Физико-химические исследования спектральными методами

 
 
 
 
В. С. Маряхина 
 
 
 
 
 
 
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ  
СПЕКТРАЛЬНЫМИ МЕТОДАМИ 
 
 
Монография 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Москва    Вологда 
«Инфра-Инженерия» 
2024 

УДК 543.42 
ББК 22.344 
М25 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Маряхина, В. С. 
М25   
Физико-химические исследования спектральными методами : монография / В. С. Маряхина. - Москва ; Вологда : Инфра-Инженерия, 2024. - 
148 с. : ил., табл. 
ISBN 978-5-9729-1846-1 
 
Рассмотрены наиболее распространённые методы спектрального анализа, в основе 
которых лежит поглощение света с возможным последующим свечением. Кратко описаны фундаментальные основы каждого метода спектрального анализа, возможности 
его применения и связанные с этим трудности пробоподготовки. Наибольшее внимание 
уделяется способам математической обработки экспериментальных данных и их интерпретации.  
Для научных сотрудников физико-математических, биологических и химических 
специальностей. Может быть использовано в качестве учебного пособия для студентов 
и аспирантов технических специальностей. 
 
УДК 543.42 
ББК 22.344 
 
 
 
 
ISBN 978-5-9729-1846-1 
” Маряхина В. С., 2024 
 
” Издательство «Инфра-Инженерия», 2024 
 
” Оформление. Издательство «Инфра-Инженерия», 2024 
 
2 
 

ОГЛАВЛЕНИЕ 
 
ПРЕДИСЛОВИЕ 
.................................................................................................. 5 
ГЛАВА 1 АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ ...................................... 7 
Теоретические основы метода абсорбционной спектроскопии .................. 7 
Аппаратура для измерений спектров поглощения ..................................... 10 
Идентификация органических соединений 
................................................. 14 
Анализ смесей органических и неорганических соединений ................... 15 
Определение концентрации вещества в растворе ...................................... 23 
Определение размеров частиц в суспензии 
................................................. 26 
Исследование биохимического состава клеток .......................................... 29 
	  Список литературы к главе 1 ................................................................. 33 
ГЛАВА 2 ФЛУОРИМЕТРИЯ 
........................................................................... 36 
Теоретические основы флуориметрии 
......................................................... 36 
Аппаратура для измерения спектров флуоресценции 
................................ 37 
Измерение дозы ионизирующего излучения .............................................. 40 
Фазовый состав металлоструктур и полупроводников 
.............................. 40 
Исследование кинетики химических реакций в неподвижной среде 
....... 43 
Динамика спектров флуоресценции вещества в потоке жидкости 
........... 48 
Изучение стрессовых состояний растений 
.................................................. 56 
Флуоресцентная диагностика биологических тканей ................................ 58 
Исследование биохимического анализа крови ........................................... 64 
	  Список литературы к главе 2 ................................................................. 66 
ГЛАВА 3 ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ МИКРОСКОПИЯ ..................................... 70 
Теоретические основы флуоресцентной микроскопии 
.............................. 70 
Аппаратура для флуоресцентной микроскопии ......................................... 72 
Определение концентрации микроэлементов 
............................................. 73 
Анализ живых клеток и тканей 
..................................................................... 76 
Отслеживание биохимических реакций ...................................................... 80 
	  Список литературы к главе 3 ................................................................. 83 
ГЛАВА 4 ИНФРАКРАСНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ ...................................... 85 
Теоретические основы ИК-спектроскопии ................................................. 85 
Аппаратура для измерения ИК-спектров .................................................... 86 
Идентификация органических соединений 
................................................. 88 
Химический анализ смесей ........................................................................... 93 
Отслеживание химических реакций 
............................................................. 96 
3 
 

Определение размеров наночастиц в растворе ......................................... 100 
Исследование алюмосиликатных систем .................................................. 101 
Диагностика биологических тканей 
........................................................... 103 
Рост бактерий во время их культивирования 
............................................ 105 
Диагностика заболеваний растений ........................................................... 107 
	  Список литературы к главе 4 ............................................................... 108 
ГЛАВА 5СПЕКТРОСКОПИЯ ДИФФУЗНОГО РАССЕЯНИЯ СВЕТА 
... 110 
Теоретические основы метода спектроскопии   
диффузного рассеяния света ....................................................................... 110 
Аппаратура для измерений методом диффузного рассеяния света 
........ 114 
Определение размеров клеток в растворе ................................................. 115 
Определение размеров биологически активных веществ 
........................ 116 
Синтез липосом ............................................................................................ 118 
	  Список литературы к главе 5 ............................................................... 119 
ГЛАВА 6 ЛАЗЕРНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ 
................................................. 120 
Теоретические основы лазерной спектроскопии 
...................................... 120 
Аппаратура для лазерной спектроскопии 
.................................................. 123 
Области применения лазер-индуцированной флуоресценции 
................ 126 
Регистрация молекулярного кислорода ..................................................... 128 
Замедленная флуоресценция зондов и фотосенсибилизаторов .............. 132 
Исследование кинетики фосфоресценции зондов .................................... 138 
Террагерцевая спектроскопия 
..................................................................... 139 
Анализ культур клеток на их бактериальное загрязнение 
....................... 141 
Химический анализ выдыхаемых газов 
..................................................... 142 
Исследование реакций фотосинтеза 
........................................................... 143 
	  Список литературы к главе 6 ............................................................... 145 

 
 
4 
 

ПРЕДИСЛОВИЕ 
 
Выполнение современных научных исследований часто связано с использованием современной компьютерной техники и приборов, регистрация сигналов 
которыми автоматизирована с помощью современного программного обеспечения. Это даёт свои преимущества при выполнении исследований, например, увеличение скорости регистрации сигналов, облегчение способов обработки экспериментальных и теоретических данных. Это касается почти всех методов исследования, не исключением являются и спектральные методы химического анализа. Они нашли широкое применение в различных областях науки: в химии, 
криминалистке, физике, токсикологии и др. Более того, анализ сложных веществ 
контролирующими организациями, в том числе и санитарно-эпидемиологической станцией, производится часто с помощью спектральных методов анализа. 
Контроль качества поставляемой продукции с промышленных предприятий 
также использует эти методы анализа, благодаря их высокой чувствительности 
к химическому составу исследуемого объекта. Определение концентрации веществ в исследуемой смеси возможно даже тогда, когда их концентрация составляет десятые и сотые доли процента.  
В настоящей монографии описаны основные спектральные методы анализа 
веществ, которые наиболее часто используются при решении научных и производственных задач. Настоящее издание является результатом существенной переработки предыдущего издания под названием «Оптические методы в химии, 
биологии и медицине», которое было ориентировано в основном на специалистов биомедицинского профиля, поэтому большинство физико-математических 
аспектов было специально опущено. В этом издании автор изложил не только 
саму суть каждого метода анализа и возможные способы его применения в науке 
и производстве, но и возможную математическую обработку экспериментально 
полученных результатов. Описываются также и трудности, с которыми каждый 
лаборант может столкнуться во время измерений. 
Монография состоит из 6 глав, в каждой из которых приведено теоретическое описание метода спектрального анализа и особенности пробоподготовки и 
используемой для этого современной аппаратуры. Затем следуют примеры самых разных применений конкретного метода анализа и связанные с этим особенности математической обработки экспериментальных данных. Последние редко 
приводятся в книгах этого профиля, хотя знания математической обработки экспериментальных данных могут существенно облегчить работу лаборанта и научного сотрудника. В некоторых параграфах приводится справочный материал, 
представленный таблицами с наиболее значимой для решения поставленных 
практических задач информацией. Изложенный в монографии материал основывается преимущественно на опыте работы автора и его взаимодействии с другими научными группами. Поэтому в настоящем издании особое внимание уделяется практическому применению спектральных методов анализа, а не их теоретическим аспектам. 
5 
 

Монография может быть использована также в качестве учебного пособия 
для студентов и аспирантов технических специальностей ВУЗов, а также для 
научных сотрудников физико-математических, биологических и химических 
специальностей. 
 
 
 
6 
 

ГЛАВА 1 
АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ 
 
Написание книги по спектроскопии вполне логично начать с обсуждения 
регистрации спектров поглощения света потому, что именно они отражают процесс поглощения света веществом излучения выбранной области спектра. Несмотря на примитивность явления поглощения света веществом, этот метод 
нашёл широкое применение, благодаря своей высокой чувствительности. С его 
помощью возможно определение вещества с концентрацией в несколько микрограмм в литре раствора. Изменение химического состава вещества, образование 
новой фазы также влечёт за собой изменения в спектрах поглощения. Как правило, это сопровождается либо образованием новых максимумов в спектрах, 
либо уменьшением, или исчезновением максимумов в них. В следующих параграфах изложены особенности регистрации и интерпретации электронных спектров поглощения. 
 
Теоретические основы метода абсорбционной спектроскопии 
 
Метод абсорбционной спектроскопии (спектрофотометрии) основан на переходе электрона в возбуждённое состояние после поглощения им кванта света. 
В этом разделе будем рассматривать свет ультрафиолетовой и видимой области 
спектра. Почти все вещества способны поглощать ультрафиолет хотя бы частично, редкие вещества являются оптически прозрачными в ультрафиолете. 
Каждое вещество имеет основной уровень, на котором обычно находится валентный электрон, и одно или несколько его возбуждённых состояний, на которые 
он может перейти после поглощения света определённой длины волны. В то же 
время, каждый уровень энергии электрона имеет несколько подуровней (на рисунке 1 они изображены тонкими линиями), которые являются колебательными 
уровнями энергии. Процесс перехода с основного состояния в одно из возбужденных состояний имеет вероятностную природу. Это значит, что существует 
ненулевая вероятность того, что электрон перейдёт из основного состояния в 
одно из колебательных состояний, каждое из которых характеризуется своим 
уровнем энергии. Уровни энергии электрона связаны с длиной волны по закону 
 
Q
c
h
h
E
 
 
, 
 (1) 
 
O
 
где E - энергия, Дж; Ȟ - частота света, с-1; Ȝ - длина волны, нм. 
 
В случае поглощения валентным электроном кванта света с большей энергией, чем энергия самого верхнего колебательного уровня основного состояния 
S0, он перейдёт на один из колебательных уровней возбуждённого состояния S1, 
7 
 

или на следующий энергетический уровень, т. е. во второе возбуждённое состояние S2, если таковое возможно для выбранного вещества, или произойдёт ионизация.  
Поскольку вероятность перехода электрона на каждый из колебательных 
уровней разная, то интенсивность сигнала на каждой длине волны, характеризующий энергетический уровень, будет разной. Чем более вероятный переход, тем более интенсивный сигнал он образует. Это наглядно продемонстрировано на рисунке 2. Любой спектр характеризуется максимумом интенсивности 
2
O  и полушириной спектра, которая определяется как разность между длинами волн 
3
1
O
O
O
'
 

 соответствующими уровням интенсивности спектра на половине его 
высоты 0,5 Imax. Длины волн Ȝ4 и Ȝ5 характеризуют начало и конец спектра, которые 
иногда требуются для математической обработки экспериментальных данных. 
 
 
 
Рис. 1. Диаграмма Яблонского, отображающая процесс поглощения света веществом 
 
 
 
Рис. 2. Пример электронного спектра поглощения света веществом 
 
Все экспериментально полученные спектры имеют вероятностную природу 
и подчиняются либо Гауссову, либо Лоренцевому распределению, согласно которым электрон переходит из основного в возбуждённое состояние с некоторой 
долей вероятности. Эти вероятности можно определить по формулам для Лоренцевого  
 
2
 
1
( )
,
(
)
P
J O
O
S O
O
J O
 


  
(2) 
2
2
2
max
8 
 

и Гауссового распределений 
 
§
·

 

¨
¸
©
¹
 
2
max
2
2
1
(
)
( )
exp
,
2
2
P
O
O
O
J
S J
 
в которых Ȝmax - длина волны максимума спектра (Ȝ2 из рисунка 2), а Ȗ является 
положительной величиной, параметром масштаба, определяющим полуширину 
спектра.  
Эти распределения имеют общий вид кривой, как на рисунке 2, однако отличаются между собой полушириной кривой ǻȜ. Большинство спектров математически описывается Лоренцевым распределением. 
Вещество имеет толщину l и на него падает свет интенсивностью I0, Свет 
частично поглощается исследуемым веществом, поэтому интенсивность регистрируемого света I(Ȝ) на любой длине волны Ȝ будет значительно ниже интенсивности падающего света, что схематично изображено на рисунке 3. Учитывая 
формулу (2) для распределения Лоренца, можно утверждать, что интенсивность 
I(Ȝ) регистрируемого света также будет иметь форму распределения Лоренца для 
каждого отдельного вещества, входящего в состав исследуемого раствора.  
Поэтому можно записать формулу для интенсивности регистрируемого света  
в момент времени t 
 
1
( )
.
(
)
I
I
J O
O
S O
O
J O
 


 
2
0
2
2
2
max
 
Для определения количества поглощённого света пользуются величиной 
оптической плотности, рассчитанной по закону Бугера – Ламберта – Бера 
 
 
 
 
 
0
lg I
D
C l
I
O
O
H O
 
 
 , 
 (3) 
  
где İ - коэффициент экстинкции, см2 моль-1; C - концентрация вещества, моль/л. 
В спектральном анализе иногда используется величина пропускания, которая обратнопропорциональна величине оптической плотности. Именно из-за распределения Лоренца спектры поглощения
 
O
D
, имеют форму, схематически изображённую на рисунке 2. 
 
 
Рис. 3. Поглощение света в слое вещества 
9 
 

Оптическая плотность D варьируется в диапазоне значений приблизительно 
от 0,1 до 1,8. Другие значения оптической плотности не корректны из-за того, 
что имеют большую систематическую погрешность, связанную с чувствительностью прибора. 
Закон Бугера - Ламберта - Бера выполняется только для монохроматического излучения, т. е. для каждой длины волны необходимо рассчитывать значение оптической плотности. 
Коэффициент экстинкции İ представляет собой величину количества фотонов, поглощаемых 1 моль исследуемого вещества с толщиной 1 см. Бывает, что 
спектры поглощения представляют не только в виде зависимости оптической 
плотности от длины волны 
 
 
O
O
f
D
 
, но и в виде зависимости коэффициента 
экстинкции от длины волны  
 
O
O
H
f
 
. Это нужно для удобства в том случае, 
если сравниваются спектры вещества различных концентраций, либо спектры 
поглощения разных веществ существенно различающихся по коэффициенту  
экстинкции. В общем случае оптическая плотность прямопропорциональна  
концентрации исследуемого вещества, но при определённом значении концентрации некоторые вещества могут образовывать димеры и тримеры молекул, которые могут также давать свой вклад в спектры поглощения, из-за чего происходит отклонение от закона Бугера - Ламберта - Бера. Почти все органические  
и неорганические вещества поглощают свет в ультрафиолете. Цветные растворы 
поглощают свет и в видимой области спектра, в то время, как бесцветные растворы оптически прозрачны в видимой области спектра в случае отсутствия взвешенных частиц в исследуемом растворе. В случае исследования смеси веществ 
оптическая плотность может быть рассчитана не по формуле (3), а как сумма  
оптической плотности каждого из компонентов смеси согласно следующей  
формуле 
 
 
 
 
 
 
 
1
2
3
i
i
D
D
D
D
D
O
O
O
O
O
 


 ¦
.  
(4) 
 
В следующих разделах будут рассмотрены примеры спектров поглощения 
и способы их интерпретации. 
 
 
Аппаратура для измерений спектров поглощения 
 
Регистрация спектров поглощения производится спектрофотометрами  
(рис. 4) и спектрофлуориметрами, работающими в фотометрическом режиме. Такие приборы позволяют регистрировать сигналы в диапазоне волн 200·800 нм с 
разрешением 0,5·1 нм. Программное обеспечение приборов позволяет выставить нужное значение ширин щелей монохроматоров для более точных измерений. От ширины щели монохроматора зависит интенсивность падающего света 
и регистрируемого сигнала светового потока, а значит, и регистрируемых спектров. В каждой из серии измерений ширина щели монохроматора должна быть 
одинаковой.  
10