Морфофункциональное изучение органов пищеварения полорогих (Bovidae). Методическое пособие

ÈÍÑÒÈÒÓÒ ÏÐÎÁËÅÌ ÝÊÎËÎÃÈÈ È ÝÂÎËÞÖÈÈ
èì. À.Í. ÑÅÂÅÐÖÎÂÀ ÐÎÑÑÈÉÑÊÎÉ ÀÊÀÄÅÌÈÈ ÍÀÓÊ
Ð.Ì. ÕÀÖÀÅÂÀ
ÌÎÐÔÎÔÓÍÊÖÈÎÍÀËÜÍÎÅ ÈÇÓ×ÅÍÈÅ ÎÐÃÀÍÎÂ
ÏÈÙÅÂÀÐÅÍÈß ÏÎËÎÐÎÃÈÕ (BOVIDAE)
ÌÅÒÎÄÈ×ÅÑÊÈÅ ÐÅÊÎÌÅÍÄÀÖÈÈ
ÒÎÂÀÐÈÙÅÑÒÂÎ ÍÀÓ×ÍÛÕ ÈÇÄÀÍÈÉ ÊÌÊ
ÌÎÑÊÂÀ 201
7

ÓÄÊ: 591.43
Õàöàåâà Ð.Ì. Ìîðôîôóíêöèîíàëüíîå èçó÷åíèå îðãàíîâ ïèùåâàðåíèÿ ïîëîðîãèõ (Bovidae) (Ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè). Ì.: Òîâàðèùåñòâî
íàó÷íûõ èçäàíèé ÊÌÊ. 2017. 96 ñ.
 íàñòîÿùåì ìåòîäè÷åñêîì ðóêîâîäñòâå âïåðâûå ïðåäñòàâëåí ïîëíûé êîìïëåêñ
ñîâðåìåííûõ àíàòîìî-ãèñòîëîãè÷åñêèõ, ãèñòîõèìè÷åñêèõ, áèîõèìè÷åñêèõ è ýëåêòðîííî-ìèêðîñêîïè÷åñêèõ ìåòîäîâ ìîðôîôóíêöèîíàëüíîãî èññëåäîâàíèÿ îðãàíîâ æåëóäî÷íî-êèøå÷íîãî òðàêòà æâà÷íûõ êîïûòíûõ. Ýòè ìåòîäû àïðîáèðîâàíû àâòîðîì
ïðè èçó÷åíèè îðãàíîâ ïèùåâàðåíèÿ æâà÷íûõ ïîëîðîãèõ (äîìàøíèõ è äèêèõ âèäîâ
Caprinae è Bovinae), à äëÿ ñðàâíåíèÿ –  íåæâà÷íûõ ñâèíûõ (Suidae).
Ìåòîäè÷åñêîå ðóêîâîäñòâî îñíîâàíî íà ðåêîìåíäàöèÿõ ïî ìîðôîôóíêöèîíàëüíîìó èçó÷åíèþ îðãàíîâ ïèùåâàðåíèÿ êîïûòíûõ (Äàâëåòîâà è äð., 1986) ñ âíåñåíèåì èñïðàâëåíèé è äîïîëíåíèé, ïîëó÷åííûõ áëàãîäàðÿ ïðèìåíåíèþ ñîâðåìåííûõ
ãèñòîëîãè÷åñêèõ è ýëåêòðîííî-ìèêðîñêîïè÷åñêèõ ìåòîäîâ èññëåäîâàíèÿ.
Íàñòîÿùèå ìåòîäè÷åñêèå ðåêîìåíäàöèè çàíÿëè I ìåñòî â ìåæäóíàðîäíîì ïðîôåññèîíàëüíîì êîíêóðñå ïðåïîäàâàòåëåé âóçîâ Ó÷åáíî-ìåòîäè÷åñêèé êîìïëåêñ äèñöèïëèíû – 2017 (â ðàìêàõ òðåáîâàíèé ÔÃÎÑ), à àííîòàöèÿ êíèãè âîøëà â êàòàëîã
Ôðàíêôóðòñêîé êíèæíîé âûñòàâêè (11–15 îêòÿáðÿ 2017 ãîäà, Ôðàíêôóðò-íà-Ìàéíå, Ãåðìàíèÿ).
Ðóêîâîäñòâî ïðåäñòàâëÿåò èíòåðåñ äëÿ øèðîêîãî êðóãà èññëåäîâàòåëåé –  ìîðôîëîãîâ, ãèñòîëîãîâ, ýêîëîãîâ, çîîëîãîâ, ôèçèîëîãîâ, ãèñòîõèìèêîâ, áèîõèìèêîâ è
âåòåðèíàðîâ.
Îòâåòñòâåííûé ðåäàêòîð:
ä.á.í. Î.Ô. ×åðíîâà (ÈÏÝÝ ÐÀÍ).
Ðåöåíçåíòû:
ä.â.í. Ñ.Á. Ñåëåçíåâ (ÐÓÄÍ).
ê.á.í. Í.Â. Áóëÿêîâà (ÈÏÝÝ ÐÀÍ).
Ðàáîòà âûïîëíåíà ïðè ïîääåðæêå ïðîãðàììû Ïðåçèäèóìà ÐÀÍ
«Áèîðàçíîîáðàçèå ïðèðîäíûõ ñèñòåì. Áèîëîãè÷åñêèå ðåñóðñû Ðîññèè: îöåíêà
ñîñòîÿíèÿ è ôóíäàìåíòàëüíûå îñíîâû ìîíèòîðèíãà»
ISBN 978-5-6040241-6-4
© Ð.Ì. Õàöàåâà, 2017
© ÈÏÝÝ èì. À.Í. Ñåâåðöîâà ÐÀÍ, 2017
© Òîâàðèùåñòâî íàó÷íûõ èçäàíèé ÊÌÊ, èçäàíèå, 2017

ÎÃËÀÂËÅÍÈÅ
ВВЕДЕНИЕ .......................................................................................................5
Глава 1. МОРФОМЕТРИЯ ОРГАНОВ ПИЩЕВАРЕНИЯ............................7
Правила получения весовых, линейных и объемных показателей
и методы их обработки ................................................................................7
Биометрическая обработка .......................................................................10
Глава 2. ГИСТОЛОГИЯ ОРГАНОВ ПИЩЕВАРЕНИЯ ..............................13
Желудочно-кишечный тракт .....................................................................13
Фиксация материала ..................................................................................13
Заливка материала и приготовление парафиновых срезов ....................15
Окраска препаратов, метод Доминичи–Кедровского .............................16
Измерение толщины слоев и оболочек отделов желудочно-кишечного
тракта ..........................................................................................................18
Определение плотности расположения желез в сычуге ........................19
Поджелудочная железа ..............................................................................20
Окраска препаратов азокармином, метод Гейденгайна с докраской
по Маллори .................................................................................................20
Окраска препаратов кислым фуксином со светлым зеленым ...............21
Окраска препаратов гематоксилином, метод Гомори .............................22
Окраска препаратов альдегид-фуксином.................................................23
Определение соотношения разных частей поджелудочной железы,
высоты ацинозных клеток, величины их ядер и размера островков ....24
Печень .........................................................................................................25
Окраска препаратов гематоксилином Карацци с докраской эозином ..26
Окраска препаратов железным гематоксилином, метод Рего................26
Определение размеров гепатоцита, его ядра, цитоплазмы, ядерноцитоплазматического отношения и соотношения сосудистого
и желчного полюсов ..................................................................................27
Глава 3. ГИСТОХИМИЯ ОРГАНОВ ПИЩЕВАРЕНИЯ .............................29
Гликоген ......................................................................................................30
Фиксация материала, метод Шабадаша ...................................................31
Применение реактива Шиффа (ШИК-реакция .......................................32
Гликопротеины ...........................................................................................33
Нейтральные гликопротеины и сиалосахариды .....................................34
Кислые несульфатированные полисахариды ..........................................35
Кислые сульфатированные полисахариды, метод Шубич .....................36
Белки ...........................................................................................................37

Кератин, метод Шубич ..............................................................................37
Кератин, метод Маллори ...........................................................................38
Суммарный белок, метод сулема-бромфеноловый синий .....................39
Липиды........................................................................................................40
Нейтральный жир, окраска Суданом III ..................................................41
Фосфолипиды, метод Бейкера ..................................................................42
Жирные кислоты, окраска нильским голубым .......................................44
Ферменты....................................................................................................44
Пепсиноген, метод Лилли .........................................................................45
Липаза, метод Гомори с твином-80 ..........................................................46
Щелочная фосфатаза, метод Гомори........................................................48
Кислая фосфатаза, метод Гомори .............................................................49
Аденозинтрифосфатаза, метод Вахштейна–Мейзеля ............................50
Карбоангидраза, метод Курата в модификации Хаузлера .....................51
Сукцинатдегидрогеназа, метод Нахласа ..................................................52
Глава 4. БИОХИМИЯ ОРГАНОВ ПИЩЕВАРЕНИЯ ..................................54
Количество гликогена, метод Дроздова и Шамахмудова .......................54
Трипсин, метод Нортропа .........................................................................57
Пепсин, метод Ансена в модификации Черникова.................................60
Амилаза, метод Уголева и Smith Roс .......................................................61
Липаза, метод Шлыгина ............................................................................63
Глава 5. НОВЕЙШИЕ ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ..........................64
Глава 6. СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
ОРГАНОВ ПИЩЕВАРЕНИЯ ........................................................................67
Глава 7. ПРИМЕРЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ В ОРИГИНАЛЬНЫХ
ИССЛЕДОВАНИЯХ ОРГАНОВ ПИЩЕВАРЕНИЯ ПОЛОРОГИХ
(BOVIDAE) .....................................................................................................69
ЛИТЕРАТУРА .................................................................................................89
ПРИЛОЖЕНИЕ ..............................................................................................92
4

ÂÂÅÄÅÍÈÅ
Проблема морфофункциональных приспособлений систем органов и тканей млекопитающих к условиям обитания, особенно при их
изменчивости (возникновение, пути эволюции, строение, функции,
адаптивные особенности), относится к числу фундаментальных в биологии и эволюционной морфологии. В рамках этой проблемы большой теоретический и практический интерес представляет изучение
полиморфизма и конвергентного сходства различных органов на всех
уровнях структурной организации при сравнении представителей
близких и филогенетически отдаленных таксонов, адаптированных
к определенным условиям обитания, в том числе растительноядных
млекопитающих, приспособившихся к усвоению растительной клетчатки.  Переваривание клетчатки обеспечивается благодаря сложному строению и функционированию желудочно-кишечного тракта и
наличию в нем симбионтов (микроорганизмов, бактерий и грибов).
Органы пищеварительной системы осуществляют тесный контакт
внутренней среды организма с внешней средой и благодаря мультифункциональности и компенсаторным функциям, поддерживают гомеостаз и регулируют адаптационные механизмы приспособления
животных при смене условий обитания.
При изучении органов пищеварения млекопитающих необходимо знать все разнообразие их морфологии и функционирования. Методы исследования этих органов, в зависимости от целей и задач,
весьма разнообразны. Такой задачей может быть выявление (1) экологических, видоспецифических, внутривидовых и межпородных
особенностей строения органов пищеварения, (2) механизмов их приспособления к определенным условиям существования и питания,
(3) изменениям морфофункциональных особенностей органов пищеварения в зависимости от типа пищеварения, физиологического состояния (беременность, лактация, период новорожденности, отбивка
молодняка от матерей,  переход от молочного вскармливания к кормам, свойственным взрослым животным). Кроме того, органы пищеварения могут быть исследованы в норме и при патологии, а также в
связи с применением лекарственных и других биологически активных веществ.
5

Методы исследования условно можно разделить на анатомические, гистологические, гистохимические, биохимические, физиологические и электронно-микроскопические. Анатомо-гистологические
методы предполагают применение морфометрии (измерение органов
и их структурных компонентов) с биометрической обработкой полученных показателей. Морфологическая характеристика часто бывает недостаточной для объяснения функциональных возможностей
органов. В связи с этим, становится необходимым привлечение исследователями гистохимических, электронно-микроскопических и
биохимических методов. Только комплексное применение разнообразных методов исследований позволит получить достоверные результаты, адекватно их интерпретировать и обосновать выводы.
Предлагаемые в настоящем руководстве разнообразные классические методы изучения органов пищеварения диких и домашних
копытных ранее использовались при совместных с группой ученых
многолетних научных работах, проводившихся в Лаборатории проблем доместикации животных. Затем – в дальнейших самостоятельных исследованиях автора в Лаборатории морфологических адаптаций позвоночных ИПЭЭ им. А.Н. Северцова РАН, выполненным со
значительным расширением методической базы.
Описанный комплекс морфологических, гистологических, гистохимических, биохимических и электронно-микроскопических методов, не претендуя на исчерпывающую полноту анализа, позволяет
выявлять морфофункциональные особенности пищеварительных органов жвачных животных, обусловленных видовой, породной, возрастной спецификой, а также кормовой базой и режимом кормления,
условиями содержания, направлениями селекционного отбора и доместикацией.
6

ÃËÀÂÀ 1
. ÌÎÐÔÎÌÅÒÐÈß ÎÐÃÀÍÎÂ ÏÈÙÅÂÀÐÅÍÈß
Исследование органов пищеварительной системы млекопитающих часто начинают с их весовой и линейной или объемной характеристики. Получение такого материала сопряжено с правильным выделением и препарированием органов, предназначенных для взвешивания или измерения, что требует знания их анатомического строения и топографии. Эти сведения, полученные с определенной тщательностью, дают возможность судить о росте и взаимоотношениях
органов и их частей в пищеварительной системе.
Правила получения весовых, линейных и объемных показателей и методы их обработки
Весовые, линейные и объемные показатели исследования желудочно-кишечного тракта (далее ЖКТ) весьма относительны, так как
их определение связано с удалением содержимого и растяжением
стенок желудка и кишечника при установлении объема и длины.
Объемные показатели роста органов пищеварения у жвачных животных в основном могут быть получены для отделов желудка.
Методика получения объемных показателей при исследовании
ЖКТ взрослых животных громоздка и трудоемка. Нужно удалить содержимое из отделов желудка, не повредив их целостности, наложить кисетные швы на границе отделов, необходим большой сосуд с
водой, в который можно было бы поместить наполненный водой желудок. Из-за трудностей выполнения этот метода дает наибольшую
ошибку в показателях, к тому же при его применении невозможно
проводить дальнейшие гистологические исследования отделов желудка. Объемные показатели с успехом могут быть заменены весовыми данными, которые оказываются наиболее объективными и не
препятствуют использованию отделов желудка для гистологических
и гистохимических исследований.
Целесообразно взвешивать желудок целиком с содержимым, а
затем отдельно его отделы (у жвачных – сычуг, рубец, сетку и книжку) с содержимым и без него. Массу тонкого и толстого отделов кишечника также следует определять с содержимым и без него. Учиты7

вать содержимое ЖКТ необходимо для вычисления чистой общей
массы животного (общая масса без массы содержимого желудка и
кишечника), так как количество содержимого ЖКТ жвачных представляет значительную и переменную величину, отражающуюся на
общей массе животного.
Измерять длину кишечника лучше с его содержимым, которое в
некоторой степени препятствует растяжению кишечника. Перед измерением, как и перед взвешиванием, кишечник надо тщательно отделить от брыжейки и разделить его на тонкий и толстый отделы в
месте входа подвздошной кишки в слепую. Измерять кишечник следует, укладывая его по длине стола или куска фанеры с известной
длиной.
Для определения массы печени все ее доли вместе с желчным
пузырем, если он имеется, выделяют из брюшной полости, перерезая печеночные вены и связки, соединяющие печень с диафрагмой, а
также все сосуды и протоки, расположенные в воротах печени, и взвешивают на соответствующих весах в зависимости от ее величины.
Определенного навыка требует выделение поджелудочной железы, не имеющей четко очерченных контуров и простирающейся вдоль
малой кривизны желудка и двенадцатиперстной кишки. Взвешивание поджелудочной железы осуществляют на весах, соответствующих ее размеру.
Изучение весовых показателей органов следует проводить на фоне
и в связи с измерением общей массы животного. Этому способствует
вычисление относительной массы органа в процентах или промиллях от общей массы животного (масса органа * 100 или (1000/общая
масса животного = % или ‰). Длину кишечника можно сопоставить
с длиной тела, для чего нужно разделить показатель длины кишечника на показатель длины тела и узнать, во сколько раз кишечник по
длине превосходит длину тела животного. Помимо относительной
массы, представляет интерес вычисление процентного соотношения
массы отделов желудка (у жвачных – сычуга, рубца, сетки и книжки),
массы долей печени и частей поджелудочной железы, а также массы
или длины отделов кишечника (тонкого и толстого) к массе или длине всего органа (масса или длина отдела * 100/масса или длина органа = %). Абсолютные показатели лучше оформлять в виде цифровых
таблиц, а относительные – в виде графиков. Отношение массы пищеварительных органов к общей массе животного, а также процентные
8

соотношения отделов желудка и кишечника изменяются у животных
с возрастом, видом, породой, типом и уровнем кормления, направлением продуктивности и характером содержания животных.
Анализ показателей массы и промеров пищеварительных органов должен быть проведен отдельно по каждому животному с учетом средних и крайних вариантов, а также с применением методов
вариационной статистики в том случае, если позволяет количество
исследованных животных (не менее 4–5 особей). При большом количестве животных биометрическая обработка точнее отражает действительность. Однако, применяя ее, необходимо иметь представление о
морфофункциональном состоянии изучаемого органа в определенные периоды индивидуального развития.
Обработку статистического материала целесообразно проводить с
помощью специальной компьютерной программы “STATISTICA-10-12”
(“Statsoft”, США). Программа представлена на сайте: info@statsoft.ru.
Программа вычисляет практически все используемые описательные статистики общего характера: медиану, моду, квартили, заданные пользователем процентили, среднее значение и стандартное отклонение, квартильный размах, доверительные интервалы для среднего, асимметрию и эксцесс (и их стандартные ошибки), гармоническое и геометрическое среднее, а также многие специальные описательные статистики. Как и во всех других модулях системы STATISTICA, для достижения высокой – не имеющей аналогов в сравнении с другими пакетами – точности результатов здесь можно производить вычисления с повышенной точностью (если нужно – с четырехкратной).
Кроме того, рекомендуем ознакомиться с руководством “Дискриминантный анализ в биологии” [16]. Книга написана биологами и
для биологов, поэтому в ней отсутствует строгое математическое
обоснование и доказательная база методов дискриминантного анализа и основные его положения представлены в виде уже научно сформулированных постулатов.
Задачи дискриминантного анализа – дискриминация (от лат.
discriminatio) означает различение, разделение. Именно в различении групп объектов и изучении характера этих различий заключается основная задача дискриминантного анализа.
 Не менее важно, что эти методы учитывают систему корреляции
признаков. Такая задача регулярно встаёт практически в каждой об9

ласти биологии. Например, в физиологии, биохимии – при сравнении различных серий опытов (или опыта и контроля) на фоне разброса результатов отдельных повторностей; в систематике – при разделении таксонов низкого ранга и определении таксономической принадлежности особи; в популяционной биологии – при сравнении различных популяций вида и т.д.
Дискриминантный анализ относится к категории методов многомерного статистического анализа, предполагающих описание объектов комплексом признаков. Высокая разрешающая способность таких методов обусловлена не только принципом “больше учтённых
признаков – больше информации”. Не менее важно, что эти методы
учитывают систему корреляции признаков.  
Для исследователей, не имеющих возможности использовать эту
программу, мы приводим классические методы статистического анализа.
Биометрическая обработка
Основные элементы вариационной статистики – средняя арифметическая (М) и среднеквадратическое отклонение () – вычисляются по следующим формулам:
M = /n; σ=± 
√( Σ×a
2)
n−1
,
где  – сумма показателей всего ряда; n – количество вариантов
(особей); a – отклонение от средней.
При обработке данных необходимо определить степень достоверности результатов сравнения. Для этого пользуются вычислением
ошибки ± m средней арифметической величины. Вероятность ошибки (m) средней величины (М) прямо пропорциональна величине квадратического отклонения и обратно пропорциональна числу членов
ряда m = ± /n; m показывает, насколько истинная средняя величина
не совпадает средней M. В таблицах следует указывать M ± m с найденной.
Большое распространение в биологических, медицинских и зоотехнических исследованиях получила обработка результатов при помощи таблиц, предложенных Стьюдентом (табл. 1, Приложение).
Правила пользования таблицей Стьюдента. На основании значений М, , m и n вычисляют степень достоверности различий или
10