулентности, бактериальной персистенции и формирования биоплёнок. Продукцию регуляторных молекул (p)ppGpp осуществляют бактериальные ферменты (p)ppGpp-синтетазы суперсемейства гомологов RelA/SpoT двух типов: длинные бифункциональные RSH-белки и малые 
алармонсинтетазы. В данной работе при помощи методов ферментативной кинетики и концентрационно-зависимого ингибирования исследуются детали механизма действия 4-(4,7-диметил-1,2,3,4-тетрагидронафталин-1-ил)пентановой кислоты (ДМНП) в отношении белков RelMsm 
и RelZ, (p)ppGpp-синтетаз Mycolicibacterium smegmatis обоих типов, и белка RelMtb Mycobacterium 
tuberculosis. Обнаружена способность соединения ДМНП подавлять активность белка RelMtb. В соответствии с результатами исследований ферментативной кинетики ДМНП проявляет себя как 
неконкурентный ингибитор, действующий на белки RelMsm и RelZ. Анализ молекулярного докинга 
позволил определить вероятное место связывания ДМНП – вблизи активного сайта синтетазного 
домена (p)ppGpp-синтетаз. Исследование вносит вклад в разработку нового класса соединений 
ингибиторов алармонсинтетаз, к которым относится релацин и его производные, а также изучаемое соединение ДМНП – синтетический аналог метаболита морских кораллов эрогоргиаена. 
В отличие от традиционных антибиотиков, ингибиторы алармонсинтетаз оказывают влияние на 
метаболические пути, связанные со строгим ответом. Хотя эти пути не являются ключевыми для 
бактерий, они регулируют формирование адаптационных механизмов. Сочетание традиционных 
антибиотиков, действующих на растущие клетки, и новых соединений, блокирующих адаптацию микроорганизмов, потенциально способно решить актуальные проблемы резистентности 
к антибиотикам и бактериальной персистенции.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: (p)ppGpp, алармоны, микобактерии, гомологи RelA/SpoT, малые алармонсинтетазы, ингибиторы алармонсинтетаз.
DOI: 10.31857/S0320972524030019 EDN: WLOHBB
ВВЕДЕНИЕ
Механизмы адаптации бактерий способны 
противодействовать бактерицидному действию 
антибиотиков, обеспечивая выживание клеток возбудителя при лечении бактериальных 
инфекций. Одним из таких механизмов является 
персистенция – способность популяции бактерий 
формировать временно нерастущую субпопуляцию 
клеток-персистеров, нечувствительную к антибиотикам  [1]. Клетки-персистеры переживают действие антибиотика благодаря замедлению клеточного метаболизма. После окончания курса лечения 
антибиотиком персистеры способны возобновить 
растущий фенотип. В результате этого многие 
бактериальные инфекции, такие как туберкулёз, 
характеризуются рецидивирующим течением, связанным с эндогенной реактивацией болезни [2, 3].
Принятые сокращения: ДМНП – 4-(4,7-диметил-1,2,3,4-тетрагидронафталин-1-ил)пентановая кислота; (p)ppGpp – 
гуанозинтетрафосфат и гуанозинпентафосфат; RSH – гомологи RelA/SpoT.
* Адресат для корреспонденции.
383

СИДОРОВ, ТКАЧЕНКО
384
Риск рецидива способствует повышению необделяют две основные группы: длинные и короткие 
RSH (рис. 1). Длинные гомологи RelA/SpoT – группа 
в основном бифункциональных ферментов, способных как к синтезу, так и к гидролизу алармонов. Короткие гомологи RelA/SpoT включают две 
подгруппы: малые алармонсинтетазы, способные 
только к синтезу алармонов, и малые алармонгидролазы, способные только к их гидролизу [12].
Соединения класса ингибиторов алармонходимой продолжительности курса антибиотикотерапии  [4]. Исследования демонстрируют, что 
укороченный курс терапии туберкулёза ведёт к 
большей доле рецидивов [5]. Кроме того, многие 
виды бактерий, в том числе микобактерии туберкулёза, формируют биоплёнки [6]. В глубоких 
слоях биоплёнок создаются условия истощения 
питательного субстрата, что способствует замедлению метаболизма и формированию персистерных клеток [7]. Регуляторные пути Mycobacterium 
tuberculosis, ассоциированные с образованием биоплёнок и персистенцией, делают вклад в формирование хронической туберкулёзной инфекции [6].
Таким образом, в терапии бактериальных 
синтетаз, такие как релацин [13] и его производные [14–16], аскорбиновая кислота [17], GSK-X9 [10], 
4-(4,7-диметил-1,2,3,4-тетрагидронафталин-1-ил)
пентановая кислота (ДМНП) [18, 19], являются перспективными средствами противодействия адаптационным механизмам бактерий [20]. Ингибиторы 
алармонсинтетаз подавляют (p)ppGpp-синтезирующую активность ферментов суперсемейства RSH. 
Таким образом, ингибирование синтеза (p)ppGpp 
снижает клеточные процессы, индуцируемые 
алармонами, такие как вирулентность, образование биоплёнок и персистенция [20]. В данном 
исследовании проведён анализ ферментативной 
кинетики (p)ppGpp-синтетаз Mycolicibacterium 
smegmatis RelMsm (EC 2.7.6.5 и 3.1.7.2) и RelZ (EC 
2.7.6.5) в присутствии ранее установленного ингибитора алармонсинтетаз ДМНП [18, 19]. Кроме 
того, проведён анализ подавления активности белка M. tuberculosis RelMtb (EC 2.7.6.5 и 3.1.7.2) для дальнейшего изучения эффектов этого ингибитора.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Клонирование генов relMsm и relZ M. smegинфекций возрастает потребность в новых средствах лечения, способных к преодолению механизмов адаптации бактерий. Одним из подходов 
к решению данных проблем может быть разработка соединений, воздействующих на строгий 
ответ, адаптивную реакцию бактерий на стресс, 
которая регулируется сигнальными молекулами 
алармонов гуанозинтетрафосфатом и гуанозинпентафосфатом ((p)ppGpp) [8]. Повышенные внутриклеточные концентрации алармонов (p)ppGpp 
ассоциированы с проявлениями персистенции, 
толерантности и резистентности у широкого диапазона видов бактерий. Напротив, устранение 
способности продуцировать алармоны у бактерий 
приводит к потере данных фенотипов [9]. Так, нокаутный штамм M. tuberculosis ΔrelMtb, неспособный 
к продукции (p)ppGpp, характеризуется сниженной толерантностью к изониазиду, нарушением 
адаптации к голоданию [10], нарушением способности к хронической инфекции в модели мышей 
и дефектом формирования биоплёнок [11]. Приведённые факты подтверждают важную роль строгого ответа в формировании свойств бактерий, 
затрудняющих лечение инфекции.
Синтез и гидролиз алармонов (p)ppGpp осуществляют преимущественно белки суперсемейства гомологов RelA/SpoT (RSH), среди которых выmatis и relMtb M. tuberculosis в экспрессионный 
вектор. Для продукции исследуемых белков 
сконструированы рекомбинантные плазмиды 
pET23b-relNTD, pET23b-relZ и pET23b-relMtb. Вставки 
кодирующих последовательностей генов амплифицировали с использованием ДНК-полимеразы 
Phusion («Thermo Fisher Scientific», США) на матрице лизата M. smegmatis MC2155 для генов relMsm 

Рис. 1. Доменный состав ферментов суперсемейства RSH, катализирующих синтез и гидролиз алармонов 
(p)ppGpp. Бифункциональные длинные RSH, такие как RelMsm из M. smegmatis и RelMtb из M. tuberculosis, включают гидролазный (HYD) и синтетазный (SYN) домены в каталитической доле, а также С-терминальный регуляторный домен (REG). Монофункциональные короткие RSH содержат либо гидролазный, либо синтетазный 
домен. RelZ из M. smegmatis является необычной малой алармонсинтетазой, так как содержит также домен 
РНКазы HII (HII)
БИОХИМИЯ том 89 вып. 3 2024

ИНГИБИРОВАНИЕ АЛАРМОНСИНТЕТАЗ МИКОБАКТЕРИЙ
385
Таблица 1. Названия и последовательности праймеров для ПЦР
Название
Последовательность (5′→3′)
relMsm (pET) NdeI
gGGgGGTGACAcatATGGTCGACGAGCCAG
relNTD (pET) HindIII
GTGAACACGAAaAgCTtCTGCGTGGCG
relZ (pET) NdeI
TGGAcAtATGCACCACCCCCCGT
relZ (pET) HindIII
aGCAagCTtGGCCTGCAGCTTCTCGA
relMtb (pET) NdeI
acacataTGGCCGAGGACCAGCTCACGGC
relMtb (pET) HindIII
tgaaagcttCGCGGCCGAGGTCACCCGGTA
relZ seq
CGCCTCGACCAAAAGTGAGCT
relMtb seq
GATGGCGGTATAGAGTGCTGACA
Примечание. Сайты рестрикции подчёркнуты, некомплементарные матрице нуклеотиды приведены в нижнем регистре.
и relZ либо инактивированной культуры M. tuberculosis H37Rv для гена relMtb. Праймеры для ПЦР 
в этом исследовании синтезированы компанией «Евроген» (Россия) (табл. 1). Пара праймеров, 
relMsm (pET) NdeI и relNTD (pET) HindIII, амплифицирует область N-терминального домена гена 
relMsm и разработана на основе публикации Jain 
et al. [21], где описан минимальный фрагмент белка RelMsm, сохраняющий (p)ppGpp-синтетазную активность – RelNTD. Вставка полноразмерного гена 
relZ амплифицирована с использованием праймеров relZ (pET) NdeI и relZ (pET) HindIII. Вставка 
кодирующей последовательности гена relMtb получена в реакции с праймерами relMtb (pET) NdeI и 
relMtb (pET) HindIII. Вставка relNTD клонирована 
напрямую в pET23b. Вставка relZ клонирована в 
промежуточный вектор pAL2 («Евроген»), вставка 
relMtb – в промежуточный вектор pTZ57R («Thermo 
Fisher Scientific») при помощи ТА-клонирования. 
Для этого к вставке добавляли адениловые концы 
в ходе реакции с Taq-полимеразой. Клонирование 
в pET23b проводили путём осаждения ДНК вставки 
этанолом, обработки вектора и вставки рестриктазами NdeI и HindIII, а затем Т4 ДНК-лигазой («Thermo 
Fisher Scientific»). Наличие ожидаемых вставок в 
pET23b верифицировано ПЦР, а затем секвенированием с использованием стандартных праймеров 
T7 promoter и T7 terminator, а также с праймерами, 
специфичными средней области соответствующих 
генов: relZ seq и relMtb seq. Полученными плазмидами со слиянием кодирующих последовательностей генов с С-терминальным 6xHisTag трансформировали штамм Escherichia coli BL21(DE3).
Продукция и очистка белков. Культуры E. coli 
BL21(DE3) с плазмидой pET23b-relNTD, pET23b-relZ 
или pET23b-relMtb выращивали в пробирках со средой LB с 50 мкг/мл ампициллина до оптической 
плотности 0,6–1,0 при 600 нм, далее хранили при 
4 °С и использовали для инокуляции в колбы. Для 
этого 2 мл культуры центрифугировали, осаждённые клетки ресуспендировали и переносили в колбу с 50 мл свежей среды LB с ампициллином, культивировали при 37 °С при вращении 120 об./мин. 
При достижении культурой оптической плотности 
0,3–0,6 добавляли 0,2  мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид. Спустя 3–4 ч после индукции при 
30 °С культуру центрифугировали и удаляли среду. 
Клетки ресуспендировали в 1 мл буфера для белков (20 мM Tris-HCl/500 мМ NaCl, pH 7,4) и разрушали при воздействии ультразвука на льду в течение 
30 с по 3 раза при амплитуде 35% с перерывами 
в 30 с, затем центрифугировали в течение 5 мин 
при 15 000 g при 4 °С для разделения растворимой 
и нерастворимой фракций. Белки очищали при 
помощи набора HisPur Ni-NTA Spin Purification Kit 
(«Thermo Fisher Scientific»). Растворимую фракцию 
белка с добавлением 5  мМ имидазола наносили 
на предварительно уравновешенную буфером для 
белков (5 мМ имидазол) центрифужную колонку с 
Ni-NTA-агарозой, инкубировали при мягком качании на льду в течение 30–60 мин для связывания 
гистидиновых меток белков с ионом никеля. Раствор с несвязавшимися белками удаляли центрифугированием 2 мин при 700 g и 4 °С. Затем связавшийся белок промывали 2 мл буфера для белков 
(25  мМ имидазол). Оставшуюся фракцию белка 
смывали с колонки в 3 этапа 200 мкл буфера для 
белков (250–500  мМ имидазол). Полученные растворы белков анализировали при помощи Ds-NaПААГ-электpофоpеза относительно стандарта 
Precision Plus Protein Dual Xtra («Bio-Rad», США). 
Концентрацию белка оценивали при помощи 
cпектрофотометра NanoDrop 2000C («Thermo Fisher 
Scientific»). Коэффициенты экстинкции и молекулярную массу белков рассчитывали при помощи 
инструмента Expasy ProtParam.
БИОХИМИЯ том 89 вып. 3 2024

СИДОРОВ, ТКАЧЕНКО
386
Определение активности алармонсинтетаз. 
вляли при помощи информационного критерия 
Акаике. Значимость различий в параметрах уравнения оценивали при помощи t-теста. При оценке 
нормальности распределения использовали критерий Шапиро–Уилка. Данные графиков представлены в виде среднего значения ± стандартное 
отклонение, а данные в таблице параметров уравнения Хилла представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка. Для визуализации 
и статистической обработки данных по ингибированию белка RelMtb использовали пакет Python 
Seaborn. При определении концентрации полумаксимального ингибирования ([I]50) использовали 
расчёт по функции с 3 параметрами с помощью 
Quest Graph IC50 Calculator.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Ферментативная кинетика длинной (p)ppGpp-синтетазы/гидролазы RelMsm. Для изучения механизма ранее установленного ингибиторного действия ДМНП  [18] проведены эксперименты по 
ферментативной кинетике N-терминального домена длинной бифункциональной (p)ppGpp-синтетазы/гидролазы RelMsm. Данный белок RelNTD имеет 
N-терминальные гидролазный и синтетазный домены, но лишён С-терминального регуляторного 
домена. Он представляет собой минимальную 
каталитически активную форму RelMsm, демонстрирующую повышенную (p)ppGpp-синтетазную 
активность [21].
Активность RelNTD анализировали в диапазоРеакционная смесь c белком RelNTD (35 мкл) включала 40  мМ Tris-HCl, рН  7,4, 1  мМ дитиотреитол, 
10 мМ MgCl2, 10 мМ KCl, 27 мМ (NH4)2SO4, 5%-ный 
метанол (v/v), 0 или 600  мкМ ДМНП, 0–3000  мкМ 
GTP, 4 мМ ATP, 1–2 мкМ RelNTD (0,5 ч инкубации 
при 37 °С) [18]. Реакционная смесь с RelZ (35 мкл) 
включала 40 мМ Tris-HСl, рН 7,4, 1 мМ дитиотреитол, 1 мМ MgCl2, 500 мМ NaCl, 5%-ный метанол (v/v), 
0 или 600 мкМ ДМНП, 0–4000 мкМ GDP, 4 мМ ATP, 
1–2 мкM RelZ (0,5 ч инкубации при 37 °С), согласно 
публикации Murdeshwar и Chatterji [22] с некоторыми модификациями. Реакции по ингибированию RelMtb в диапазоне концентраций ДМНП проводили в условиях, описанных в публикации Singal 
et al. [23] с некоторыми модификациями. В реакционную смесь (70 мкл) включали 40 мМ Tris-HCl, 
рН 7,4, 1 мМ дитиотреитол, 15 мМ MgCl2, 1 мМ GTP, 
4 мМ ATP, 0,5–1 мкM RelMtb, 0 или 5%-ный метанол 
(v/v), 0–600 мкМ ДМНП (0,5 ч инкубации при 37 °С). 
Для остановки реакции к образцам добавляли 1/10 
объёма пробы 0,4 N хлорной кислоты, затем центрифугировали их при 15 000 g в течение 5 мин для 
удаления преципитата. Супернатант разводили в 
4  раза в деионизированной воде. Концентрации 
нуклеотидов в образцах определяли посредством 
обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии по методу, описанному в литературе [18, 24]. Хроматографический анализ проводили на системе LC-20A («Shimadzu», Япония), 
образцы разделяли на колонке Luna C18 (5  мкм, 
250 мм × 4,6 мм) («Phenomenex», США), подвижная 
фаза – раствор 0,5%-ного CH3CN/99,5%-ного 50 мМ 
KH2PO4, рН 4,6. Идентификацию пиков проводили 
в области спектра 254 нм на основании сравнения 
времени удержания нуклеотидов в реакционных 
смесях и в растворах нуклеотидов GTP, GDP, ATP, 
AMP («Sigma-Aldrich», США). Активность ферментов (p)ppGpp-синтетаз количественно оценивали 
по изменению концентрации субстрата GTP (RelMtb) 
или продукта AMP (RelNTD, RelZ).
не концентраций субстрата GTP от 0 до 3000 мкМ 
при добавке 600 мкМ ДМНП в сравнении с контролем без ингибитора. RelMsm катализирует (p)ppGppсинтетазную реакцию, протекающую согласно уравнению GTP/GDP + ATP ↔ pppGpp/ppGpp + AMP [25]. 
Cкорость реакции определяли по изменению концентрации продукта AMP в реакционной смеси 
(рис. 2, а).
Анализ in silico. База данных AlphaFold (https://
Результаты экспериментов по ферментативalphafold.ebi.ac.uk/) послужила источником предсказанных трёхмерных структур (p)ppGpp-синтетаз RelMtb (P9WHG9), RelMsm (A0QWJ6) и RelZ 
(A0R4I7). Инструмент Protein Structure Alignment 
от «Schrödinger Maestro» использовали для пространственного выравнивания белков-мишеней. 
Расчёты молекулярного докинга проводились 
с помощью сервера Blind Docking Server (http://
bio-hpc.eu/software/blind-docking-server/).
ной кинетике демонстрируют способность ДМНП 
подавлять активность RelNTD (рис. 2, б). ДМНП 
способен к ингибированию очищенного N-терминального домена белка RelMsm (рис. 2, в), не теряя активности в отношении варианта белка без 
С-терминального домена. Таким образом, предполагаемое место связывания ДМНП локализуется в 
области синтетазного или гидролазного доменов 
RelMsm, но не в области регуляторного домена.
Статистический анализ. Для визуализации и 
При помощи метода нелинейной регрессии 
произведён фиттинг уравнений зависимости скорости реакции от концентрации субстрата GTP, согласно уравнению Михаэлиса–Ментен и согласно 
уравнению сигмоидной кривой Хилла (рис. 2, б), 
и определены параметры функции (табл. 2, а). 

статистической обработки данных по ферментативной кинетике при помощи нелинейной регрессии использовали программу GraphPad Prism 8.0. 
Выбор при сравнении моделей по уравнению Михаэлиса–Ментен или уравнению Хилла осущестБИОХИМИЯ том 89 вып. 3 2024

ИНГИБИРОВАНИЕ АЛАРМОНСИНТЕТАЗ МИКОБАКТЕРИЙ
387
Рис. 2. Влияние ингибитора ДМНП на ферментативную кинетику (p)ppGpp-синтетаз M. smegmatis. a – Хроматографический анализ нуклеотидов в образцах, взятых из ферментативной реакции с RelNTD спустя: 1 – 0 ч или 
2 – 0,5 ч (детекция при 254 нМ, 1 мМ GTP, 4 мМ ATP). б – Анализ ферментативной кинетики N-терминального 
домена белка RelMsm из M. smegmatis. Приведены кривые зависимости скорости реакции (расчёт на 1 мкмоль 
белка) от концентрации субстрата GTP: 1  – в отсутствии добавки ингибитора; 2  – при добавлении 600  мкМ 
ДМНП. в – Ds-Na-ПААГ-электpофоpез очищенного фермента RelNTD. г – Хроматографический анализ нуклеотидов в образцах, взятых из ферментативной реакции с RelZ спустя: 1 – 0 ч или 2 – 0,5 ч (детекция при 254 нМ, 
1 мМ GDP, 4 мМ ATP). д – Анализ ферментативной кинетики малой алармонсинтетазы RelZ из M. smegmatis. 
Приведены кривые зависимости скорости реакции (расчёт на 1  мкмоль белка) от концентрации субстрата 
GDP: 1 – в отсутствии добавки ингибитора; 2 – при добавлении 600 мкМ ДМНП. е – Ds-Na-ПААГ-электpофоpез 
очищенного фермента RelZ. ж  – График Хилла для реакции с RelZ: 1  – в отсутствии добавки ингибитора; 

2 – при добавлении 600 мкМ ДМНП
БИОХИМИЯ том 89 вып. 3 2024

СИДОРОВ, ТКАЧЕНКО
388
Таблица 2. Параметры уравнения в зависимости от концентрации ингибитора ДМНП
Белок RelNTD – параметры уравнения Михаэлиса–Ментен
Концентрация ДМНП, мкМ
Vmax, мкмоль/мин 
KGTPm, мкМ
R2
0
18,5 ± 2,3
1760 ± 218
0,95
600
14,2 ± 2,6
2412 ± 376
0,95
Белок RelZ – параметры уравнения Хилла
Концентрация ДМНП, мкМ
Vmax, мкмоль/мин
KGDP0,5, мкМ
h
R2
0
9,3 ± 0,7
1447 ± 172
1,8 ± 0,2
0,97
600
6,5 ± 0,9
2105 ± 310
2,2 ± 0,4
0,96
Сравнение двух моделей по информационному 
критерию Акаике продемонстрировало большее совпадение экспериментальных данных по 
RelNTD с моделью по уравнению Михаэлиса–Ментен (вероятность корректности модели – 76,6% без 
добавки и 76,8% с добавкой ДМНП). Исследователи, 
ранее проводившие эксперименты по ферментативной кинетике полноразмерного белка RelMsm, 
обнаружили, что данные описываются уравнением Хилла [15].
реакции от концентрации субстрата также просчитаны как для уравнения Хилла (табл. 2, б), так 
и для уравнения Михаэлиса–Ментен. Сравнение 
моделей по критерию Акаике продемонстрировало большее совпадение экспериментальных данных с моделью по уравнению Хилла (вероятность 
корректности модели – 99,7% без добавки и 99,8% 
с добавкой ДМНП). ДМНП не оказывает влияние на 
кооперативное связывание субстрата белком RelZ 
(рис. 2, ж).
Расчёт значимости различий в параметрах в 
Расчёт по t-тесту значимости различий в 
параметрах катализируемой RelZ реакции в присутствии ДМНП или в его отсутствии (табл. 2, б) 
демонстрирует следующие результаты: значения 
Vmax имеют статистически значимые различия 
(p = 0,02), в отличие от KGDP0,5 и коэффициента Хилла 
(p = 0,07 и p = 0,39 соответственно). Таким образом, 
ДМНП является неконкурентным ингибитором как 
в отношении длинной алармонсинтетазы RelMsm, 
так и в отношении малой алармонсинтетазы RelZ.
Анализ подавления активности RelMtb. В реотсутствии и в присутствии ДМНП по t-тесту показывает, что значения максимальной скорости реакции Vmax имеют статистически значимые различия (p = 0,01), в отличие от константы Михаэлиса 
KGTPm (p = 0,13). Таким образом, ДМНП является неконкурентным ингибитором в отношении N-терминального домена длинного RSH-белка RelMsm. 
В то же время ранее в научных публикациях описывались ингибиторы алармонсинтетаз только с 
конкурентным [15] или смешанным [15, 17] типами ингибирования.
Ферментативная кинетика малой алармонсинтетазы RelZ. Помимо длинного RSH-белка 
RelMsm, нами исследована также ферментативная 
кинетика малой алармонсинтетазы M. smegmatis 
RelZ, в отношении которой ДМНП также является 
ингибитором [19]. Монофункциональная (p)ppGppсинтетаза RelZ катализирует реакцию GTP/GDP/
GMP + ATP → pppGpp/ppGpp/pGpp + AMP. В качестве 
субстрата использовали GDP, к которому RelZ имеет большую аффинность по сравнению с GTP [25]. 
Активность RelZ анализировали в диапазоне концентраций субстрата ATP от 0 до 4000 мкМ в присутствии 600  мкМ ДМНП или в его отсутствии. 
Скорость реакции определяли по изменению концентрации продукта AMP (рис. 2, г).
Результаты экспериментов по ферментативзультате выравнивания последовательностей аминокислот белков RelMsm и RelMtb посредством BLASTp 
обнаружена высокая степень совпадений в 95%. 
Поэтому далее мы исследовали способность ДМНП 
подавлять pppGpp-синтезирующую активность 
RelMtb, основной и единственной функциональной 
(p)ppGpp-синтетазы/гидролазы M. tuberculosis [26]. 
Результаты исследования демонстрируют способность ДМНП подавлять активность RelMtb (рис. 3). 
Активность фермента снижается по мере увеличения концентрации ДМНП. Кроме того, активность RelMtb возрастает при добавлении 5%-ного 
метанола приблизительно на 40%. Ранее эффект 
увеличения (p)ppGpp-синтезирующей активности при добавке метанола в реакционную смесь 
обнаруживали при анализе активности RelA [27], 
RelMsm [18] и RelZ [19]. Расчёт концентрации полумаксимального ингибирования [I]50 на основании полученных данных указывает значение в 
362  мкМ ДМНП. Таким образом, ДМНП способен 
ной кинетике RelZ демонстрируют способность 
ДМНП ингибировать очищенный фермент (рис. 2, 
д, е). Параметры кривых зависимости скорости 
БИОХИМИЯ том 89 вып. 3 2024

ИНГИБИРОВАНИЕ АЛАРМОНСИНТЕТАЗ МИКОБАКТЕРИЙ
389
Рис. 3. pppGpp-Синтезирующая активность длинного RSH-белка RelMtb из M. tuberculosis в диапазоне концентраций ДМНП (0–600  мкМ) в 5%-ном метаноле. 
Скорость реакции оценивается по изменению концентрации субстрата GTP. MetOH-  – реакция без добавки метанола и ДМНП
Перспективным подходом к выявлению механизмов действия новых соединений является сочетание предсказаний структур посредством AlphaFold 
с моделированием молекулярного докинга для 
анализа взаимодействия белок-лиганд [28]. Чтобы 
установить вероятное место связывания ингибитора ДМНП на поверхности (p)ppGpp-синтетаз, мы 
провели анализ с использованием молекулярного 
докинга in silico. Структуры экспериментально 
установленных белков-мишеней (RelMtb, RelMsm, 
RelZ) были получены с помощью базы данных 
предсказанных структур белков AlphaFold  [29]. 
Данные белки относятся к одному суперсемейству 
RSH [12] и потому характеризуются значительной 
долей совпадений последовательности аминокислот (RelMsm с RelMtb: 95%; RelZ с RelMsm/RelMtb: 29,27%). 
Исходя из этого, было выдвинуто предположение 
об общем механизме действия ДМНП в отношении исследуемых белков. В результате пространственного выравнивания трёх белков-мишеней 
идентифицированы области структурного сходства. Для малой алармонсинтетазы RelZ не характерны гидролазный и регуляторный домены, которые присутствуют у длинных RSH-белков RelMsm 

подавлять активность фермента строгого ответа у 
микобактерии туберкулёза и потому имеет потенциал применения при антибиотикотерапии туберкулёзной инфекции.
Молекулярный докинг ДМНП со структурами 
(p)ppGpp-синтетаз, предсказанными AlphaFold. 
и RelMtb  [30]. В свою очередь, длинные RSH не 
имеют домена РНКазы HII, специфического для 
RelZ [22]. Структурное сходство было обнаружено 
в областях синтетазного домена, характерного 
Рис. 4. Пространственное выравнивание и результаты молекулярного докинга трёхмерных структур белков-мишеней M. tuberculosis RelMtb (синий), M. smegmatis RelMsm (фиолетовый) и RelZ (жёлтый), предсказанных 
AlphaFold. SYN – синтетазный домен; HYD – гидролазный домен; CTD – регуляторный C-терминальный домен; 
TGS – домен TGS; HII – домен РНКазы HII. Кластеры связывания ДМНП (зелёный): 1 – соответствующий активному сайту синтетазного домена, 2 – располагающийся вблизи активного сайта синтетазного домена
БИОХИМИЯ том 89 вып. 3 2024