Биологические мембраны, 2024, № 2

Российская академия наук
БИОЛОГИЧЕСКИЕ
МЕМБРАНЫ
               том 41 
 № 2 
 2024     Март–Апрель
Основан в январе 1984 г.
 Выходит 6 раз в год 
ISSN: 0233-4755
Журнал издается под руководством 
Отделения биологических наук РАН
Редакционная коллегия
Главный редактор
С.С. Колесников (Пущино)
П.В. Авдонин (заместитель главного редактора, Москва),
В.С. Акатов (Пущино), С.А. Акимов (ответственный секретарь, Москва), 
C.М. Антонов (С.-Петербург), Ф.И. Атауллаханов (Москва),
А.А. Булычев (Москва), А.Я. Дунина-Барковская (Москва),
Ю.А. Ермаков (Москва), Р.Г. Ефремов (заместитель главного редактора, Москва), 
В.П. Зинченко (Пущино), Е.В. Казначеева (С.-Петербург),
А.А. Минин (Москва), О.С. Остроумова (С.-Петербург), 
М.А. Пантелеев (Москва), Д.Б. Тихонов (Москва) 
Редакционный совет
Ю.А. Владимиров (Москва), А.Н. Гречкин (Казань), Г.Р. Иваницкий (Пущино), 
Л.Г. Магазаник (С.-Петербург), А.Б. Рубин (Москва), В.А. Ткачук (Москва), 
Л.С. Ягужинский (Москва), S.M. Bezrukov (Bethesda, USA),
P.D. Bregestovski (Marseille, France), L.V. Chernomordik (Bethesda, USA),
P. Pohl (Austria)
Редакция
Заведующая редакцией Н.Ю. Деева
Адрес редакции: 117997, ГСП-1, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10
тел./факс: (499) 724-80-89
E-mail: biomembranes2010@gmail.com
Москва
ФГБУ «Издательство «Наука»
© Российская академия наук, 2024
© Редколлегия журнала “Биологические мембраны” 
  (составитель), 2024 

СОДЕРЖАНИЕ 
Том 41, номер 2, 2024 
Влияние лигандов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов на адгезивные 
свойства гранулоцитов костного мозга мыши при воспалении 
Э. А. Жирова, Д. А. Серов, Е. В. Федорова, В. Г. Сафронова 
99 
Поправки к электрической емкости деформированной липидной мембраны 
О. В. Кондрашов, С. А. Акимов 
115 
Расчет энергетического барьера образования монослойного сталка в процессе 
слияния липидных капель 
Р. Ю. Молотковский 
123 
Механизм действия ингибитора СаССтВ-А0] на активность кальций-зависимых 
хлорных каналов АМОб 
Д. О. Колесников, Е. Р. Григорьева, М. А. Номеровская, Д. С. Решетин, А. В. Шалыгин, 
Е. В. Казначеев 
133 
Новый подход к анализу состояния системы комплемента у больных СОУТО-19. 
Пилотные исследования 
п. П. Авдонин, Л. А. Комлева, М. С. Блинова, Е. С. Иванова, О. Н. Котенко, Н. Ф. Фролова, 
Е. С. Столяревич, Е. Ю. Рыбакова, П. В. Авдонин 
139 
Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения Не-М№е-лазера на состав и содержание 
фосфолипидов и стеринов в тканях каллусов пшеницы 7Т/йсит аез лит 
[. 
Л. В. Дударева, Е. Г. Рудиковская, Н. В. Семенова, А. В. Рудиковский, В. Н. Шмаков 
149 
160 
Различные формы супероксиддисмутазы из корней проростков гороха различаются 
по чувствительности к сАМР и ионам кальция 
Л.А. Ломоватская, О. В. Захарова, А. М. Гончарова, А. С. Романенко, 
Т. А. Кишинская 
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ 
Организация резервного пула синаптических везикул в нервных окончаниях с удаленными 
компонентами белковой жидкой фазы 
Н. В. Нифантова, А. Г. Шишков, О. М. Коренькова, Е. С. Сопова, Л. Бродин, О. В. Шупляков 
168 

СОМТЕМТЬ 
У]. 41, №. 2, 2024 
Те ЕНес( оЁ №соНпе АсегуспоПпе Кесерюг [12ап4$ оп Ше Адпезуе Ргорегиез оЕ Мигше Вопе Магго\ 
Отапиюосу{ез ш шНаттайоп 
Е. А. Лгоуа, О. А. $егоу, Е. 
И. Еедогота, И. Ц. багопоуа 
99 
СоггесНопз {о Ше Еесётса! Сараспапсе оЁ еюгтеа Глра Метбгапе 
О. 
Г. Копагайоу, 5. А. Айтоу 
115 
Епегоу Вагиег оГа Мопо[ауег а ЕогтаНоп аигше Глр1а Огоре Еи$1юп 
К. Г. МооКоу5Ку 
123 
Тве Месвап1;т оЁ Саспит-Асйуажеа СШог4е АМО6 Сваппе! шЫЫ@оп Бу СаССшВ-Ао01 
р. О. Ко[езшКоу, Е. К. Снеотета, М. А. Мотегоузкауа, О. 5. Кезйейи, А. И. рат, 
Е. У. Каспасйеуеуа 
133 
А № е\м Арргоасп ю Апау7е 1е Зе оРШе Сотр!етепЕ Зу$ет ш Райепт$ мин СОУТО-19. 
РИо( Зау 
Р. Р. Аудоти, Г. А. Кот[еуа, М. 5. ВПиота, Е. 5. Грапоуа, О. М. Коеико, М. Е. Егоюуа, 
Е. 5. Эюуагелсй, Е. У. КураКоуа, Р. У. Аудотт 
139 
шЯчепсе оЁТГо\-Пиепзе Газег Кааноп Не-М№е Газег оп фе Сотроз!Шюоп апа Сомет 
оЁ РВозрпо|р1а$ апа З{его!5 ш {Ве Т!15зие оЁУ!Пеай (Тийсит аезйуит Г.) СаЦаз Т15$1ез 
Г. 
Г. Биаагета, Е. С. Ки4Коужкауа, М. 
Г. бетепоуа, А. 
Г. Кий КоуэКи, 
Г. М. 5йтакоу 
149 
О!Шегеп" Еогил$ ОЕ Зирегох1е О!1зпщазе Гот Реа Зее Ипе Коо{з О!Йег ш Зепзшуйу о сАМР 
апа Сас пит 
Г. А. Готоуакауа, О. Г. Гайагота, А. М. Сопсйагота, А. 5. КотапеиКо, Т. А. Койтзкауа 
160 
ЗНОВТ СОММОМСАТТОМ$ 
Огоап1танНоп ое Везегуе Роо| оЁЗупарис Уезсез 11 Мегуе Тегипа15 Гасктз Ргобеш Глаша Рвазе 
Сотропеп{$ 
№. Г. Мапюта, А. С. 5ш&йкоу, О. М. Когепкоуа, Е. 5. бороуа, [.. Втоат, О. Уйирйакоу 
168 

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2024, том 41, 
№ 
2, с. 99—114 
УДК 577.354.3:577.27 
ВЛИЯНИЕ ЛИГАНДОВ НИКОТИНОВЫХ АЦЕТИЛХОЛИНОВЫХ 
РЕЦЕПТОРОВ НА АДГЕЗИВНЫЕ СВОИСТВА ГРАНУЛОЦИТОВ 
КОСТНОГО МОЗГА МЫШИ ПРИ ВОСПАЛЕНИИ 
© 2024г. 
Э.А. Жирова*, Д. А. Серов*?, Е. В. Федорова‹, В. Г. Сафронова”. * 
“ Институт биофизики клетки РАН, ФИЦ ПИНЦБИ РАН, Пущино Московской обл., 142290 Россия 
‚ Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва, 119991 Россия 
‹ Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино Московской обл., 142290 Россия 
*е-тай: загопоуа@ГсЬ.руп.ги 
Поступила в редакцию 21.09.2023 
После доработки 27.10.2023 
Принята к печати 31.10.2023 
Первой стадией выхода зрелых нейтрофильных гранулоцитов из костного мозга в кровь и после- 
дующей миграции в очаг воспаления является прикрепление к эндотелию сосудов. Эндо- и эк- 
зотенные факторы модифицируют способность клеток к адгезии через рецепторы разного типа, 
включая никотиновые рецепторы ацетилхолина (нАХР). Однако участие нАХР в регуляции ад- 
гезии гранулоцитов костного мозга (КМ-гранулоцитов) и роль сигнальных компонентов в дей- 
ствии никотина исследованы мало. Целью данной работы явилось изучение роли нАХР разных 
типов в регуляции адгезии КМ-гранулоцитов мыши при остром воспалении. Работа проведена 
на КМ-гранулоцитах мышей линии ВАГ.В/с с применением статической адгезионной пробы, 
конфокальной микроскопии, ингибиторного анализа, ПЦР с обратной транскрипцией. Роль 
типов НАХР оценена с помощью селективных антагонистов: 
109 нМ а-СТХ (<7), 10 нМ С1Си 
5 
нм МП (а3В2), 200 нм МП (а3В2 и а 7), ВТА и У\с1.1 (99410). Показано, что количество при- 
крепившихся КМ-гранулоцитов, оцениваемое по оптической плотности, не различалось у жи- 
вотных с острым воспалением и без него. Никотин (0.01—100 мкМ, 30 мин) значительно усили- 
вал адгезию клеток животных контрольной и “воспалительной” групп. Токсины а-СТХ, ВТА 
и \с1.1 усиливали адгезивность клеток мышей обеих групп, каки 200 нМ МП - в контрольной 
группе. В пробах с флуоресцентным мечением показана экспрессия субъединиц &7 и 910 нАХР 
на мембране нативных КМ-гранулоцитов. С помощью ингибиторов обнаружено, что действие 
никотина на адгезию КМ-гранулоцитов опосредовано гетеротримерными С-белками, РКС, Р1ЗК 
и КОСК как в норме, так и при наличии воспаления. В регуляции адгезии КМ-гранулоцитов 
мыши участвуют преимущественно о/7 и ©9010 типы нАХР, вклад @3(06*)В2 незначителен, воз- 
можно вследствие низкой экспрессии а3/об6*-субъединиц. Роль а7 нАХР, присутствующих на 
мембране КМ-гранулоцитов конвенционально, в регуляции адгезивности клеток никотином 
усиливается при развитии воспаления в организме. 
Ключевые слова: костный мозг, гранулоцит, никотиновые ацетилхолиновые рецепторы, адгезия, 
воспаление 
Список сокращений: нАХР — никотиновый рецептор ацетилхолина; КМ-гранулоциты — грануло- 
циты костного мозга; а-СТХ — а-кобратоксин (а-собгаюхш); РКС — протеинкиназа С (ргофеш 
Ктазе С), РЗК — фосфатидилинозитол-3-киназа (рпозрванауНпо$ 
Ио! 3-К1тпазе); КОСК — Кпо-ас- 
социированная протеинкиназа (КВо-а$зос1еа ргоет Ктазе); [САМ — молекула межклеточной 
адгезии (пиегсе\аг адпезюп шо!есше); УГА — очень поздний антиген (уегу 1а{е апИеп), Г.ЕА-1 
— связанный с функцией лимфоцитов антиген 
1 ([утрвосуе Рапсйоп-аззос1а{е4 апизеп-1); Мас-1 — 
антиген макрофага 1(тасторвазе-1 апИзеп); АХ — ацетилхолин; МАРК — митоген-активируемая 
протеинкиназа (тИозеп-асйуажеа ргоеш Кшазе); УСАМ-1 — васкулярная молекула клеточной 
адгезии 
1 (уазсуаг се! а4Везюп то есше 
1); ЛМК — с-Лш М-концевые киназы (с-Лап М-{егиита! 
Кпазез); РТХ — коклюшный токсин (рег$$1$ {0х1п); ОР — оптическая плотность (орНса| депзИу); 
АЕ488 — А!ехаЕшог488. 
РОГ: 10.31857/50233475524020017, ЕОМ: ххво\ 
99

ЖИРОВА и др. 
100 
ВВЕДЕНИЕ 
Воспалительная реакция организма сопрово- 
ждается быстрой активацией полиморфноядерных 
нейтрофильных гранулоцитов (нейтрофилов). 
Они развиваются из полипотентной стволовой 
кроветворной клетки в костном мозге, где прохо- 
дят этапы миелоидной дифференцировки. Зрелые 
нейтрофилы выходят в кровеносное русло, обладая 
сформированным цитотоксическим потенциалом 
тогда как в последнее время большое внимание 
привлекает участие нАХР в воспалительных про- 
цессах и болевых реакциях [22—24]. Показано, что 
никотин, как и эндогенный лиганд нАХР ацетил- 
холин (АХ), способствовали адгезии моноцитопо- 
добных клеток 0937 на эндотелиальных клетках 
[25]. В присутствии липополисахарида никотин 
подавлял экспрессию 1САМ-1 в моноцитах кро- 
ви человека с участием о7 нАХР, МЕ-ХВ и р38 
МАРК [26], тогда как в эндотелиальных клетках 
десен, в которых обнаружены субъединицы 05 
в виде протеолитических ферментов, цитоток- 
сических белков и аппарата для генерации супе- 
роксид-анион радикала [1—3]. При повреждении 
ткани или проникновении патогена нейтрофилы 
активируются в течение нескольких минут, ми- 
грируют из кровеносного сосуда и скапливаются 
и 07, никотин увеличивал экспрессию генов и бел- 
ков [САМ-1, что было опосредовано р38 МАРК, 
но не протеинкиназой С (РКС) [27]. У активных 
курильщиков, имеющих высокую концентрацию 
никотина в крови, выявлено изменение экспрес- 
сионного профиля адгезивных молекул, приво- 
дящее к осложненному течению заболеваний 
с воспалительным компонентом [28]. Никотин 
в концентрации, сопоставимой с уровнем в кро- 
ви курильщиков, потенцировал экспрессию гена 
и белка васкулярной молекулы клеточной адгезии-1 
(уазсшаг се] а4Пез1юп то!есше, УСАМ-1) в клетках 
макрофагальной линии КА\/264.7 через «7 нАХР 
и сигнальный путь 
ЛМК (с-ГЛап М-концевые кина- 
зы) [29]. Также он усиливал перекатывание и ад- 
гезию лейкоцитов в микроциркуляторном русле 
головного мозга мышей [30]. Наиболее детально 
изучена регуляция ацетилхолином адгезии керати- 
ноцитов, осуществляемая через о3, 7 и 99 нАХР 
при участии фосфолипазы С, 5гс-тирозиновых 
протеинкиназ, РКС и малых С-белков семейств 
Васи КБо [31—33]. Эндогенный АХ может вли- 
ять на адгезию и миграцию иммунных клеток по 
механизму ауто- и паракринной регуляции [34]. 
Однако участие нАХР в регуляции адгезии гра- 
нулоцитов костного мозга и их сигнальные пути 
исследованы мало. 
Ранее мы показали, что в нейтрофилах из оча- 
в очаге воспаления, где они реализуют защитные 
функции [4—7]. Прикрепление к эндотелию со- 
судов и внеклеточному матриксу является первой 
стадией выхода зрелых нейтрофилов из костного 
мозга в кровь и последующей миграции в очаг ин- 
фицирования или повреждения [2, 4]. Механизм 
этого процесса хорошо изучен, установлены ос- 
новные адгезионные молекулы и рецепторы [8—13]. 
Кратко “адгезионный каскад” можно представить 
следующим образом: 1) мягкое прикрепление кэн- 
дотелию и медленное качение (гоШпз), что обеспе- 
чивается экспрессией [.-селектина и активацией 
интегринов; 2) при получении сигнала тревоги 
(например, в виде медиаторов воспаления) ней- 
трофил прикрепляется прочно перед последующим 
“просачиванием” через эндотелий и базальную 
мембрану (трансэндотелиальная и периваскуляр- 
ная миграция) [9, 13—15]. Прочное прикрепление 
обеспечивается взаимодействием молекул межкле- 
точной адгезии (САМ) на эндотелии с В1- и В2- 
интегринами на мембране нейтрофила: УГА (уегу 
[же апИееп), ГЕА-1 Гутрвосуе Вшсйоп-аззосчаже4 
апИееп-/, СОПа/СО18) и Мас-1 (тасгорваее-1 
апИееп, СО115/СЬ18). Кроме того, молекулы ад- 
гезии участвуют в регуляции фагоцитоза и других 
функций нейтрофилов [13, 16]. Нарушение адгези- 
онных свойств нейтрофилов критично для многих 
заболеваний с воспалительным компонентом [5, 
9, 13, 14, 16, 17]. Предлагается подход к терапии 
воспалительных заболеваний на основе модуля- 
ции адгезии [18]. 
Адгезивные свойства нейтрофилов модифи- 
цируются эндо- и экзогенными факторами че- 
рез рецепторы разного типа, в том числе через 
никотиновые рецепторы ацетилхолина (нАХР) 
га острого воспаления у мыши активация нАХР 
приводила к транзиентному повышению концен- 
трации Са?* в цитозоле и влияла на генерацию 
активных форм кислорода и адгезию [35]. С помо- 
щью селективных антагонистов была обнаружена 
регуляторная роль @7, ©3(@6*)В2 нАХР и показана 
экспрессия мРНК субъединиц @2-—7, а9, В2—4. 
При сопоставлении нейтрофилов из очага воспа- 
ления с гранулоцитами костного мозга (КМ-гра- 
нулоцитами) обнаружены различия в экспрессии 
генов субъединиц и в действии лигандов нАХР 
на функции клеток [21]. Отметим, что никотин 
не влиял на адгезию клеток из очага воспаления 
и усиливал адгезию КМ-гранулоцитов, АХ уси- 
ливал адгезию в обоих случаях. Было показано 
участие а9-содержащих нАХР в регуляции адгезии 
[15, 19-21]. Среди экзогенных лигандов нАХР 
наиболее распространенным является никотин. 
Первоначально интерес к его действию на клетки 
иммунной системы был связан с курением сигарет, 
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ 
№2 
том 41 
2024

ВЛИЯНИЕ ЛИГАНДОВ НИКОТИНОВЫХ АЦЕТИЛХОЛИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ... 
центрифугировали, осадок ресуспендировали 
в среде Хенкса без Са?* до плотности 107 клеток/мл. 
Изоляция гранулоцитов из костного мозга. 
КМ-гранулоциты получали по стандартной ме- 
тодике [36, 37|. Большеберцовую, бедренную 
КМ-гранулоцитов, но роль других рецепторов не 
рассматривалась. Кроме того, остается неизучен- 
ным участие сигнальных компонентов в действии 
никотина на адгезию КМ-гранулоцитов. 
Целью данной работы являлось исследование 
роли нАХР разных типов в регуляции адгезии 
гранулоцитов костного мозга мышей с острым 
воспалением. 
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 
и плечевую кости промывали средой КРМ1-1640, 
полученную суспензию наслаивали на градиент 
перколла (78%, 62.5%, 55% в РВ$, У/У\У) и центри- 
фугировали (15002, 35 мин, 7°С). Собирали клет- 
ки на границе фаз 62.5—78%, промывали средой 
ВКРМ/-1640, затем РВ$. После второй промывки 
и центрифугирования (500, 10 мин) осадок ресу- 
спендировали в среде Хенкса без Са?*до плотности 
107 клеток/мл. 
Количество выделенных зрелых нейтрофилов 
в обоих случаях оценивали по форме ядра при 
окрашивании акридиновым оранжевым. Живые 
клетки составляли около 98% по окрашиванию 
трипановым синим. Изолированные клетки хра- 
нили до эксперимента в течение | ч при 4°С. 
Адгезионную пробу проводили по протоколу, 
описанному ранее [21], в плоскодонном 96-лу- 
ночном планшете с ТС-обработкой поверхности 
(Еррепао!Р, США). В каждую лунку помещали по 
270 мкл раствора Хенкса, содержащего 1 мМ Са?*, 
затем в зависимости от задачи в соответствующие 
лунки добавляли: исследуемые лиганды нАХР или 
раствор Хенкса (контроль), токсины или инги- 
биторы сигнальных компонентов; после этого 
добавляли по 3х 10° клеток. Были использованы: 
0.01—100 мкМ никотин, 10 нМ оа-СТХ, 109 нм СС, 
Материалы. В работе использованы: перколл, 
зимозан из фассйаготусеу сегейяае, красители 
(акридиновый оранжевый и трипановый синий), 
тирфостин 51, вортманнин, стауроспорин, ко- 
клюшный токсин (РТХ), У27632, МисВе4 (Тветто 
Езрег Зсепийс, США). Для изоляции и инкубации 
клеток использованы: фосфатно-бикарбонатный 
буфер (РВ$, ТВегто Е1зпег З‹епиЯс, США); сре- 
да КРМ1-1640 (ПанЭко, Россия); среда Хенкса, 
содержащая (мМ): 138 Мас, 6 КС, 
1 М$50,, 
1 
Ма,НРО,, 5 МаНСО,, 5.5 глюкоза, 10 Нерез, рН 7.3 
(51ета-АансН). Лиганды нАХР: никотин (З1ета, 
США), а-кобратоксин (&-СТХ) и АЕ488-а-СТХ, 
а-конотоксины СС, МП, ВэТА и У\с1.1. АЕ488- 
а-СТХ, а-СТХ и а-конотоксины были любезно 
предоставлены И.Е. Кашеверовым и Ю.Н. Утки- 
ным (ИБХ РАН, Москва). 
Животные. Работа проведена на мышах-самцах 
линии ВАГВ/с (21—23 г), приобретенных в питом- 
нике филиала “Столбовая” ФГБУН “Научный 
центр биомедицинских технологий Федерального 
медико-биологического агентства” России. Все 
эксперименты с лабораторными животными вы- 
полнены в соответствии с нормативно-правовым 
актом Министерства здравоохранения РФ № 
199-н 
“Об утверждении правил надлежащей лабораторной 
практики”, международно-правовыми нормами, 
указанными в Европейской конвенции ЕТЗ № 
123 
“О защите позвоночных животных, используемых 
для экспериментов или в иных научных целях” 
и руководством по работе с лабораторными жи- 
вотными ИБК РАН № 57.30.12.2011. Были взяты 
две группы: 1) животные с острым воспалением, 
вызванным инъекцией суспензии зимозана в рас- 
творе Хенкса без Са?* (5 мг/мл, 150 мкл в/б); 2) кон- 
трольные животные (раствор Хенкса, 150 мкл в/б). 
Животные содержались в конвенциональных усло- 
виях и получали питье и корм ассеззо Гфето. 
5 или 200 нмМ МП, 109 нМ стауроспорин, 50 нм 
тирфостин 51, 10 нМ вортманнин, 140 нМ У27632. 
Клетки инкубировали в течение 30 мин при 37°С 
или в течение 2 ч с коклюшным токсином (РТХ, 
300 нг/мл). Затем супернатант удаляли, клетки 
фиксировали с помощью 96% С.Н;ОН (Зч, 22°С). 
После удаления этанола планшет просушивали 
(14—15 ч, 37°С), и прикрепившиеся клетки окра- 
шивали раствором азур-эозина по Романовскому 
(40 мин, 22°С). Планшет трехкратно промывали 
РВ$, и клетки лизировали изопропанолом. Коли- 
чество прикрепившихся клеток оценивали по оп- 
тической плотности (ОО) растворов, полученных 
после лизиса, при длинах волн 492 нм (ОО.л›) и 405 
нм (ОШ, референсная длина волны) с помощью 
фотометра шЯппе Е50 (Тесап, Австрия). Определя- 
ли ДОР = ОБ. — ОБ 
;. Эффекты (относительная 
оптическая плотность, %) никотина, токсинов или 
ингибиторов рассчитывали по отношению АОР 
клеток, обработанных никотином или каким-либо 
из агентов, либо антагонистом нАХР и никотином 
совместно, к величине АОР интактных клеток, 
принятой за 100%. При совместном использовании 
Изоляция гранулоцитов из брюшной полости. Че- 
рез 15 ч после инъекций суспензии зимозана или 
солевого раствора мышей обездвиживали с помо- 
щью цервикальной дислокации, брюшную полость 
промывали раствором Хенкса без Са?*, суспензию 
2024
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ 
том 41 
№2 

ЖИРОВА и др. 
102 
никотина и одного из ингибиторов эффект ни- 
котина рассчитывали по отношению величины 
ДОР от клеток, обработанных обоими веществами, 
2м16000 (Геса, Германия) при постоянных на- 
стройках мощности источников возбуждающего 
света и усиления сигнала во всех экспериментах 
каждым из методов. Значения пинхола были выбра- 
ны 1 Эйри. Далее изображения обрабатывали с по- 
мощью программ ГАЗ Х (Геса, Германия) и Птазе] 
к величине АО от клеток, обработанных тем же 
ингибитором, принятой за 100%. 
Примененный нами метод статической оценки 
адгезии КМ-гранулоцитов имеет ограничения, 
так как он не воспроизводит физиологические 
условия, при которых клетки находятся в условиях 
сдвигового потока. Но считается, что статические 
адгезионные пробы позволяют с высокой произ- 
водительностью исследовать прочную адгезию, 
опосредованную В2-интегрином [17]. 
Связывание меченого ©-кобратоксина. 100 мкл 
суспензии КМ-гранулоцитов наносили на круг- 
лые покровные стекла (диаметром 25 мм) и ин- 
кубировали во влажной камере для прикрепле- 
ния (15 мин, 37°С). Стекло с клетками помещали 
в камеру КС-40Г.Р (УМагпег шугитеп{$, США), 
затем добавляли 400 мкл раствора Хенкса без 
Са? и трижды промывали. Окрашивание клеток 
а-кобратоксином (@&-СТХ), конъюгированным 
с поддержкой плагинов В!ю-Еогта{ (МТН, США). 
Полимеразная цепная реакция с обратной транс- 
крипцией (ОТ-ПЦР) была применена для оцен- 
ки экспрессии генов в КМ-гранулоцитах мышей 
контрольной группы без инъекций. Суммарную 
РНК экстрагировали из КМ-гранулоцитов, преф- 
ронтальной области коры головного мозга и ти- 
муса мыши с помощью набора КМеазу Ми КИ по 
протоколу производителя (ОТАСЕМ, Германия). 
Согласно данным базы МСВ| в мозге взрослых 
мышей на высоком уровне экспрессируются субъ- 
единицы никотиновых рецепторов @3 (Сйгпа3), 
@7 (Сйгпа7) и В2 (СйтиЬ2), тогда как в тимусе — 
а9 (Сйгпа9) и а10 (Сйта10), поэтому указанные 
ткани были взяты в качестве положительного 
контроля. Измерение концентрации суммарной 
РНК проводили на спектрофотометре Мапо)гор 
бресгорпоюштеег 1000 (ТБегто Е15пег З‹епиНс, 
США). Качество РНК оценивали электрофоре- 
тически в 1% агарозном геле. Суммарную РНК 
(2 мкг) использовали для проведения реакции 
обратной транскрипции с помощью набора для 
синтеза кДНК КеуецАа Е Эгапа сОМА $упез15 
КИ (ТБегто Е1зВег ЗаепИЯс, Литва) по протоколу 
производителя. Образцы с РНК, подвергнутой об- 
ратной транскрипции без использования обратной 
транскриптазы, служили отрицательным контро- 
лем. Синтезированную кДНК использовали для 
ПЦР сгеноспецифичными праймерами (табл. 1). 
ПЦР проводили на ДНК-амплификаторе ДТ-лайт 
(ДНК-Технология, Россия) с использованием на- 
бора аРСК-Мх-Н$ (Евроген, Россия). Реакци- 
онная смесь общим объемом 20 мкл содержала 
с А№ехаЕшог488 (АР488-а-СТХ), проводили по 
протоколу [38] с модификациями. Клетки инку- 
бировали с немеченым @а-СТХ (500 нМ) во влаж- 
ной камере в темноте (1 ч, 23°С), добавляли 50 нм 
АЕ488-@-СТХ и 5 мкМ МисВеа (витальный ядер- 
ный краситель), инкубировали в течение 30 мин. 
Контрольная проба содержала немеченый а-СТХ. 
Флуоресцентное окрашивание с.10 нАХР. Имму- 
ноцитохимическое окрашивание клеток с помо- 
шью меченых антител к субъединице 10 нАХР 
проводили по протоколу [39]. Клетки фиксировали 
4% формальдегидом в РВ$ (15 мин), трижды про- 
мывали РВ$, инкубировали с 1% БСА в РВ$ для 
блокирования дальнейшего неспецифического 
связывания антител (30 мин). Затем инкубиро- 
вали в течение 
1 ч с первичным поликлональным 
антителом (анти-010 нАХР) кролика против &/10 
НАХР (Абсат, Великобритания) в разведении 1:100, 
трижды промывали РВ$. Заменяли РВ$ на 1% БСА 
2 мкл кДНК, 0.4 мкМ каждого праймера, 4 мкл 
5-кратной смеси аРСКпих-Н$. Программа ПЦР 
включала начальную денатурацию (1 мин, 94°С), 
затем 35 циклов: 94°С в течение 20 с, 58°С в течение 
ЗО си синтез при 72°С в течение 45 с. Продукты 
ПЦрРанализировали с помощью гель-электрофореза 
в 3% агарозном геле. Специфику продуктов ОТ-ПЦР 
оценивали по длине молекул ДНК с помощью мар- 
кера длин ДНК МаззВшег [Го\ Вапге ОМА Гаааег 
(Трегто Е15Бег ЗаепИийс, США). 
Статистический анализ. Обработку результатов 
проводили с использованием программы Ма аб 
(МашУ\У/огк$, США). Для сравнения показателей, 
полученных от клеток животных контрольной 
в РВ$ и инкубировали клетки | ч со вторичным 
поликлональным антителом козы, меченым АЕ488 
(АЕ488-анти-[С), против [>С кролика (А11034, 
Трегто Е15Бег Зс1епИНс) в разведении 1:100. Часть 
клеток инкубировали без добавки первичного ан- 
титела к 10 нАХР, но в присутствии вторичного 
антитела, меченого АЕ488. Для визуализации ядер 
добавляли 5 мкМ МисКеа за 15 мин до окончания 
инкубации. Затем клетки трижды промывали РВ®. 
Все процедуры проводили при 22°С. 
Для визуализации обеих субъединиц нАХР 
интенсивность флуоресценции регистрировали 
и “воспалительной” групп и подвергшихся раз- 
личным воздействиям, использовали тест Опе 
с использованием конфокального микроскопа 
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ 
№2 
том 41 
2024

ВЛИЯНИЕ ЛИГАНДОВ НИКОТИНОВЫХ АЦЕТИЛХОЛИНОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ... 
103 
Таблица 1. Перечень праймеров, использованных в работе 
Ген (кодируемый 
белок) 
Прямой 5’—>3? 
Обратный 5’—>3? 
Ас (В-актин) 
СТТСТТОССТАТССААТССТС 
СТТСАТСТТСАТСОТССТАСС 
Сйтпа3 (а3) 
СААСССАТССАААСТСТСААС 
ТОТСАТСТСТОСССАТСААС 
Сйтпа7 
(©Т) 
СОТОССССТСТСАСТСОТСС 
АССТОСОСТСАССТССАСАС 
Сйтпа9 (99) 
САСОТСАСОСТСТСССАС 
ССОТСАТАСТСОТСТССАТСС 
Сйтпа 10 (910) 
СОСАСАСАСАСАССАСАСТС 
СОТСССААТОТАССТАСССС 
Сить? (В2) 
АССОСТТСОСТООССССТТТС 
ТОсСАССТОССАССТСАСТСОТ 
контрольных животных и животных с воспалением 
(табл. 3). В концентрациях 0.01 и 1 мкМ, пример- 
но соответствующих уровню никотина в крови 
курильщиков [40, 41], никотин оказывал более 
сильное действие на адгезию клеток животных 
У/ау АМО\ХА Юг Капк$ с поправкой Холма— Шида- 
ка и критерий Манна-—Уитни (КапкК Зит Тез() для 
сравнения результатов внутри каждой из групп 
животных. В таблицах и на рисунках численные 
результаты представлены в виде средних значений 
1 стандартная ошибка с указанием количества 
независимых измерений. Различия считались зна- 
чимыми прир 
< 
0.05. 
РЕЗУЛЬТАТЫ 
Определение количества изолированных клеток. 
Количество зрелых гранулоцитов, изолированных 
из брюшной полости животных, было значительно 
выше при наличии у них острого воспаления, что 
указывает на усиленную миграцию нейтрофилов 
с воспалением, чем клеток контролей. Таким об- 
разом, в обеих группах экзогенный никотин по- 
тенцировал способность КМ-нейтрофилов к при- 
креплению на субстрате. Участие нАХР разного 
типа в регуляции адгезии и действии никотина на 
нее было проверено с использованием известных 
селективных антагонистов нАХР (тип рецептора 
указан в скобках): 10 нМ а-СТХ (&7); 10 нМ СТС 
(382); 5 и 200 нМ МП (аЗаб*В2 и 
7 /м3о6*В2 соот- 
ветственно); 10 нМ В21А и 50 нМ Ус1.1 (@9410) [24, 
42—46]. Исследовано одиночное действие токси- 
нов и действие никотина (100 мкМ) в присутствии 
одного из токсинов. 
в очаг инфицирования. Из костного мозга мы- 
шей с воспалением было выделено существенно 
меньшее количество зрелых гранулоцитов, чем из 
костного мозга контрольных животных (табл. 2). 
Вероятно, это связано с тем, что при развитии 
воспалительного процесса в ответ на введение 
зимозана зрелые нейтрофилы из крови мигрируют 
в очаг воспаления, а их пул в крови пополняется 
Ранее нами было показано, что в регуляции ад- 
гезии нейтрофилов из очага воспаления участвуют 
о3аб*В2, 7 нАХР [35], 
в КМ-гранулоцитах, кроме 
того, обнаружено участие а9а/10 в регуляции дан- 
ной функции. В настоящей работе с использова- 
нием а-СТХ, СС и МП (в двух концентрациях) 
исследована роль ©3а6*В2 и а7 нАХР в адгезии 
КМ-гранулоцитов контрольных мышей и живот- 
ных с воспалением (рис. 16-19). 
Селективный антагонист а7 нАХР а-СТХ 
(10 нМ) значительно усиливал адгезию нейтро- 
филов мышей обеих групп (рис. 16, два столбца 
слева), что указывает на регуляторную роль &@7 
НАХР (с отрицательным знаком). Никотин, при- 
мененный совместно с а-СТХ, не влиял на адгезию 
в контрольной группе и существенно блокировал 
за счет клеток костного мозга. В дальнейших экс- 
периментах были использованы нейтрофильные 
гранулоциты костного мозга (КМ-гранулоциты). 
Параметры адгезии при остром воспалении. Ко- 
личество прикрепившихся КМ-гранулоцитов, 
оцениваемое по оптической плотности, у живот- 
ных с острым воспалением не отличалось по аб- 
солютной величине от такового у контрольных 
животных: средние значения ОО.о›_4о5 составляли 
0.056 - 
0.008 в контроле (и = 16) и 0.054 + 0.006 
при воспалении (и = 16), таким образом, разли- 
чий в исходном уровне адгезии клеток мышей из 
разных групп не наблюдалось. 
ее в группе животных с воспалением, так что ве- 
личина их адгезии не отличалась от таковой у ин- 
тактных клеток (рис. 16, столбцы справа). Таким 
образом, в действии никотина на клетки животных 
Влияние лигандов нАХР на адгезию. Никотин 
(0.01—100 мкМ, 30 мин) в зависимости от кон- 
центрации усиливал адгезию КМ-гранулоцитов 
с воспалением а7 нАХР обеспечивал положитель- 
ную связь. 
2024
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ 
том 41 
№2