Физико-химические подходы к количественному определению белка

Московский государственный университет
имени М.В. Ломоносова
Биологический факультет
Е.И. Акимова, В.В. Асеев
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
К КОЛИЧЕСТВЕННОМУ
ОПРЕДЕЛЕНИЮ БЕЛКА
Допущено Учебно-методическим объединением по классическому
университетскому образованию в качестве учебного пособия для
студентов  высших учебных заведений, обучающихся  по направлению
«Биология» (УГСН 06.00.00 «Биологические науки»)
и смежным направлениям
Товарищество научных изданий КМК
Москва – 2016

ÓÄÊ 577.088 : 577.112
ÁÁÊ 28.072
Å.È. Àêèìîâà, Â.Â. Àñååâ. Ôèçèêî-õèìè÷åñêèå ïîäõîäû ê êîëè÷åñòâåííîìó îïðåäåëåíèþ áåëêà: ó÷åá. ïîñîáèå. Ì.: Ò-âî íàó÷í. èçäàíèé ÊÌÊ.
2016. 109 ñ.
Ó÷åáíîå ïîñîáèå ïðåäíàçíà÷åíî äëÿ ñòóäåíòîâ, áàêàëàâðîâ, ìàãèñòðàíòîâ, àñïèðàíòîâ, à òàêæå äëÿ ñëóøàòåëåé êóðñîâ ïîâûøåíèÿ êâàëèôèêàöèè,
ïðåïîäàâàòåëåé âóçîâ è íàó÷íûõ ñîòðóäíèêîâ ñ öåëüþ îáó÷åíèÿ ñîâðåìåííûì ôèçèêî-õèìè÷åñêèì ìåòîäàì ïðàêòè÷åñêîãî îïðåäåëåíèÿ áåëêà. Ïîñîáèå ÿâëÿåòñÿ äîïîëíèòåëüíûì ìàòåðèàëîì ê ëåêöèîííîìó è ïðàêòè÷åñêîìó
êóðñàì ïî áèîõèìèè è ôèçèêî-õèìè÷åñêèì ìåòîäàì â áèîëîãèè, ÷èòàåìûõ
íà êàôåäðàõ áèîõèìèè è ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè.  íåì ïðåäñòàâëåíû òåîðåòè÷åñêèå îñíîâû ïî ðàçäåëó “Áåëêè” è ïðàêòè÷åñêèå ìåòîäèêè êîëè÷åñòâåííîãî îïðåäåëåíèÿ áåëêà. Ðàññìàòðèâàåìûå ìåòîäèêè ñîîòâåòñòâóþò
ñîâðåìåííîìó óðîâíþ ôèçèêî-õèìè÷åñêèõ èññëåäîâàíèé áåëêà.
Ðåöåíçåíòû:
Çàâåäóþùèé êàôåäðîé áèîôèçèêè ôèçè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà
ÌÃÓ èìåíè Ì. Â. Ëîìîíîñîâà, ïðîôåññîð
Â.À. Òâåðäèñëîâ
Ïðîôåññîð áèîëîãè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ èìåíè Ì. Â. Ëîìîíîñîâà
À.Ì. Ðóáöîâ
Ïå÷àòàåòñÿ ïî ðåøåíèþ Ó÷åíîãî ñîâåòà
áèîëîãè÷åñêîãî ôàêóëüòåòà ÌÃÓ èì. Ì.Â. Ëîìîíîñîâà
ISBN  978-5-9908165-0-3
© Êàôåäðû áèîõèìèè, ìîëåêóëÿðíîé áèîëîãèè
    Áèîëîãè÷åñêèé ôàêóëüòåò ÌÃÓ
, 2016.
© Àêèìîâà Å.È., Àñååâ Â.Â., 2016.
© Ò-âî íàó÷í. èçäàíèé ÊÌÊ, èçäàíèå, 2016.

Содержание
ОГЛАВЛЕНИЕ................................................................................................... 3
ПРЕДИСЛОВИЕ................................................................................................ 5
ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................ 7
1. ПРЯМЫЕ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА ............................................................................ 24
1.1. Спектрофотометрические методы в УФ-области спектра ................. 24
1.2. Спектрофотометрический метод в далекой УФ-области спектра ..... 32
1.3. Общие указания к расчетам по определению концентрации белка
спектрофотометрическими методами...................................................... 34
1.4.  Спектрофотометрический метод для хромофорных (окрашенных)
белков на примере гемоглобина ............................................................... 35
2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА ПО АМИННОМУ АЗОТУ ........... 42
2.1. Метод определения белка по Кьельдалю............................................. 42
2.2. Метод определения белка по Барнштейну .......................................... 55
2.3. Определение белка методом Дюма ...................................................... 56
3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА ПО ЦВЕТНЫМ РЕАКЦИЯМ ...... 58
3.1. Определение белка по биуретовой реакции ........................................ 58
3.2. Микробиуретовый метод определения белка...................................... 62
3.3. Метод Лоури ........................................................................................... 64
3.4. Определение белка с бицинхониновой кислотой ............................... 67
4. МЕТОДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОРГАНИЧЕСКИХ КРАСИТЕЛЕЙ
ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА .......................... 74
4.1. Определение белка с амидовым черным 10В...................................... 75
4.2. Определение белка с амидовым черным после осаждения
трихлоруксусной кислотой ....................................................................... 78
4.3. Метод определения белка по Брэдфорд с помощью кумасси G-250...... 78
4.4. Метод определения белка с помощью красителей группы понсо S .... 82
4.5. Метод определения белка с помощью красителя
сульфофиолетового .................................................................................... 83
4.6. Метод определения белка с помощью красителя бромфенолового
синего .......................................................................................................... 84
4.7. Метод определения белка с пирогаллоловым красным ..................... 86

5. ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА................... 89
Ключевые положения.................................................................................... 89
5.1. Флуорофоры, модифицирующие белок ............................................... 91
5.2. Флуорофоры, сорбирующиеся на белке............................................... 95
6. СРАВНЕНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА ...... 98
7. ВЫБОР МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА..........................................103
ЗАКЛЮЧЕНИЕ..............................................................................................105
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК...........................................................108

ПРЕДИСЛОВИЕ
Последние три-четыре десятилетия характеризуются стремительным развитием физико-химических исследований живой природы.
Благодаря совершенствованию физических, химических, физико-химических, электронно-микроскопических, рентгеноструктурных методов достигнуты огромные успехи в изучении основных органических соединений, встречающихся в живых организмах, и особенно в
области изучения и использования белковых молекул.
В настоящее время огромное внимание уделяется развитию биотехнологии, нанотехнологии, биоэлектроники (создание биоЭВМ и
биосенсоров) на основе белков. Перспективным направлением, которому принадлежит будущее, является белковая инженерия — технология изменения природных свойств белков и получения новых
белков с заведомо определенными свойствами — что особенно важно для медицины, сельского хозяйства, пищевой, фармацевтической,
химической промышленности. Огромное внимание уделяется созданию белковых «биочипов». Это позволит увеличить производительность диагностических методов и создать новые лекарства. Любое
из этих исследований на современном уровне невозможно без знания количественного содержания белка.
Поэтому для работы с новыми методами и методиками требуются
высококвалифицированные специалисты, умеющие грамотно поставить эксперимент, освоить новое оборудование и, самое главное, проанализировать полученные данные.
Количество методов, которые находят применение при определении содержания белка, а также их сложность возрастают с каждым
днем. Непрерывно появляются вариации основных методов исследования и предлагаются все новые и новые конкретные методики. К
настоящему времени хотя и разработано много различных методов
определения белка, отличающихся по теоретическим подходам, использованию химических реагентов, чувствительности и техническому оснащению, но сложность выполнения и дорогостоящее оборудование многих резко ограничивают их использование в повседневной практике.
В данном пособии представлены простые, доступные и достаточно эффективные методы определения, которые не требуют дорогостоящих реактивов и каких-либо специальных условий проведения и
могут выполняться в учебной лаборатории с использованием доступного оборудования. В настоящее время это наиболее используемые в

практике методы количественного определения белка. Данное пособие может рассматриваться как справочник по общепринятым в настоящее время методам количественного определения белка.
Описание методов построено по степени усложнения: от простых
спектрофотометрических до более сложных и точных химических с
использованием цветных реакций, органических красителей и флуорофоров.
Для удобства пользования пособием перед описанием каждой группы методов даются теоретические основы, а перед каждым методом
указан принцип его работы, приведена структурная формула основного химического реагента, дан перечень необходимых реактивов и
оборудования, способы приготовления рабочих растворов, что позволяет студенту понять ход выполнения поставленной задачи. Особое
внимание уделяется описанию преимуществ и ограничений данного
метода.
Восприятие материала значительно облегчается за счет приведенных рисунков, таблиц, фотографий. Приведенные структурные формулы красителей помогают лучше понять механизм их действия и
суть самого метода. В конце каждого раздела представлен список
контрольных вопросов для закрепления материала. Проведен сравнительный анализ представленных методов, в котором указаны их
достоинства и недостатки, даны рекомендации по использованию
конкретных методов. Последний раздел посвящен конкретному выбору метода определения белка с учетом состава белкового образца,
состава буфера, в котором он находится, и предложенных рекомендаций.
В пособии приводится краткая теоретическая часть, касающаяся
структуры белка, подходов ее изучения, классификации аминокислот и их структурных формул, свойств пептидной связи.
Такое построение оказывает помощь студентам в восприятии теоретического лекционного материала (по биохимии и физико-химическим методам в биологии) и может пригодиться им в дальнейшей
работе при выполнении курсовых и дипломных проектов, способствует развитию первых навыков физико-химических исследований
и работы в лаборатории.

ВВЕДЕНИЕ
Термин «протеин» (от греч. protos — первый, важнейший) впервые применен голландским ученым Г.Я. Мульдером в 1838 г. по предложению Берцелиуса. Это наименование было присвоено сложным
азотсодержащим органическим веществам, обнаруженным в клетках
животных и растений. В научной и учебной литературе на русском
языке чаще используют термин «белок». Белки занимают центральное место в структуре живой материи и играют важнейшую роль в ее
функционировании. Название «протеины» более точно отражает первостепенное биологическое значение этого класса веществ.
Белки присутствуют во всех клетках и представляют собой многочисленный и разнообразный класс органических соединений. В
природе встречается примерно 1010–1012 различных белков, обеспечивающих существование нескольких миллионов видов живых организмов различной сложности организации, начиная от вирусов и кончая человеком. На долю белков внутри клетки приходится более половины их сухого вещества. В организме человека насчитывается
более 50 000 индивидуальных белков.
Благодаря своему многообразию белки выполняют множество самых разнообразных функций: каталитическую, транспортную, защитную, структурную, регуляторную, питательную (резервную), энергетическую, механо-химическую (двигательную).
Видовая и индивидуальная специфичность набора белков в данном организме определяет особенности его строения и функционирования.
Первые белковые вещества были выделены почти три века назад,
однако вопрос структуры белковых молекул долгое время оставался
открытым. У истоков полипептидной теории строения белковой молекулы стоял А.Я. Данилевский (1838–1923), решающие шаги в этом
направлении были сделаны немецким химиком-органиком и биохимиком Э. Фишером (1852–1919), предложившим проекционные формулы аминокислот.
Любая молекула белка содержит в своем составе все четыре органогенных химических элемента (углерод, водород, кислород и азот)
и макроэлемент серу, кроме того компонентами некоторых белков
являются фосфор, йод, металлы: железо, цинк, магний, кобальт, медь.
Процентное соотношение химических элементов в молекуле белка в
пересчете на сухое вещество приведено в табл. 1.

Таблица 1.
Соотношение химических элементов в молекуле белка
Химический элемент 
Количество, % 
Углерод 
50–54 
Водород 
6,5–7,3 
Кислород 
21,5–23,5 
Азот 
15–17 
Сера 
0,3–2,5 
Белки относятся к высокомолекулярным природным неразветвленным гетерополимерам, мономерами которых являются α-аминокислоты, т. е. это полимеры, построенные из многократно повторяющихся единиц мономеров. Количество мономеров в молекуле полимера может варьировать от нескольких до десятков миллионов.
Все многообразие белков зависит от количественного и качественного состава различных α-аминокислот, их взаиморасположения в
белковой молекуле.
α-Аминокислоты являются производными карбоновых кислот.
Аминогруппа замещает один из атомов водорода при α-углероде карбоновой кислоты, поэтому общая формула аминокислот, встречающихся в белках, выглядит следующим образом:

Все α-аминокислоты характеризуются общей структурой — наличием как минимум одной (–NH2) группы и одной карбоксильной
группы (– СООН), связанных с одним и тем же атомом α-С, — и различаются структурой и физико-химическими свойствами радикалов
(R) — участков в молекуле, присоединенных к α-С по третьей связи.
В белках встречается 20–30 α-аминокислот. При биосинтезе в белок включается 20 α-аминокислот, кодируемых генетическим кодом,
а остальные образуются в результате посттрансляционной модификации белка. Относительно недавно была открыта 21 аминокислота,
закодированная в геноме, — селеноцистеин.
Для обозначений аминокислот используют тривиальные названия,
а также трехбуквенные сокращения их тривиальных названий или
однобуквенные символы. Это облегчает прочтение и сравнение аминокислотных последовательностей в белках и пептидах.
Тривиальные названия часто происходят от названия источника,
из которого они впервые были выделены, или от свойств данной аминокислоты. Глицин получил свое название из-за сладкого вкуса (от
греч. glycos — сладкий). Серин впервые был выделен из фиброина
шелка (от лат. serieum — шелковистый).
Свойства аминокислот зависят от наличия аминных и карбоксильных групп при α-углеродном атоме, а также от строения, размеров и
физико-химических свойств радикалов R.
В зависимости от свойств боковых радикалов R α-аминокислоты,
встречающиеся в белках, разделяются на 4 группы (по способности
взаимодействовать с водой при физиологических значениях рН —
вблизи рН=7,0). По степени полярности все R-группы можно расположить в виде непрерывного ряда, от полностью неполярных или гидрофобных, т. е. водоотталкивающих, R-групп и кончая сильно полярными, или гидрофильными («любящими» воду), R-группами.
I. Аминокислоты с неполярными или гидрофобными
радикалами
К этой группе относят семь аминокислот с алифатическими углеводородными R-радикалами (глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин и пролин), две аминокислоты с ароматическими кольцами (фенилаланин и триптофан).
 
Глицин                       Аланин                    Валин
 
(Gly, G)                        (Ala, A)                   (Val, V)

Лейцин                    Изолейцин                 Метионин
 
(Leu, L)                      (Ile, I)                        (Met, M)
 
 Пролин                     Фенилаланин              Триптофан
 
(Pro, P)                          (Phe, F)                      (Trp,W)
Радикалы таких аминокислот в водной среде, в которой находятся
белковые молекулы, стремятся друг к другу или к другим гидрофобным молекулам, образуя отдельную фазу. В результате этого поверхность соприкосновения их с водой уменьшается.
В отличие от остальных 19 аминокислот, пролин — иминокислота, радикал, которой связан как с α-углеродным атомом, так и с аминогруппой, в результате чего молекула приобретает циклическую
структуру.
Глицин отличается от других аминокислот наличием R-группы,
представляющей собой просто атом водорода. Поэтому глицин трудно отнести к какой-либо группе. Он может располагаться как в гидрофобном окружении, так и на поверхности белка. К тому же присутствие глицина делает полипептидную цепь более гибкой.
II. Аминокислоты с полярными незаряженными
радикалами
Аминокислоты, содержащие полярные незаряженные радикалы,
лучше растворяются в воде, более гидрофильны, чем неполярные
аминокислоты, так как их функциональные группы образуют водородные связи с молекулами воды. К ним относят серин, треонин и
тирозин, имеющие гидроксильные группы, аспарагин и глутамин,
содержащие амидные группы, и цистеин с его тиольной группой.
 
Серин                  Треонин                  Цистеин
 
(Ser, S)                  (Thr, T)                    (Cys, C)