Глиальный нейротрофический фактор и цикл бодрствование - сон в экспериментальной модели болезни Паркинсона: морфофизиологический подход

Институт биологии гена Российской академии наук
Павлова Г.В., Ревищин А.В., Куст Н.Н.
Долгих В.В., Дорохов В.Б., Ковальзон В.М.
ГЛИАЛЬНЫЙ НЕЙРОТРОФИЧЕСКИЙ
ФАКТОР И ЦИКЛ БОДРСТВОВАНИЕ–СОН
В ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ БОЛЕЗНИ
ПАРКИНСОНА: МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ
ПОДХОД
Товарищество научных изданий КМК
Москва 2017

Павлова Г.В., Ревищин А.В., Куст Н.Н., Долгих В.В., Дорохов В.Б.,
Ковальзон В.М. Глиальный нейротрофический фактор и цикл бодрствование–сон в экспериментальной модели болезни Паркинсона: морфофизиологический подход. Москва: Товарищество научных изданий
КМК, 2017. 88 с.
Нейродегенеративные заболевания – Болезнь Паркинсона (БП), болезнь Альцгеймера, Боковой амиотрофический склероз и др. – имеют огромное социальное значение, так как во многих случаях это одна из основных причин инвалидности и смертности людей трудоспособного и пожилого возраста. На данный
момент не существует надежных методов диагностики ранних (доклинических)
стадий БП. Основным “маркером” доклинической стадии БП можно считать
нарушения поведения в фазе сна с быстрыми движениями глаз (RBD). Не существует и методов лечения, которые могли бы устранить причину БП, затормозить патологические процессы в головном мозге. Современные препараты лишь
уменьшают тяжесть симптомов БП. Именно поэтому поиск новых подходов для
лечения и профилактики болезни Паркинсона является одной из главных задач
современной неврологии. Важнейшее значение при этом приобретают методы
клеточной и генной терапии с использованием стволовых клеток.
В работе показано, что морфологические разрушения, нарушения цикла бодрствование–сон и уровня двигательной активности у мышей после введения выбранных доз МФТП могут рассматриваться как соответствующие модели ранних
стадий БП. Эти морфологические, физиологические и поведенческие нарушения не развиваются при использовании в качестве “антидота” генных конструкций, позволяющих доставлять GDNF непосредственно в стриатум, что свидетельствует о перспективности такого подхода. Эти данные в дальнейшем могут
быть использованы при разработке доклинической диагностики и терапевтических средств лечения БП.
Работа поддержана проектом РНФ 14-15-00942
ISBN  978-5-9909296-4-7
© Коллектив авторов, 2017.
© ИБГ РАН, 2017.
© ООО «КМК», издание, 2017.
2

Оглавление
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ..........................................................................5
ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................9
1.1. Болезнь Паркинсона: этиология и патогенез ...................................9
1.2. Гипотезы о механизмах патогенеза БП ..........................................13
1.3. Современная терапия БП и ее недостатки .....................................15
1.4. БП и нейротрофичекие факторы ....................................................19
1.5. GDNF терапия БП ..........................................................................24
1.5.1. Прямое введение GDNF в мозг ...............................................24
1.5.2. Генная терапия БП и GDNF ....................................................24
1.5.3.Клинические испытания GDNF ...............................................26
1.5.4. HEK293 и GDNF .....................................................................27
1.6. Нервно-психические нарушения при БП .......................................29
1.7. Особенности нарушений сна при БП.............................................31
1.8. Патофизиология нарушений сна при БП .......................................33
1.9. Экспериментальные модели паркинсонизма .................................34
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ....................................37
2.1. Методы исследований ....................................................................38
2.1.1. Модификация клеток: создание генно-инженерных
конструкций ......................................................................................38
2.1.2. Получение трансгенных клеточных культур ..........................39
2.1.3. Методика проведения двух этапов исследования ...................39
2.1.4. Методика введения пронейротоксина МФТП
(1 этап исследования) .......................................................................40
2.1.5. Ход опереации по введению клеток с трансгенным белком
GDNF и введение пронейротоксина МФТП (2 этап исследования)... 41
2.1.6. Операция по введению трансгенных клеток и вживлению
электродов.........................................................................................41
2.1.7. Извлечение гистологического материала ...............................44
2.1.8. Иммуногистохимическое окрашивание на
тирозингидроксилазу........................................................................44
2.1.9. Подсчёт клеток, иммунопозитивных по
тирозингидроксилазе и статистическая обработка ..........................45
2.1.10. Регистрация, визуализация и обработка
полисомнографических данных .......................................................47
2.2. Результаты гистологического исследования ..................................49
2.2.1. Численность ДА-эргических нейронов у контрольной группы
животных ..........................................................................................49
2.2.2. Численность ДА-эргических нейронов у животных,
которым МФТП вводили без предварительной инъекции клеток ...50
3

2.2.3. Численность ДА-эргических нейронов у животных, которым
за 3 дня до введения МФТП инъецировали клетки HEK/GFP, не
содержащие гена GDNF ................................................................... 51
2.2.4. Численность ДА-эргических нейронов у животных, которым
за 3 дня до введения МФТП инъецировали трансгенные клетки
HEK/GDNF/GFP ............................................................................... 52
2.3. Результаты исследования цикла бодрствование-сон ..................... 56
2.3.1. Влияние пронейротоксина МФТП на цикл бодрствование-сон
и двигательную активность .............................................................. 56
2.3.2. Влияние пронейротоксина МФТП и трансгенного белка
GDNF на цикл бодрствование-сон и двигательную активность ...... 60
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ........................................................... 63
3.1. Влияние пронейротоксина МФТП на численность ДА-эргических
нейронов среднего мозга ...................................................................... 63
3.2. Протекторное влияние вектора с модифицированным GDNF
на ДА-эргические нейроны в среднем мозге мышей с моделью БП ... 63
3.3. Сравнение гистологических изменений при монолатеральном
и при билатеральном введении ............................................................. 64
3.4. Влияние трансплантации клеток линии HEK293 без
трансгенного GDNF на численность ДА-эргических нейронов
в мозге мышей с моделью БП ............................................................... 66
3.5. Влияние МФТП на цикл бодрствование-сон ................................. 66
3.6. Протекторное влияние вектора с модифицированным GDNF
на цикл бодрствование-сон мышей с моделью БП............................... 70
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ......................................................................................... 75
ВЫВОДЫ .................................................................................................. 76
ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................ 77
4

СПИСОК СОКР
АЩЕНИЙ
6-OHDA – 6-гидроксидофамин
БС – быстрый сон1 (rapid eye movement sleep, REM-сон, сон с быстрыми
движениями глаз, парадоксальный сон)
БП – болезнь Паркинсона
ДА – дофаминергический
ГЭБ – гематоэнцефалический барьер
МАО-В – моноаминоксидаза-Б
МКГ – меланин-концентрирующий гормон
МС – медленный сон1 (NREM sleep, SWS, медленноволновый сон)
МФДП+ – 1-метил-4-фенил-2,3-дигидропиридин-ион
МФП+ – 1-метил-4-фенил-пиридин ион (MPP+)
МФТП – 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (MPTP)
СБН – синдром беспокойных ног
ЭЭГ – электроэнцефалограмма
BDNF – brain-derived neurotrophic factor (нейротрофический фактор мозга)
COMT – катехол-О-метилтрансфераза
DAT – dopamine transporter (переносчик дофамина)
GDNF – glial cell-derived neurotrophic factor (нейротрофический фактор глиальных клеток)
GFLs – GDNF family of ligands (семейство лигандов нейротрофических факторов глиальных клеток)
HEK – human embryonic kidney cells (эмбриональные клетки почки человека)
iRBD – идиопатический RBD
L-DOPA, L-ДОФА – левовращающий изомер диоксифенилаланина
RBD – REM Sleep Behavior Disorders (расстройства поведения в стадии REMсна)
SNС – substantia nigra pars compacta (компактная часть чёрной субстанции)
SNR – substantia nigra pars reticulata (ретикулярная часть чёрной субстанции)
TH – tyrosinehydroxylase (тирозингидроксилаза)
TH+ – тирозингидроксилаза-позитивный
VTA – ventral tegmental area (вентральная область покрышки)
1Термины «медленный» и «быстрый» сон имеют около десятка пар синонимов: медленноволновый – быстроволновый; обычный, ортодоксальный – парадоксальный;
сон без быстрых движений глаз – сон с быстрыми движениями глаз; теленцефалический – ромбэнцефалический; спокойный – активированный; синхронизированный-десинхронизированный и т.д. Единой общепринятой англоязычной терминологии пока не выработано. Здесь мы используем парные русскоязычные термины
«медленный сон – быстрый сон», рекомендованные основателем отечественной
«медицины сна» и физиологии сна человека, акад. РАМН А.М.Вейном (1928-2003).
5

ВВЕДЕНИЕ
Болезнь Паркинсона (БП) – второе по распространенности нейродегенеративное заболевание, которое развивается в пожилом возрасте и
характеризуется нарушениями двигательной активности – тремором, ригидностью, брадикинезией, а на поздней стадии и когнитивными расстройствами (Крыжановский и др., 2002). БП сопровождается потерей
дофаминергических (ДА) нейронов в компактной части черной субстанции среднего мозга (substantia nigra/pars compacta, SNC) (Seidl et al., 2014).
Процесс дегенерации протекает без видимых клинических проявлений
благодаря активации компенсаторных механизмов (Zigmond, 1997;
Bezard, Gross, 1998; Bergstrom, Garris, 2003; Bezard et al., 2003); симптомы возникают лишь, когда гибель ДА нейронов достигает критического
порога в 50–60% от общей численности нейронов компактной части черной субстанции, а уровень дофамина, доставляемого в стриатум этими
нейронами, падает в 4 раза (Bernheimer et al., 1973). Лечение на этой
стадии уже неэффективно, возможно лишь медикаментозное облегчение симптомов и, в некоторых случаях, незначительное замедление развития заболевания (Kang et al., 2012; Chan et al., 2007), поэтому поиск
ранних диагностических маркеров является сейчас первостепенной задачей (Ковальзон, Завалко, 2013; Ковальзон и др., 2014).
Большинство (от 60 до 98%, по данным разных авторов) пациентов,
страдающих БП, имеют нарушения цикла бодрствование-сон, причем
ряд исследований показывает, что эти симптомы обычно возникают рано,
в самом начале болезни (Lees et al., 1988; Nausieda et al., 1982; Tandberg
et al., 1998; Гусев и др., 2010; Mehta et al., 2008; Zoccolella et al., 2011).
Нарушения сна при БП многообразны и представлены инсомниями, парасомниями, а также дневной сонливостью (De Cock et al., 2008). Расстройства сна могут на много лет опережать появление первых моторных симптомов болезни и вследствие этого служить ранними предикторами БП (Abbott et al., 2005; Postuma et al., 2006). Эти данные указывают
на необходимость более детального исследования изменений, связанных
с нарушением структуры цикла бодрствование-сон при БП, их физиологических и биохимических основ (Ковальзон, Завалко, 2013; Ковальзон
и др. 2014).
Моделирование паркинсонизма чаще всего осуществляется на крысах путем введения в мозг 6-гидроксидофамина – нейротоксина для ДА
нейронов, а также на мышах и приматах путем введения 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (МФТП), который в глиальных клетках
превращается в 1-метил-4-фенилпиридин ион (МФП+) – нейротоксин
(Scheider J.S. at al, 2008). Вторая модель представляется более адекватной, поскольку МФТП, в отличие от 6-гидроксидофамина, (а) проникает
через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), оказывая при системном введении токсическое влияние как на мозг, так и на периферию; (б) вызывает нарушение моторного поведения, сходное с симптомами у больных.
В подавляющем большинстве работ по моделированию БП использова6

лись высокие полулетальные дозы токсина, что приводило к быстрому
развитию «клинической» стадии, фактически минуя «доклиническую».
В Институте биологии развития (ИБР) РАН (лаборатории академика
М.В.Угрюмова) разработаны нейротоксические модели доклинической,
переходной и ранней клинической стадий БП, в которых мышам линии
С57BL/6 вводят подкожно специфический протоксин ДА нейронов –
МФТП (Хаиндрава В.Г. и др., 2010). При введении в малой дозе (12 мг/
кг) двукратно с двухчасовым интервалом у животных в течение двух
недель развивается так называемая «досимптомная» стадия БП. При 4кратном введении (с 2-часовыми интервалами) – переходная. При однократном в дозе 40 мг/кг – ранняя клиническая. Стадии идентифицировали по первым проявлениям нарушения моторного поведения, причем
только по наиболее чувствительному тесту – длине шага, а также по результатам гистологического исследования. Изменения ЭЭГ в цикле бодрствование-сон, как ранние маркеры БП, в этой модели до настоящего
времени не изучались. Мы задались целью, на первом этапе настоящей
работы,  выявить изменения ЭЭГ и двигательной активности в цикле
бодрствование-сон на вышеперечисленных ранних стадиях БП при использовании нейротоксической (МФТП) модели на мышах.
На следующем этапе исследования мы решили проверить возможный протекторный эффект от введения клеток линии НЕК293, трансгенных по GDNF
, непосредственно в стриатум экспериментальных
мышей с ранней клинической стадией БП (МФТП-модель) по показателям ЭЭГ в цикле бодрствование-сон и двигательной активности. Были
разработаны методы подготовки и применения клеточного материала для
трансплантации животным с экспериментальной нейродегенерацией. С
помощью вектора с плазмидной конструкцией можно внедрять глиальный нейротрофический фактор (ГНФ, GDNF) в мозг экспериментальной модели. Что и было сделано: клетки НЕК293 были транфицированы
с помощью плазмидной конструкции, содержащей ген новой изоформы
GDNF, ген устойчивости к гентамицину, а также ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) для контроля введения конструкции (Kust et al.,
2015).
Известно, что глиальный нейротрофический фактор (glial cell linederived neurotrophic factor, GDNF) был впервые выделен в 1993 г. из глиальных клеток крыс (Lin et al., 1993). Введенный в мозг очищенный белок GDNF был охарактеризован как фактор выживания ДА нейронов
среднего мозга, который также вызывал морфологическую дифференциацию ДА клеток мозга и высокоафинный обратный захват дофамина
в культурах ДА нейронов среднего мозга, без явного влияния на не-ДА
нейроны или глиальные клетки (Lin et al., 1993). Для GDNF характерен
ретроградный транспорт зрелых молекул по аксону. Его функция – сохранение различных популяций клеток центральной и периферической
нервной системы, включая и ДА нейроны. Он влияет на рост аксонов,
экспрессию генов функционально значимых белков.
7

Уровень GDNF, измеренного в материале больных БП, оказался существенно выше в нигростриатных ДА нейронах и их проекциях (SNC,
хвостатое ядро, скорлупа), нежели в мозжечке и фронтальной коре (Mogy
et al, 2001). Поскольку GDNF не проходит через ГЭБ, его локальная доставка в стриатум рассматривается как способ терапии БП (Kirik et al,
2004). Введение 7,5–22,5 мкг/сутки GDNF в боковые желудочки мозга,
SNC и скорлупу способствовало восстановлению нигростриатной ДА
регуляции, значительно улучшало моторную функцию, а также снижало показатели неврологического дефицита у обезьян с МФТП-повреждениями мозга. Продолженный в клинике больных БП этот подход (инфузия GDNF микронасосом в дорзальную часть скорлупы) улучшал моторные функции у пациентов (Grondin et al, 2003). Несмотря на эффективность GDNF в модельных исследованиях на грызунах и приматах,
было показано, что после прекращения кратковременной терапии GDNF
состояние животного медленно ухудшалось вплоть до исходного уровня
(Zhang, 1997). Таким образом, для поддержания дофаминотрофического эффекта необходимо длительное регулярное введение GDNF.
В настоящей работе были поставлены следующие цели:
1. Проверить, можно ли считать нарушения цикла бодрствование-сон
на токсической модели неспецифическими маркерами БП на ее ранних
стадиях;
2. Проверить, могут ли трансгенные клетки HEK293/mGDNF, экспрессирующие белок GDNF, при их инъекции в стриатум экспериментальных мышей с моделью ранней клинической стадии БП, повлиять на
сохранность ДА нейронов, нвосстановление цикла бодрствование-сон и
уровень двигательной активности животных.
Для достижения поставленных целей были выполнены следующие
работы:
1) На мышах C57BL/6 с предварительным введением умеренных доз
пронейротоксина МФТП (MPTP) исследовали морфологию ДА нейронов SNC и VTA, динамику изменений цикла бодрствование-сон (по показателям ЭЭГ) и двигательной активности, которые могут быть индикаторами нарушений,  сходных с симптомами развития БП.
2) Проверить возможность того, что с помощью внутримозгового введения в область стриатума нового источника GDNF – трансгенных клеток HEK/GDNF противодействовать этим нарушениям.
8

1. ОБЗОР ЛИТЕР
АТУРЫ
1.1. Болезнь Паркинсона: этиология и патогенез
БП является одним из самых распространенных социально значимых
нейродегенеративных заболеваний. БП заболевает примерно каждый
сотый человек, перешагнувший шестидесятилетний рубеж; на сегодняшний день, по данным ООН, им страдают около 6 млн. человек. Стоит
также отметить, что у мужчин данное заболевание встречается чаще,
чем у женщин. Эта болезнь вызывает дрожь в руках, общую скованность
и, как следствие, проблемы с ходьбой и другими движениями, а также
часто осложняется другими заболеваниями, которые рано или поздно
приводят к смерти больного. Жертвами БП стали такие известные личности, как боксер Мохаммед Али, политик Ясер Арафат и Папа Римский Иоанн Павел II.
Своим названием БП обязана французскому неврологу Жану Шарко,
который предложил назвать её в честь британского врача и автора «Эссе
о дрожательном параличе» Джеймса Паркинсона, чей труд не был должным образом оценён при жизни. Таким образом, во второй половине XIX
века официально было зарегистрировано нейродегенеративное заболевание, которое на сегодняшний день по распространённости занимает
второе место после болезни Альцгеймера.
БП обусловлена, в основном, дегенерацией нейронов SNC и других
пигментсодержащих ядер ствола головного мозга, и проявляется преимущественно двигательными нарушениями в виде гипокинезии, ригидности мышц, тремора покоя и постуральной неустойчивости, а также
вегетативными, когнитивными и другими расстройствами.
БП характеризуется неуклонной дегенерацией ДА нейронов. Вследствие утраты нейронов SNC резко падает содержание дофамина в стриатуме и фермента тирозингидроксилазы (TH), а также уменьшение числа ДА рецепторов. Предположительно, истощение дофамина приводит
к гиперактивности тормозного пути от стриатума (хвостатое ядро) к бледному шару (которые составляют экстрапирамидную систему), и соответствующим растормаживанием нейронов таламических паравентрикулярных и латеральных вентрикулярных ядер. В свою очередь, эти нейроны вызывают активацию нейронов двигательной коры и, следовательно, усиление разрядов мотонейронов, в том числе гамма-мотонейронов.
В норме экстрапирамидная система посылает импульсы к периферическим двигательным нейронам. Эти сигналы играют важную роль в обеспечении миостатики путём готовности мышц к произвольным движениям. От деятельности данного отдела центральной нервной системы зависит способность человека принимать оптимальную для намеченного
действия позу, достигается необходимое соотношение тонуса мышц-агонистов и антагонистов, а также плавность и соразмерность произвольных движений во времени и пространстве. Таким образом, при БП имеет место дефицит ДА влияний при усилении глутаматергических и хо9