Регенерация скелетных мышц и реакция иммунной системы млекопитающих при лазерном и радиационном облучении

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова
Н.В. Булякова, С.М. Зубкова, В.С. Азарова
РЕГЕНЕРАЦИЯ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ
И РЕАКЦИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПРИ ЛАЗЕРНОМ
И РАДИАЦИОННОМ ОБЛУЧЕНИИ
Товарищество научных изданий КМК
Москва  2010

ÓÄÊ 577.391:591.862:615
Áóëÿêîâà Í.Â., Çóáêîâà Ñ.Ì., Àçàðîâà Â.Ñ. Регенерация скелетных мышц
и реакция иммунной системы млекопитающих при лазерном и радиационном облучении. М.: Т-во научных изданий КМК. 2010. 122 с.
В монографии представлены экспериментальные данные по действию
низкоинтенсивного излучения гелий-неонового (He-Ne) и импульсного инфракрасного (ИК) лазеров на посттравматическую регенерацию необлученных и облученных скелетных мышц крысы. Восстановительный процесс в
облученной мышечной ткани изучали в условиях локального воздействия на
мышцы рентгеновских лучей в дозе 20Гр и общего гамма-излучения в полулетальной дозе 6Гр. Выявлены особенности реакции центральных органов
иммунной системы животного (тимуса и костного мозга) на облучение, травму и лазеротерапию. Изложены данные по эффективности лазерного излучения в зависимости от дозы и периода, в течение которого регенерирующие
мышцы подвергались лазерному воздействию. Проведена сравнительная
оценка эффекта излучения He-Ne и ИК лазеров при локальном воздействии
ионизирующей радиации на мышцы, а также эффекта ИК-лазерного излучения при воздействии на необлученные и локально облученные мышцы. Отмечен положительный эффект лазерного излучения на заживление кожномышечной раны и жизнеспособность крыс в условиях действия ионизирующей радиации.
Для морфологов, радиобиологов, патофизиологов и хирургов.
Ил. 67. Табл.15. Библиогр.: 242 назв.
Ответственный редактор д.б.н. О.Ф. Чернова
Рецензенты:
д.б.н. Т.П. Евгеньева
д.м.н. Т.В. Кончугова
ISBN 978-5-87317-648-9
© Булякова Н.В., Зубкова С.М., Азарова В.С., 2010.
© ИПЭЭ им. А.Н. Северцова РАН, 2010.
©Товарищество научных изданий КМК, издание 2010.

Оглавление
Введение ............................................................................................................... 4
Глава 1. Регенерация скелетных мышц крысы и реакция центральных
органов иммунной системы ............................................................................. 15
Глава 2. Воздействие лазерного излучения на травмированные скелетные
мышцы крысы и реакция центральных органов иммунной
системы .............................................................................................................. 26
Эффект излучения He-Ne лазера в одной и той же дозе на ранних и
поздних сроках регенерации мышц........................................................ 26
Эффект излучения He-Ne лазера в условиях трехкратного снижения
дозы на ранних сроках регенерации мышц ........................................... 35
Эффект излучения импульсного ИК лазера в течение месяца после
травмы мышц ............................................................................................ 40
Глава 3. Воздействие лазерного излучения на локально облученные
в дозе 20 гр травмированные скелетные мышцы крысы и реакция
центральных органов иммунной системы ..................................................... 47
Регенерация облученных мышц без лазерного воздействия ............... 47
Зависимость эффекта излучения He-Ne лазера от периода
воздействия на облученные регенерирующие мышцы ....................... 53
Зависимость эффекта излучения импульсного ИК лазера от периода
воздействия на облученные регенерирующие мышцы ....................... 59
Глава 4. Воздействие лазерного излучения на травмированные скелетные
мышцы крысы, облученной в дозе 6 гр, и реакция центральных
органов иммунной системы ............................................................................. 70
Регенерация мышц у облученных крыс без лазерного воздействия ... 72
Зависимость эффекта излучения He-Ne лазера от периода
воздействия на регенерирующие мышцы у облученных крыс ............ 80
Обсуждение полученных результатов ............................................................ 95
Заключение ......................................................................................................109
Литература ....................................................................................................... 111

ВВЕДЕНИЕ
Изучение процессов вторичного гистогенеза скелетных мышц млекопитающих является одним из перспективных направлений в области миологии. Нарушения восстановительного роста в поврежденной мышечной ткани могут иметь отрицательные последствия для жизнедеятельности организма. Как известно, скелетные мышцы составляют более 40% от массы тела
млекопитающих, обеспечивают двигательную функцию, поддерживают равновесие тела, осуществляют тонкую координацию движений. В мышечной
ткани происходят активные метаболические процессы, обеспечивающие сократительную функцию мышц. Не менее 70% вырабатываемой энергии освобождается в виде тепла, необходимого для поддержания нормальной температуры тела.
Скелетная мышечная ткань способна к регенерации. В ответ на травму в
мышечной ткани происходит структурная перестройка, носящая адаптивный характер и направленная на максимальное восстановление массы и функциональной активности мышцы как сократительного органа. Однако успех
восстановления мышцы зависит от многих факторов, в частности от степени повреждения мышцы, течения реакции воспаления в ране, интенсивности обменных процессов, реваскуляризации и реиннервации восстанавливающейся мышцы, включая возрастной фактор (Студитский, Стриганова, 1951;
Студитский, 1959, 1977; Румянцева, 1960; Студитский, Игнатьева, 1961; Клишов, 1971; Carlson, 1973; Женевская, 1974; Muscle transplantation, 1981; Caplan
et al., 1988; Best, Hunter, 2000; Данилов, 2008).
После повреждения мышцы активизируются «дремлющие» клетки-сателлиты, которые располагаются под базальной мембраной мышечного волокна и являются источником регенерации мышечной ткани. Они вступают в
процесс пролиферации и превращаются в миобласты, которые репопулируют область травмы, сливаясь как с поврежденными мышечными волокнами,
так и друг с другом, формируя новые мышечные волокна (Mauro, 1961;
Bischoff, 1986а, 1994; Schultz, 1989). В регенерирующих мышечных волокнах образуется сократительный аппарат (миофибриллы). Постепенно происходит окончательное становление васкуляризации, иннервации и функции
регенерирующих скелетных мышц (Женевская, 1974; Студитский, 1977).
Клетки-сателлиты являются камбиальным резервом для восстановительных
процессов в мышечной ткани. Однако до сих пор остаются спорными и мало
изученными вопросы, касающиеся возникновения клеток-сателлитов, причин их гетерогенности и гетероморфии (Данилов и др., 2002). Не исключается полностью возможность образования в ходе регенерации мышечной ткани клеток-сателлитов и миобластов в результате отделения постмитотических мышечных ядер, находящихся в зрелом мышечном волокне (Елякова,
1972; Данилов, 1983; Odelberg et al., 2000; Grounds et al., 2002). Описаны
4

процессы вычленения участков саркоплазмы с ядрами из состава некротизированных и жизнеспособных симпластов. В некоторых случаях отделяемая
территория содержала миофибриллы или протофиламенты (Данилов, 2008).
Регенерация травмированной мышечной ткани может происходить также
путем формирования почек роста в виде саркоплазматических наплывов с
крупными мышечными ядрами на концах жизнеспособных мышечных волокон (Булякова, Елякова, 1981). Авторы показали, что мышечная почка –
это живая развивающаяся структура. На ультратонких срезах видно, что саркоплазма мышечной почки заполнена множеством рибосом и полисом, содержит большое количество митохондрий, пузырьков, профилей гранулярной эндоплазматической сети, развивающиеся протофибриллы и фрагменты формирующихся миофибрилл. К ним могут присоединяться миобласты.
Мышечные почки растут в направлении зоны повреждения, дифференцируются в мышечные трубочки и мышечные волокна и заполняют область травмы. Процессы внутриклеточной регенерации, происходящие в сохранившихся
участках мышечных волокон, отмечены и другими исследователями (Данилов, 2008).
В регенерирующей мышечной ткани появляются многочисленные ростстимулирующие факторы (Myf5, MyoD, MRF4, миогенин и HGF), регулирующие миогенез (Bisсhoff, 1986b, 1997; Озернюк, 1998; Seale, Rudnicki, 2000;
Charge, Rudnicki, 2004; Озернюк, Балан, 2007). Активация генов MyoD и Myf5
дает начало миогенной линии клеток. В свою очередь клетки-предшественники дают начало миобластам. Активация гена миогенина коммитирует миобласты к последующей дифференцировке и пролиферации.
 Значительно нарушается регенерационная способность скелетной мышечной ткани на фоне действия ионизирующей радиации (Михайлов, 1965;
Стрелин, 1966; Тужилкова, 1969; Reznik, 1971; Попова, 1976, 1984). Скелетную мышечную ткань относят к числу тканей с относительно высокой радиоустойчивостью по сравнению с другими тканями. Такое представление
основано на том, что структурные изменения в мышце млекопитающих, выявляемые на светооптическом уровне, наступают при довольно высоких дозах облучения, порядка нескольких десятков грей. А изменения энергетического, углеводного и белкового метаболизма в мышцах даже в условиях,
имитирующих реальную радиационную обстановку (сочетание внутреннего и внешнего облучения животных при введении радионуклидов и воздействии гамма-излучения), неглубокие, и сопряженность обменных процессов
в мышечной ткани не нарушается на протяжении значительного периода (Ватулина, 1982).
Повреждение, вызванное облучением, может сохраняться в течение довольно длительного времени и проявляться в нарушении процессов регенерации, связанных с делением, ростом и дифференцировкой мышечных элементов (Тужилкова, 1969; Попова, 1976, 1984; Булякова, 1973; Ильясова, 1980;
5

Булякова и др., 1995). Снижается интенсивность биосинтетических и биоэнергетических процессов. Происходят торможение пролиферативной активности клеток и возникновение хромосомных повреждений. Нарушается кровоснабжение травмированных облученных мышц (Умнова, 1973; Christian,
Stearner, 1973; Попова, 1976, 1984). Отмечаются повреждения концевых отделов периферических нервов и нарушение восстановления нервно-мышечных контактов (Тужилкова, 1969; Попова, 1976, 1984). В области травмы появляются глубокие долго незаживающие лучевые кожно-мышечные язвы.
Одним из значимых патогенетических звеньев является нарушение гомеостаза в процессах перекисного окисления липидов мембранных структур
клетки (ПОЛ) и антиоксидантной защиты (Владимиров, Арчаков, 1972; Бурлакова и др., 1975; Fridovich, 1978, 1998; Владимиров, 2000, 2002; Gilbert,
2000; Журавлев, Зубкова, 2008). Перекисное окисление липидов, входящих
в состав мембранных структур клетки, происходит и в норме. Источником
свободных радикалов является кислород, находящийся в тканях и представляющий основной субстрат окислительного метаболизма. Защитные механизмы (на уровне клетки) от активных форм кислорода одни и те же и при
дыхании, и при воздействии любых повреждающих факторов (Lane, 2002).
Однако повреждающее действие кислородных радикалов в значительной
степени снижается существующей в клетке эндогенной системой антиоксидантных ферментов (каталаза, супероксиддисмутаза, глютатионпероксидаза, церуллоплазмин). Переход от нормы к патологии начинается с нарушения равновесия в окислительно-восстановительных процессах. Уровень активности антиоксидантных систем определяет степень развития адаптивных
реакций в процессе формирования патологического состояния.
При различных патологических изменениях, включая травму и ионизирующую радиацию, в тканях усиливаются процессы свободнорадикального
окисления, развивается окислительный стресс (Журавлев, Зубкова, 2008).
Например, высокий уровень ПОЛ наблюдается при активной воспалительной реакции, развивающейся в травмированных тканях (Алесенко, Пальмина, 1982; Таран и др., 1988; Chapple, 1997; Кармен, 2001; Пасечник, 2004).
В условиях воздействия ионизирующей радиации биомембраны являются критической мишенью в клетке наряду с ее генетическим аппаратом. В
результате радиационного поражения в клетке также индуцируется ПОЛ, что
приводит к нарушению структуры и функции биомембран и появлению токсичных продуктов, которые могут поражать либо репарационные системы,
либо прямо воздействовать на генетический аппарат клетки (Бурлакова и др.,
1975; Рыскулова, 1986; Поливода и др., 1990). Показано, что после воздействия гамма-излучения в дозе 8 Гр в митохондриях и плазме крови крыс повышается уровень ПОЛ и снижается активность ферментов антиокислительной системы, в частности селенозависимой глутатионпероксидазы (Никитченко и др., 2008).
6

Известно, что одним из регулирующих механизмов восстановительных
процессов в органах и тканях является контроль со стороны иммунной системы. В ответ на операционный стресс в тимусе развиваются инволютивные
изменения, степень которых зависит от силы стрессорного воздействия, интенсивности повреждения органов и тканей (Селье, 1960; Бабаева, 1985).
Тимус реагирует резким уменьшением своей массы. Происходит выброс Тлимфоцитов в кровь, массовая гибель лимфоидных клеток, нарушение четкости границ между корковым и мозговым слоями, разрастание эпителиальнотканной стромы тимуса. Эпителиальные клетки тимуса синтезируют тимические пептиды (тимозин, тимопоэтин и тимулин), участвующие в миграции, пролиферации, дифференцировке, апоптотической гибели тимоцитов и необходимые для регуляции функции периферических лимфоидных
органов (Ярилин, 2003). Изменения в периферических лимфоидных органах
зависят от функционального состояния тимуса. В ходе восстановительного
процесса в органах и тканях лимфоидные клетки осуществляют не только
иммунологический, но и морфогенетический контроль (Бабаева, 1985, 1999).
В ответ на травму повышается выработка антител, циркулирующих в крови,
а лимфоциты приобретают способность усиливать пролиферативную активность клеток регенерирующих нелимфоидных тканей, выделяя факторы, стимулирующие их рост.
Показано, что в активации мышечных клеток-сателлитов существенную
роль играют цитокины лейкоцитов, появляющихся в процессе развития воспалительной реакции. В травмированных скелетных мышцах полиморфноядерные лейкоциты и макрофаги (активированные моноциты) мигрируют к
месту повреждения. Макрофаги, кроме выполнения функции фагоцитоза, обладают способностью выделять факторы роста, стимулирующие активность
миобластов (Rappolee, Werb, 1992; Merly et al., 1999). Миогенез значительно
снижается в отсутствие макрофагальной инфильтрации (Lescaudron et al., 1999).
В настоящее время появились также данные о том, что миоидные клетки
тимуса могут участвовать в посттравматической регенерации скелетных
мышц (Wong et al., 1999; Pagel et al., 2000).
Широко дискутируется вопрос о пластичности стволовых клеток костного мозга и их участии в регенерации различных тканей. Показано, что плюрипотентные стволовые клетки костного мозга могут при определенных условиях дифференцироваться в мышечные клетки и участвовать в регенерации скелетной мышечной ткани (Ferrari et al., 1998, 1999; Goodell et al., 2001;
Grounds et al., 2002; Kuehnle, Goodell, 2002). Было установлено также, что от
клеток-предшественников, интенсивно размножающихся в костном мозге,
ведет свое начало подавляющее большинство макрофагов и фибробластов в
очаге воспаления и восстановления поврежденных тканей (Хрущов и др.,
1984). Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, принимая участие в заживлении кожно-мышечной раны, дифференцируются в клетки кожи,
7

выделяют ангиогенные факторы и участвуют в формировании сети кровеносных сосудов (Borue et al., 2004; McFarlin et al., 2006; Wu et al., 2007).
Изучение процессов вторичного гистоморфогенеза в необлученных и облученных ионизирующей радиацией скелетных мышцах и поиск эффективных методов стимуляции регенерационной способности травмированной
мышечной ткани, а также условий, в которых возможно максимальное восстановление структуры и функции скелетных мышц, до сих пор остается
одной из актуальных проблем в биологии и медицине. При возникновении
чрезвычайных ситуаций, в том числе и при авариях на АЭС, нередко отмечаются случаи, сопровождающиеся травмой скелетной мышечной ткани.
В настоящее время накоплен большой экспериментальный и клинический
материал, демонстрирующий способность низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) снижать уровень патологических изменений в органах и тканях. У истоков создания лазерной медицины стояли российские ученые и медики. Наиболее изучен эффект гелий-неонового (He-Ne) и импульсного инфракрасного (ИК) лазеров. He-Ne лазер излучает свет в красной области спектра с длиной волны 0.63 мкм. Глубина проникновения его лучей в биологические ткани составляет по разным источникам литературы от 3–5 мм до 1 см.
Через кожу проходит около 33% от падающей на поверхность тела энергии
(Лапрун и др., 1977). Импульсный инфракрасный лазер (ИК) излучает свет в
ближней инфракрасной области спектра с длиной волны 0.8–1.3 мкм. Глубина
проникновения лучей ИК лазера с длиной волны 0.89 мкм составляет 6–7 см.
Свет ИК лазера меньше поглощается меланином, гемоглобином, чем свет других спектральных областей, что повышает его эффективность. Поглощаясь
биологическими тканями, энергия этого излучения почти целиком превращается в колебательную энергию молекул, которой достаточно для активации
ферментов, играющих роль триггеров при запуске физиологических реакций
на тканевом уровне (Campbell, Dwek, 1984; Козлов, Буйлин, 1998; Зубкова 2009).
Что касается механизмов биологического действия НИЛИ, то одним из
дискутируемых вопросов является вопрос о том, почему молекулы (первичные фотоакцепторы) малочисленны, а конечные результаты лазерного воздействия отличаются значительным многообразием. По мнению одних авторов, на коже человека и животных нет специфических рецепторов, чувствительных к воздействию света. Отсутствуют какие-либо значимые субъективные ощущения в момент облучения. Следовательно, отмечаемые в эксперименте изменения функциональной активности нервных волокон, биоэлектрической активности рецепторов кожи и мышц в ответ на действие НИЛИ
являются вторичным эффектом, обусловленным предыдущими изменениями метаболизма (Крюк и др., 1986).
Другие авторы придерживаются противоположного мнения. Раздражение
чувствительных нервных окончаний на поверхности кожи вызывает возбуждение нервных центров и способствует в дальнейшем стимуляции физиоло8

гических функций. Увеличивается афферентная импульсация периферических нервов под влиянием лазерного воздействия (Улащик и др., 2007). Высказывается предположение, что молекулярной «антенной» инфракрасного
лазерного излучения служит Na, K-АТФаза, передающая сигнал к воротной
структуре медленного Na-канала, что, возможно, является начальным звеном в механизмах передачи клеточной сигнализации в ЦНС (Плахова и др.,
2003). Известно, что Na, К-АТФаза, кроме выполнения своей основной функции транспорта ионов Na+ и К+ против их концентрационных градиентов,
способна также участвовать в механизмах клеточной сигнализации (Xie,
2001). Показана зависимость активности чувствительных нейронов от интенсивности излучения He-Ne лазера (Balaban et al., 1992).
 Некоторые исследователи полагают, что в биологических эффектах НИЛИ
в качестве первичного действующего фактора выступают локальные термодинамические нарушения, вызывающие высвобождение ионов кальция из
внутреннего депо, распространение волны повышенной концентрации Са+2
в цитозоле клетки (Москвин, 2003; Москвин, Купеев, 2007). В тканях развиваются вторичные эффекты, представляющие собой комплекс кальций зависимых адаптационных и компенсаторных реакций (Whitney, Sutherland, 1973;
Watman et al., 1988; Schaffer et al., 1997; Abdel-Naser, 1999; Кару, 2001; Inoue
et al., 2001; Filippin et al., 2003).
 Согласно представлениям, развиваемым д.б.н. С.М. Зубковой, лазерное излучение играет роль структурного антиоксиданта, предотвращая повреждения
клеточных структур активными формами кислорода (Зубкова, 1991, 1995; Журавлев, Зубкова, 2008). Это может происходить за счет изменения конформации
мембранных белков в клетке. Низкоинтенсивное лазерное излучение воздействует также на активность антиоксидантных ферментов за счет резонансного
поглощения квантов лазерного излучения (при наличии в молекулах этих ферментов хромофорных групп), а также вызывая колебательное возбуждение отдельных групп макромолекул и гидратирующих их молекул воды. Последние
находятся в гликокаликсе и в жидкокристаллической структуре цитоплазмы. В
результате этих конформационных перестроек меняются уровни свободнорадикального и ферментативного окисления, связанного с фосфорилированием, а
уже на этой измененной основе формируются последовательно неспецифические реакции клетки: изменения ионной проницаемости, сократимости, рецепции гормонов и нейромедиаторов, активности аденилатциклазной и АТФазной
систем.
 Вопрос о том, почему очень низкие дозы лазерного воздействия вызывают существенные изменения в организме, некоторые исследователи объясняют тем, что для информационных процессов, происходящих при поглощении квантов света внутриклеточными компонентами, требуется минимальное количество подведенной энергии для запуска физиологических реакций,
развивающихся впоследствии самостоятельно (Леках, 2002).
9

Значительную роль в лазеротерапии играет доза лазерного излучения.
Стимуляция клеток и тканей с помощью лазерных лучей подчиняется физиологическому закону зависимости ответной реакции от силы действующего
фактора (Насонов, 1992). По мере нарастания интенсивности воздействия
ответная реакция клеток и тканей усиливается и постепенно достигает своего максимума. После этого дальнейшее увеличение стимулирующего действия приводит к снижению, угнетению реакции, т.е. больший по величине
стимул дает менее выраженную ответную реакцию организма.
Выбор оптимальной терапевтической дозы лазерного воздействия является
в значительной степени эмпирическим. Отсутствие сравнительных исследований, проведенных на одном и том же объекте при одинаковых условиях воздействия повреждающих факторов, а также сравнимых методов анализа полученных результатов не позволяют однозначно ответить на вопрос, каковы оптимальные доза и режим лазеротерапии того или иного органа, ткани. В научной литературе имеются данные о том, при каких дозах лазерного воздействия наблюдается отрицательный эффект. Были описаны дисфункциональные и деструктивные изменения в эпителиоцитах слизистой оболочки желудка в результате превышения оптимальных доз изучения He-Ne лазера более 20 Дж/см2 (Байбеков и
др., 1991). Лазерное излучение в такой дозе или не повышает пролиферативную
активность эпителиоцитов, или вызывает снижение уровня их пролиферации
вплоть до выраженной альтерации. Излучение He-Ne лазера в дозах, превышающих 10 Дж/см2, вызывает нарушение микроциркуляции в тканях, деструктивные изменения в стенках кровеносных сосудов, дилатацию артериол и венул
(Козлов, 1991). При воздействии He-Ne лазера в такой же дозе на кровь in vitro
наблюдались усиление гемолиза и активация ПОЛ (Жуманкулов и др., 1989).
Отрицательный эффект показан также при однократном воздействии лазерного
излучения в дозе 11.2 Дж/см2 на слюнные железы морских свинок (Plavnik et al.,
2004) и при воздействии He-Ne лазера в дозе 31.2 Дж/см2 на поврежденные скелетные мышцы амфибий (Bibikova, Oron, 1994).
Эффективность воздействия физических факторов в значительной степени определяется резонансными явлениями физиологических процессов (Улащик, 2006). Предлагают модулировать частоту следования импульсов лазерного излучения сигналами с датчиков пульса и дыхания пациента, а также
частотами, являющимися резонансными для подкорковых структур головного мозга (Загускин, 1992, 1996; Комаров и др., 1994). Ранее в экспериментах на лабораторных животных нами было проведено сравнительное исследование воздействия излучения He-Ne лазера в непрерывном и модулированном режиме. Показано, что экспозиции в модулированном режиме (60
раз по 3 секунды действия лазера + 7 секунд перерыв) более эффективны по
сравнению с непрерывным режимом воздействия в течение 3-х минут (Булякова, 1984). Возможно наблюдаемый эффект был обусловлен определенными биологическими ритмами в организме животного.
10