Активность и биомасса почвенных микроорганизмов в изменяющихся условиях окружающей среды

Ðîññèéñêàÿ àêàäåìèÿ íàóê
Èíñòèòóò ôèçèêî-õèìè÷åñêèõ è áèîëîãè÷åñêèõ ïðîáëåì ïî÷âîâåäåíèÿ 
Ïî÷âåííûé èíñòèòóò èìåíè Â.Â. Äîêó÷àåâà
Ìîñêîâñêèé ãîñóäàðñòâåííûé óíèâåðñèòåò èìåíè Ì.Â. Ëîìîíîñîâà
Ðîññèéñêèé íàó÷íûé ôîíä
Å.Â. Áëàãîäàòñêàÿ, Ì.Â. Ñåìåíîâ, À.Â. ßêóøåâ
АКТИВНОСТЬ И БИОМАССА 
ПОЧВЕННЫХ 
МИКРООРГАНИЗМОВ
В ИЗМЕНЯЮЩИХСЯ УСЛОВИЯХ 
ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
Товарищество научных изданий КМК
                                              Москва ™2016 

УДК 579.26:631.46
ББК 28.4+40.3
        Б68
Благодатская Е.В., Семенов М.В., Якушев А.В. Активность и биомасса 
почвенных микроорганизмов в изменяющихся условиях окружающей 
среды. – М.: Товарищество научных изданий КМК. 2016. - 243 с.   
В монографии изложены 1) концепция активной микробной биомассы как ключевого 
звена, определяющего величины запасов и скорости потоков углерода в почве, и 2) концепция доминирующей экологической стратегии роста почвенного микробного сообщества. Определена роль разных пулов микробной биомассы в биотической трансформации органического вещества почвы. Обсуждается применимость традиционных и современных методов для определения биомассы активных микроорганизмов в почве. Отдельная глава посвящена археям — относительно новому объекту в исследовании микробных популяций почв, их систематике и экологическим преимуществам по отношению к бактериям в условиях экстремального воздействия факторов окружающей среды. 
Центральное место в книге отведено анализу стратегий роста почвенных микроорганизмов в зависимости от эколого-трофических условий. Выделены доминирующие стратегии роста микроорганизмов в зависимости от качества и количества субстрата, растительности и типа землепользования. Определено влияние на ростовую стратегию микроорганизмов таких стрессовых экологических факторов как повышенное содержание 
углекислого газа, загрязнение тяжелыми металлами, а также дефицит влаги и воздействие высоких температур. Последняя глава посвящена кинетическим параметрам роста микроорганизмов в палеопочвах, которые рассматриваются в качестве модельных 
объектов преимущественного развития олиготрофных микробных сообществ.
Книга рассчитана на широкий круг ученых и специалистов в области почвоведения, 
экологии и микробиологии, других смежных биологических и сельскохозяйственных дисциплин, будет полезна преподавателям вузов, аспирантам и студентам в качестве учебного пособия.
Ответственный редактор: член-корр. РАН В.Н. Кудеяров
Рецензенты:
А.Л. Степанов, доктор биологических наук, профессор
О.В. Меняйло, доктор биологических наук, профессор РАН
Монография рекомендована к печати учёным советом ИФХиБПП РАН
 
© Е.В. Благодатская, М.В. Семенов, А.В. Якушев, 
текст, иллюстрации, 2016
© ИФХиБПП РАН, 2016
© Почвенный институт имени В.В. Докучаева, 2016
© МГУ имени М.В. Ломоносова, 2016
© Товарищество научных изданий КМК, 2016
ISBN 978-5-9908165-6-5

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ....................................................................................................... 5
1. ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О БИОМАССЕ 
И АКТИВНОСТИ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ................... 8
1.1. Пулы микробной биомассы почв: общая, активная, 
покоящаяся, мертвая 
...................................................................................... 8
1.2. Методы определения микробной биомассы 
и активности почвенных микроорганизмов 
.............................................. 11
2. АРХЕИ — НОВЫЙ ОБЪЕКТ В ИССЛЕДОВАНИИ 
МЕТАБОЛИЧЕСКИ АКТИВНЫХ МИКРОБНЫХ 
ПОПУЛЯЦИЙ ПОЧВ 
.................................................................................... 35
2.1. Экологические преимущества архей по отношению 
к бактериям в условиях хронического энергетического стресса ............ 35
2.2. Систематика почвенных архей ............................................................ 39
2.3. Специфические функции архей и бактерий 
в глобальных циклах углерода и азота....................................................... 47
3. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ СТРАТЕГИИ РОСТА 
МИКРООРГАНИЗМОВ В ПОЧВЕ 
............................................................. 60
3.1. Конкуренция микроорганизмов с разными стратегиями роста ....... 60
3.2. Проблемы и способы определения стратегий роста 
почвенных микроорганизмов ..................................................................... 62
4. МЕХАНИЗМЫ ПРАЙМИНГ-ЭФФЕКТА 
И ЕГО ЗАВИСИМОСТЬ ОТ АКТИВНОЙ БИОМАССЫ 
И СТРАТЕГИИ РОСТА МИКРОБНОГО 
СООБЩЕСТВА ПОЧВЫ ............................................................................. 65
4.1. Современные представления о прайминг-эффекте в почве ............. 65
4.2. Зависимость прайминг-эффекта от количества добавленного 
субстрата и от величины микробной биомассы 
........................................ 67
4.3. Зависимость прайминг-эффекта от качества субстрата 
и физико-химических свойств почв 
........................................................... 72
4.4. Сукцессия механизмов и стратегии роста микроорганизмов 
в ходе прайминг-эффекта 
............................................................................ 76

Активность и биомасса почвенных микроорганизмов в изменяющихся условиях
5. ДОМИНИРУЮЩИЕ СТР
АТЕГИИ РОСТА МИКРООРГАНИЗМОВ 
В ЗАВИСИМОСТИ ОТ КА
ЧЕСТВА И КОЛИЧЕСТВА СУБСТР
АТА 
....... 80
5.1. Рост микроорганизмов на субстратах различной доступности ....... 80
5.2. Кинетические характеристики роста микроорганизмов в 
зависимости от количества доступного субстрата ................................... 83
6. ВЛИЯНИЕ РАСТЕНИЙ И РАЗНЫХ СИСТЕМ 
ЗЕМЛЕПОЛЬЗОВАНИЯ НА РОСТОВЫЕ 
ХАРАКТЕРИСТИКИ МИКРООРГАНИЗМОВ 
........................................ 94
6.1. Влияние растений на экологические стратегии 
микробных сообществ почв 
........................................................................ 94
6.2. Влияние длительного применения разных систем удобрений 
на кинетические параметры роста почвенных микроорганизмов ........ 105
6.3. Кинетика роста микроорганизмов 
при разном сельскохозяйственном использовании ................................ 115
7. АНАЛИЗ ИЗМЕНЕНИЯ РОСТОВЫХ СТРАТЕГИЙ 
ПОЧВЕННЫХ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ 
РАЗЛИЧНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ................................. 126
7.1. Характеристики роста микробного сообщества почвы и ризосферы 
в условиях повышенной концентрации СО2 в атмосфере ........................... 126
7.2. Влияние загрязнения тяжелыми металлами на ростовые 
характеристики микроорганизмов почвы и ризосферы 
......................... 137
7.3. Влияние свинца на дыхание и биомассу почвенных 
микроорганизмов ....................................................................................... 149
7.4. Ростовые характеристики микроорганизмов 
в почвах техногенно-загрязненных территорий ..................................... 159
7.5. Влияние высушивания и термической обработки 
на доминирующую экологическую стратегию 
микробного сообщества почвы ................................................................ 172
8. КИНЕТИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ РОСТА 
МИКРООРГАНИЗМОВ В ПАЛЕОПОЧВАХ ......................................... 194
8.1. Проблемы исследования микробиологической 
активности палеопочв ............................................................................... 194
8.2. Содержание микробной ДНК в палеопочвах 
................................... 196
8.3. Кинетические показатели роста микроорганизмов в палеопочвах ........197
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 
............................................................................................ 204
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 
........................................................................... 205

ВВЕДЕНИЕ
Начало текущего столетия ознаменовалось обострением глобальных изменений природной среды и климата, приводящих к нарушениям биогеохимических циклов углерода и азота, росту концентраций «парниковых» газов 
в атмосфере, утрате биоразнообразия и устойчивости экосистем, ухудшению качества и здоровья почвы (Звягинцев, 1991; Кудеяров и др., 2007; Семенов и др., 2011; Smith, 2011). Подобные экологические нарушения, в свою 
очередь, кардинально изменяют биохимические процессы и круговорот элементов как на уровне экосистемы в целом, так и на уровне почвенного профиля, воздействуя, в первую очередь, на почвенную биоту. Изменения происходят как на макро-уровне (корневая система растений, почвенные животные) (Tiunov, Scheu, 1999), так и на уровне сообщества почвенных микроорганизмов (Чернов и др., 2013), осуществляющих противоположно направленные процессы формирования и разложения почвенного органического 
вещества. Нарушение сбалансированности этих процессов может привести 
к изменению запасов почвенного гумуса и к увеличению эмиссии парниковых газов в атмосферу (Заварзин, Кудеяров, 2006; Семенов, Когут, 2015).
Сохранение запасов почвенного углерода, составляющих более двух третьих углерода наземных экосистем, зависит от динамического равновесия 
между микробиологическими процессами минерализации поступающих в 
почву органических соединений и процессами гумификации и секвестрирования органических соединений углерода (Кудеяров и др., 2007; Семенов, Когут, 2015). Скорость трансформации органических соединений в почве определяются скоростью роста и оборачиваемости микробной биомассы, а процессы накопления углерода зависят от эффективности усвоения минерализуемого субстрата. Большинство почвенно-микробиологических исследований, сфокусированных на характеристике генетического разнообразия микробных сообществ, не может быть использовано для оценки пулов и 
потоков почвенного углерода из-за отсутствия информации о ростовых характеристиках микроорганизмов in situ (Добровольская и др., 2001). Кинетические характеристики позволяют судить не только о максимальной скорости роста микроорганизмов, но и оценить время оборачиваемости и долю 
активной биомассы в микробном сообществе, а также время, необходимое 
для начала активного роста (Паников, 1992). Таким образом, знание характеристик роста для почвенных микробных сообществ позволяет правильно 
рассчитать скорость оборачиваемости органического вещества почвы. Несмотря на широкие возможности, обеспеченные современным уровнем ин

Активность и биомасса почвенных микроорганизмов в изменяющихся условиях
струментальных и молекулярных методов, системный подход к изучению 
роста микроорганизмов в почве в настоящее время отсутствует. Исследования ростовых процессов почвенных микроорганизмов носят разрозненный фрагментарный характер, что не позволяет количественно связать генетическое разнообразие микроорганизмов с их функциями. При этом результаты исследований, проведенных не на чистых культурах, а в почве, зачастую вступают в противоречие с теоретическими постулатами (Кожевин, 
1989), что подчеркивает важность экспериментального изучения микробных сообществ in situ (Полянская, 1996). В теоретической части настоящей 
монографии вводится понятие «стратегия роста почвенных микроорганизмов» и дается обоснование концепции доминирующей стратегии роста. При 
этом биомасса активных микроорганизмов рассматривается в качестве ключевого звена, определяющего запасы и потоки углерода в почвах (Prosser et 
al., 2007). Неравномерность распределения потоков углерода обусловлена 
гетерогенностью и мозаичностью строения почвенного профиля, в основной массе которого скорости роста микроорганизмов ограничены не потенциальными возможностями микробного сообщества, а отсутствием доступного субстрата. В условиях отсутствия субстрата значительные экологические преимущества получают представители архей, наиболее хорошо адаптированные к хроническому энергетическому стрессу.
В «горячих точках» (зонах повышенной микробной активности) — подстилке, детритосфере, ризосфере, характеризующихся флуктуационным характером поступления субстрата, рост микроорганизмов определяется конкуренцией микробных популяций с разными экологическими стратегиями. 
Основные стратегии микроорганизмов в почве условно могут быть охарактеризованы как r-виды — с низкой эффективностью использования субстрата, быстро растущие на легкодоступных соединениях, и К-стратеги — медленно, но эффективно минерализующие труднодоступный углерод (в том 
числе гуминовые вещества). В связи с этим, в монографии обсуждаются 
идеи, согласно которым преобладание видов с r- или К-стратегией в микробном сообществе определяет скорости ростовых процессов, а конкурентные 
отношения микроорганизмов с разными стратегиями роста лежат в основе механизмов секвестрирования и оборачиваемости почвенного углерода 
(Fontaine et al., 2003, 2007; Bernard et al., 2007; Salomé et al., 2010).
Значительное место в монографии отведено анализу стратегий роста почвенных микроорганизмов под действием изменений природной среды и 
климата. Климатические воздействия рассматриваются в монографии в качестве абиотических факторов, инициирующих микробную сукцессию. Изменение физико-химических условий, обусловленное климатическими экстремумами, приводит к мобилизации частично защищенного органического 
вещества и увеличению его доступности для микроорганизмов. Вызванное 
этим усиление активности микроорганизмов сопровождается продуцирова

Введение
нием внеклеточных ферментов, приводящим к минерализации стабильного органического вещества почвы (прайминг-эффекту). В связи с этим, особый раздел монографии посвящен затравочным (прайминг-) эффектам и их 
зависимости от стратегий роста микроорганизмов. Таким образом, скорость 
роста и функциональная активность микроорганизмов рассматриваются в 
предлагаемой монографии в качестве важнейших и необходимых характеристик, определяющих поведение почвенных экосистем в изменяющихся 
условиях окружающей среды.
Авторы считают своим приятным долгом выразить благодарность рецензентам и ответственному редактору, коллегам по работе и соавторам цитируемых публикаций, а также Российскому научному фонду за помощь, содействие и поддержку на разных стадиях подготовки и издания монографии.

Ãëàâà 1. ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ 
О БИОМАССЕ И АКТИВНОСТИ 
ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
1.1. Пулы микробной биомассы почв: общая, активная, покоящаяся, мертвая
Большинство биохимических процессов в почве осуществляется микроорганизмами, поэтому вопросы, связанные с исследованием микробной 
биомассы, являются центральными не только в почвоведении, но и во всех 
смежных с биогеохимией дисциплинах. Микробная биомасса рассматривается в таких исследованиях в качестве движущей силы биогеохимических 
циклов (Добровольская и др., 2015). В этой связи необходимо знать, какие 
микроорганизмы несут ответственность за конкретные процессы и, в более 
общем смысле, какая часть микробной биомассы осуществляет круговорот 
элементов.
Микробные популяции в почве представлены очень широким спектром 
микроорганизмов, находящихся в четырех физиологических состояниях. 
Первые три — жизнеспособные состояния. Во-первых, это активное состояние микроорганизмов. Активные микроорганизмы непосредственно участвуют в трансформации органических соединений и в связанных с ними 
биохимических превращениях. Во-вторых, это потенциально активные 
микроорганизмы. Эта фракция пребывает в состоянии ожидания и может 
переключиться на использование поступившего субстрата в сравнительно 
короткие сроки от нескольких минут до нескольких часов. Следующее состояние жизнеспособных микроорганизмов является состоянием покоя (покоящиеся формы). Микроорганизмы в таком состоянии не участвуют непосредственно в процессах трансформации органического вещества почвы, но могут внести свой вклад в условиях, способствующих их переходу в активное состояние. Наконец, четвертое состояние микроорганизмов в 
почве — мертвые, но количественно определяемые с помощью некоторых 
методов. Мертвая биомасса (или некромасса) не оказывает прямого воздействия на текущие биогеохимические процессы, однако может служить в качестве доступного субстрата, тем самым влияя на разложение органического вещества почвы. Все эти состояния общей микробной биомассы вносят 
вклад в функционирование почвенных экосостем, и этот вклад различается в зависимости от условий окружающей среды и практики землепользования. Тем не менее, кинетика процессов трансформации органического вещества определяется активной (а не общей) микробной биомассой, которая является основной движущей силой биогеохимического круговорота элементов в почве.

Глава 1.Общие представления о биомассе и активности почвенных микроорганизмов
Большинство методов оценки микробной биомассы (согласно обзорам 
Beck et al., 1997; Nannipieri et al., 2003; Hartmann et al., 2004; Bölter et al., 
2006; Joergensen, Emmerling, 2006; Joergensen, Wichern, 2008) были разработаны для измерения общей микробной биомассы. Однако, поскольку большинство процессов обусловлены активными микроорганизмами, для оценки участия микроорганизмов в функциях экосистем необходимо количественно разделять биомассу активных и покоящихся микроорганизмов (Ellis 
et al., 2003). Это создало предпосылки для разработки концепции активной 
микробной биомассы почвы. В настоящей главе после определения терминов, мы оценили применимость существующих методов для оценки активной части микробной биомассы и затем сравнили подходы по их пригодности для оценки трех разновидностей жизнеспособной микробной биомассы. 
Кроме того, мы предложили пороговые значения или диапазоны параметров 
в качестве критериев для дифференциации трех разновидностей жизнеспособной микробной биомассы при помощи различных подходов.
Целью данного анализа не являлось описание активности микроорганизмов как таковой, т.е. микробного дыхания, скорости разложения некоторых 
природных субстратов и ксенобиотиков, трансформации биогенных элементов, АТФ, или ферментативной активности. Тем не менее, мы обращаемся к 
некоторым из этих подходов, если они прямо или косвенно позволяют оценить и охарактеризовать часть активных микроорганизмов в почве.
Общая микробная биомасса включает в себя все живые почвенные организмы меньше 150–200 мкм (Swift et al., 1979; Coleman, Wall, 2007). Общее количество микробной биомассы является относительно небольшим 
(50–2000 мкг С г–1 почвы) и, как правило, не превышает 3% от содержания 
органического углерода (Anderson, Domsch, 1980). Мертвые микроорганизмы находятся в необратимом состоянии, в котором не наблюдается рост, удлинение клеток или синтез белка (Villarino et al., 2000). Мертвая биомасса, 
или микробная некромасса, выступает в качестве дополнительного пула доступного субстрата, но не может активно участвовать в биохимических процессах. Однако долю некромассы необходимо учитывать при определении 
активных микроорганизмов, основанном на извлечении/окрашивании клеточных компонентов, сохраняющихся как в живых, так и мертвых микробных клетках. Кроме того, необходимо учитывать пул внеклеточных ферментов, как «часть» неживой микробной биомассы, которая все еще «активна» и может осуществлять процессы гидролиза / окисления субстратов долгое время после гибели микроорганизмов.
Лишь незначительная часть общей микробной биомассы поддерживает 
активное состояние в почве без внесения легкодоступных субстратов, в то 
время как большая часть живых клеток неактивна (Jenkinson, Ladd, 1981; 
Prosser et al., 2007). Мы предлагаем определение активной микробной биомассы как части общей микробной биомассы, которая 1) непосредствен

Активность и биомасса почвенных микроорганизмов в изменяющихся условиях
но использует доступные в почве субстраты или 2) способна немедленно 
реагировать на внесение субстрата, например, вырабатывать ферменты 
и использовать субстрат без лаг-фазы, и 3) способна расти и воспроизводиться при наличии субстрата.
Переход в состояние покоя — распространенная стратегия в природе, используемая различными организмами для преодоления неблагоприятных условий окружающей среды (Dworkin, Shah, 2010; Jones, Lennon, 2010; 
Lennon, Jones, 2011). В этом состоянии почвенные микроорганизмы практически не оказывают влияния на глобальные биогеохимические процессы, например, такие, как выделение СО2 из почвы. Микроорганизмы используют 
разные способы формирования покоящихся структур, например, образование 
спор арбускулярно-микоризными грибами Scutellospora castanea или цист с 
утолщением клеточных стенок в филаментах цианобактерий Cylindrospermum 
sp., а также эндоспор бациллами Viridibacillus arvi (Roszak, Colwell, 1987; 
Jones, Lennon, 2010). При этом во всех случаях переход в покоящееся состояние характеризуется резким снижением физиологической активности клеток 
(Lennon, Jones, 2011). Не все почвенные микроорганизмы обладают способностью образовывать споры, например, это характерно для Грам-положительных 
бактерий, в то время как Грам-отрицательные в условиях голодания способны 
переходить в некультивируемое состояние, часто сопровождающееся уменьшением размеров клеток до наноформ (Panikov, 2005). Кроме того, многие 
бактерии могут поддерживать жизнеспособность, используя энергетические 
ресурсы с очень медленной скоростью в течение длительного времени за счет 
снижения метаболической активности (Raubuch et al., 2002). Споры грибов 
формируются в основном для репродукции, но также позволяют сохранить 
жизнеспособность при неблагоприятных условиях. Таким образом, различные формы состояния покоя микроорганизмов характеризуются сильно сниженной дыхательной активностью и замедлением эндогенного метаболизма 
течение длительного периода времени. В связи с этим микроорганизмы в состоянии покоя не оказывают существенного влияния на круговорот биогенных элементов. Скорость микробного отклика на внесение субстрата или на 
изменение условий окружающей среды позволяет распознавать покоящееся и 
активное состояние микроорганизмов (табл. 1).
Однако, отдельные покоящиеся клетки (в том числе некультивируемые) способны увеличивать метаболическую активность (например, дыхание) в течение нескольких минут в ответ на внесение субстрата, даже если деление клеток начинается несколькими часами или несколькими днями позже (Winding 
et al., 1994; Konopka et al., 2011). Микроорганизмы быстро переходящие из неактивного состояния в активное, являются потенциально активными — существующими между активным и неактивным физиологическим состояниями. В 
эту группу входят голодающие клетки, покоящиеся формы и споры, быстро (за 
3–24 ч) переходящие из покоя в активное состояние (Placella et al., 2012).