Спектральный комплекс типа КСВУ-23 в биомедицинских исследованиях

Московский государственный технический университет 
имени Н. Э. Баумана 
 
 
 
Г.Н. Змиевской, А.В. Кобелев 
 
 
СПЕКТРАЛЬНЫЙ КОМПЛЕКС  
ТИПА КСВУ-23 
 В БИОМЕДИЦИНСКИХ 
ИССЛЕДОВАНИЯХ 
 
 
 
Методические указания 
к выполнению лабораторной работы 
по курсу «Биомедицинская оптика» 
  
 
Под редакцией И.Н. Спиридонова 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Москва  
Издательство МГТУ им. Н.Э. Баумана  
2011 

З-69 
 

УДК 543.42 
ББК 22.344 
        З-69 
Рецензент С.Б. Одиноков 

Змиевской Г. Н. 
Спектральный комплекс типа КСВУ-23 в биомедицинских 
исследованиях : метод. указания к выполнению лабораторной 
работы по курсу «Биомедицинская оптика» / Г.Н. Змиевской, 
А.В. Кобелев; под ред. И.Н. Спиридонова. — М. : Изд-во 
МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2011. — 20, [4] с: ил. 
 
В теоретической части рассмотрены основные понятия спектрального анализа в оптическом диапазоне, а также основные элементы 
конструкции спектральных приборов на основе дифракционных 
монохроматоров и особенности устройства спектрального комплекса 
типа КСВУ в базовом варианте (производства ЛОМО) и в модернизированном виде после проведенных в МГТУ им. Н.Э. Баумана усовершенствований. Показано, что в модернизированном варианте 
комплекса существенно расширены его измерительные возможности 
как с точки зрения использования информационных технологий, так и 
с точки зрения его медицинских применений. Практическая часть 
посвящена исследованию абсорбционных и эмиссионных спектров 
различных объектов, имеющих в основном биомедицинскую природу 
(образцы биотканей, лекарственные препараты, источники зондирующего излучения для диагностических и терапевтических целей). 
Приведены контрольные вопросы для закрепления знаний и навыков, 
полученных в процессе выполнения лабораторной работы. Дан список 
литературы, рекомендуемой для более углубленного изучения 
затронутых вопросов. 
Для студентов старших курсов МГТУ им. Н.Э. Баумана, обучающихся по биомедицинским специальностям. 
Рекомендовано Учебно-методической комиссией НУК РЛМ 
МГТУ им. Н.Э. Баумана. 
 
                                                                                                            УДК 534.42 
                                                                                                            ББК 22. 344 
 
 
 

          © МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2011 

Цель работы — ознакомление с методами спектрального анализа в биомедицинских исследованиях на примере изучения возможностей модернизированного спектрального комплекса КСВУ-23. 

1. ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ  
СПЕКТРАЛЬНОГО АНАЛИЗА  
В ОПТИЧЕСКОМ ДИАПАЗОНЕ 

Оптическим диапазоном электромагнитных волн принято считать область длин волн 10 нм…1000 мкм. Оптический диапазон 
подразделяется по длинам волн на ультрафиолетовое излучение 
(10…400 нм), видимое (400…760 нм) и инфракрасное (0,76… 
…1000 мкм). Иногда нижнюю границу видимого диапазона опускают до значения 380 нм, чтобы на видимый свет приходилась ровно одна октава (изменение длины волны в 2 раза), но многочисленный опыт наблюдений коротковолнового участка видимого спектра 
свидетельствует о том, что для восприятия большинства людей излучение с длиной волны короче 400 нм недоступно. 
Любой периодический процесс, как известно, можно представить в виде суммы гармонических колебаний. Спектром принято 
называть распределение интенсивности излучения по длинам волн 
или частотам. 
Для представления спектров используют различные величины, 
характеризующие волновой процесс. Наиболее общей является частота колебаний, однако в силу ряда причин в практической спектроскопии непосредственное измерение частоты крайне затруднительно (прежде всего потому, что для регистрации оптической 
частоты быстродействия традиционных фотоприемных устройств 
недостаточно). Поэтому обычно используется шкала длин волн. 
Для спектральных измерений часто используется величина, обратная длине волны и называемая волновым числом. Если выражать 

длину волны в микрометрах, то для определения волнового числа 
удобно использовать формулу 

 
4
10
,
k 
  
(1) 

в результате получается волновое число в обратных сантиметрах. 
В зависимости от физической природы изучаемого явления 
различают: эмиссионные спектры (спектры испускания); абсорбционные спектры (спектры поглощения); трансмиссионные спектры 
(спектры пропускания); люминесцентные спектры, объединяющие 
анализ поглощенного и испущенного в процессе люминесценции 
излучения; спектры рассеяния (в том числе комбинационного рассеяния) и т. д. В целом оптический спектральный анализ сегодня 
представляет собой исключительно продвинутую и всеобъемлющую область исследований. 
Особенно важную роль результаты оптического спектрального 
анализа играют в биологии и медицине, поскольку характерные частоты возбуждения биомолекул и различных биомолекулярных комплексов находятся именно в оптическом диапазоне. Следовательно, 
владея методами неразрушающего контроля состояния биообъектов, можно с помощью спектрального анализа получать уникальную информацию, не доступную для получения другими методами 
исследования. 
Спектр чаще всего изображается графически в виде зависимости от длины волны или частоты (реже — от пространственной частоты) какой-либо оптической характеристики исследуемого объекта 
(поток излучения, коэффициент поглощения, коэффициент пропускания и т. п.). Распространено также представление спектра в виде 
таблиц, что менее наглядно, зато более удобно для количественного 
анализа. Обычно исследователь использует и табличное, и графическое представления спектров. 

2. ОСНОВНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ СПЕКТРАЛЬНОГО ПРИБОРА 

2.1. Дифракционная решетка 

Основным элементом схемы любого спектрального прибора 
является диспергирующий элемент, осуществляющий разложение 
исследуемого излучения на монохроматические составляющие. 

В монохроматоре МДР-23, входящем в состав спектрального комплекса типа КСВУ-23, в качестве таковых применяются сменные 
дифракционные решетки. 
В современных спектральных приборах используются ступенчатые отражательные плоские дифракционные решетки — эшелетты, позволяющие концентрировать максимум электромагнитной 
энергии в нужной области спектра. Такие решетки представляют 
собой совокупность узких равноотстоящих параллельных зеркальных полос с треугольным профилем штриха и устанавливаются в 
параллельных пучках лучей, выходящих из объектива коллиматора. 
При падении на эшелетт параллельного пучка лучей на каждой зеркальной площадке имеет место дифракция Фраунгофера, причем 
пучки, дифрагированные на всех площадках, интерферируют между 
собой. Картина аналогична многолучевой интерференции, происходящей в интерферометре типа Фабри—Перо. Различие заключается 
только в том, что в интерферометре взаимодействуют бесконечно 
много пучков, а в решетке — конечное число. При условии быстрого спадания амплитуды в интерферометре и сравнительно медленного — в решетке результаты суммирования оказываются весьма 
схожими. 
Положение главных максимумов дифракционной решетки зависит от длины волны: 

 
0
(sin
sin
)
,
d
m
 


   
(2) 

где d — период решетки (расстояние между соседними штрихами); 
0 — угол падения исследуемого пучка на решетку;  — угол наблюдения дифрагированного пучка; m — порядок наблюдаемого 
спектра (целое число);  — длина волны излучения.  
Соотношение (2) называют основным уравнением плоской дифракционной решетки. 
Максимальная концентрация энергии в рабочем порядке спектра для современных дифракционных решеток достигает 80 %. В 
серийных спектральных приборах используются, как правило, эшелетты со стандартизованными числами штрихов на 1 мм: 100, 200, 
300, 600, 1200, 1800, 2400. 
Как ясно из уравнения (2), только в нулевом порядке (m = 0) 
положение главных максимумов дифракционной решетки не зависит от длины волны. Монохроматические составляющие анализи

руемого спектра можно считать независимыми. Поэтому решетка в 
каждом порядке разложит падающий свет в спектр, в котором отдельные монохроматические составляющие пространственно разделены. Главные максимумы, соответствующие m = 1, образуют 
спектр первого порядка, за ними идут спектры второго, третьего и 
более высоких порядков. Спектр каждого порядка (если считать, 
что падающий свет — белый) имеет вид цветной полосы, причем 
наиболее сильно отклоняются красные лучи, наименее — фиолетовые. Тем самым цвета в наблюдаемом спектре расположены в обратном порядке по сравнению с призменными монохроматорами, 
где отклонение обусловлено зависимостью от длины волны показателя преломления. 
Заметим, что положение соответствующей спектральной линии 
в спектре определяется значительно более простой формулой, чем 
для интерференционных или призменных спектральных приборов. 
В спектроскопии спектр называют нормальным, если координата, 
характеризующая положение спектральной линии в спектре, линейно меняется с длиной волны. При малых значениях углов дифракции, когда можно принять sin   (по аналогии с геометрической 
оптикой — в случае «параксиальных» дифрагирующих пучков), 
дифракционная решетка дает нормальный спектр. Это очень важное 
обстоятельство для калибровки спектральных приборов. 
Основными характеристиками дифракционной решетки, как и 
других спектральных приборов, являются дисперсия, дисперсионная 
область и разрешающая способность. Рассмотрим их подробнее. 
Дисперсия дифракционной решетки подразделяется на угловую 
и линейную. Принимая угол падения лучей на решетку 0 = const и 
дифференцируя основное уравнение плоской дифракционной решетки (2), получаем 

 
cos
.
d
d
md
  
   
(3) 

Угловой дисперсией называется производная 
,
d
d

  определяющая расстояние в спектре между двумя спектральными линиями 
с фиксированными длинами волн . Из уравнения (3) имеем 

 
0
sin
sin
.
cos
cos
d
m
d
d
 

 





 
(4) 

Следовательно, угловая дисперсия при заданных параметрах 
дифракционной решетки определяется углами  и 0. Это значит, 
что, используя скользящее падение исследуемого света на дифракционную решетку (0   / 2), можно значительно увеличить пространственное разделение компонентов в спектре. В самом деле, 
сохраняя требование «параксиальности» дифрагированных пучков, 
т. е. малого отклонения дифрагированного света от первоначального направления, уравнение (2) в случае скользящего падения можно 
переписать в виде 

 
0
0
cos
(
)
.
d
m
   

  

Это выражение аналогично уравнению (3) при угле падения 
0  0. Однако вместо «нормального» периода решетки здесь появился «скользящий» период dcosβ0, который при β0 → π / 2 может 
быть сделан очень малым. Благодаря такому изящному приему 
можно без труда наблюдать в белом свете дифракционные спектры от «решеток» в виде граммофонных пластинок, а в случае настоящих дифракционных решеток с большим числом штрихов на 
миллиметр (см. с. 5) уверенно наблюдать рентгеновские спектры. 
Именно так были получены первые картины рентгеновских спектров. 
Это значит, что с помощью обычных отражательных дифракционных решеток оптического диапазона можно получать полное 
внутреннее отражение рентгеновских лучей и измерять длину волны в рентгеновском диапазоне с точностью, не уступающей оптическому диапазону. Но поскольку рентгеновское излучение испытывает дифракцию на естественных кристаллах (эффекты Лауэ и 
Брэгга—Вульфа), можно измерять и постоянные кристаллических 
решеток. Итак, дифракционная спектроскопия позволяет «перебросить мостик» от оптического диапазона к нанодиапазону и дать 
метрологическое обеспечение для рентгеноструктурного анализа. 
Это имеет огромное методологическое значение для изучения 
структуры биомолекул, поскольку им, как и неорганическим кристаллам, присущи квазипериодические свойства. 
Если после дифракционной решетки стоит оптическая система 
(выходной коллиматор), то наряду с угловой дисперсией вводится 
линейная дисперсия dl / d λ:  

*
2
,
dl
d
f
d
d



  
(5) 

где l — поперечная линейная координата (расстояние от оптической 
оси); 
*
2f  — заднее фокусное расстояние объектива коллиматора. 
Линейная дисперсия является вспомогательной характеристикой, зависящей от параметров используемой оптической системы. 
Дисперсионной областью дифракционной решетки называется 
максимальная ширина спектрального интервала Δλ, при которой 
еще нет перекрытия спектров соседних порядков. 
Пусть длины волн падающего излучения лежат в интервале от λ 
до λ = λ + Δλ. Если при этом положения крайних компонентов в 
спектрах m-го и (m + 1)-го порядков совпадают, то  

 
0
(sin
sin
)
(
1) ,
d
m
m
 


 



 

т. е. 
(
1) ,
m
m
 



 и, следовательно,  

 
.
m

     

 
(6) 

Это и есть дисперсионная область дифракционной решетки в рассматриваемом участке спектра. Дисперсионную область называют 
также спектральной областью свободной дисперсии, подчеркивая 
«свободу» от перекрытия спектров соседних порядков. В связи с 
этим в рассмотрение вводится угловая область свободной дисперсии, определяемая как изменение угла dβ между направлениями одной и той же длины волны для соседних порядков в спектре. Эту 
величину получают дифференцированием основного уравнения дифракционной решетки (2) по m при постоянных β0, d и λ:  

 
(
)
.
cos
d
d




  
(7) 

Заметим, что угловая область свободной дисперсии не зависит явно 
от порядка спектра. Напротив, дисперсионная область Δλ тем больше, чем меньше порядок спектра. Это значит, что, работая с дифракционными приборами в спектрах низких порядков, можно исследовать весьма широкие участки спектра в отличие от применения интерференционных приборов. 

Большая дисперсия спектральных приборов еще не означает, 
что две спектральные линии с близкими длинами волн λ непременно разрешаются, т. е. воспринимаются как раздельные. В самом деле, каждая спектральная линия, как бы она ни была узка, изображается на выходе спектрального прибора в виде более или менее размытой фраунгоферовской дифракционной картины. Линейная 
дисперсия определяет расстояние, на которое разводятся центры 
дифракционных картин от отдельных спектральных линий с различными длинами волн. Если сами картины размыты и имеют значительную ширину, то даже при сравнительно большом разведении 
они будут восприниматься как картина от одной спектральной линии. Наименьшая разность длин волн двух спектральных линий δλ, 
при которой спектральный прибор разрешает эти линии, называется 
спектральным разрешаемым расстоянием, а величина R     — 
разрешающей способностью. 
Ситуация с разрешающей способностью аналогична предельному разрешению, даваемому оптическими приборами, и требует 
введения определенного критерия разрешения. Для определения 
разрешающей способности используется критерий Рэлея, согласно 
которому две спектральные линии считаются разрешенными, если 
главный максимум для одной длины волны совпадает по своему 
положению с первым минимумом в том же порядке для другой 
длины волны. Положение первого (побочного) минимума для длины волны λ определяется для решетки с общим числом N штрихов, 
как известно, условием 

 
0
1
(sin
sin
)
.
d
m
N



 








 
(8) 

Потребовав, чтобы то же условие (8) давало максимум для длины 
волны λ = λ + δλ, запишем
 

 
0
(sin
sin
)
.
d
m
 


  

Отсюда 
1
m
m
N



 





  и 

 
.
R
mN




 
(9) 

Общее число штрихов N дифракционной решетки естественно 
связать с периодом решетки d, поскольку 
1
d
N

  (где N  — число штрихов на 1 мм, а N d  B — общая ширина нарезанной части 
решетки). Для повышения разрешающей способности можно увеличивать либо число штрихов 
,
N  либо порядок спектра m. Но увеличение порядка, как мы установили выше (см. с. 8), ведет к уменьшению дисперсионной области. Поэтому в дифракционных спектральных приборах идут по пути увеличения числа штрихов. В 
монохроматоре МДР-23 имеются решетки с 600 и 1200 штрихами 
на 1 мм. При размерах решетки 100  100 мм общее число штрихов 
достигает 120 000, что для λ = 500 нм соответствует разрешаемой 
разности спектральных линий в первом порядке приблизительно 
4 · 10–3 нм. 

2.2. Фотоэлектронный умножитель 

В спектральных приборах широко используются в качестве фотоприемных элементов фотоэлектронные умножители (ФЭУ). Работа ФЭУ основана на внешнем фотоэффекте, заключающемся, как 
известно, в испускании электронов поверхностью металла при падении на нее потока оптического излучения. Испущенные в вакуумный объем с поверхности металлического электрода (фотокатода) фотоэлектроны могут ускоряться приложенным между катодом 
и анодом электрическим полем, образуя фототок.  
Особенность ФЭУ состоит в том, что ускоренные электроны 
попадают не сразу на анод, а на промежуточные электроды (диноды), дающие вторичную эмиссию электронов за счет передачи 
энергии от ускоренных фотоэлектронов. Тем самым фототок с катода, изначально очень слабый, лавинообразно усиливается за счет 
вторичной эмиссии с динодов. Коэффициент усиления по току для 
ФЭУ достигает 108, поэтому в принципе ФЭУ может работать в режиме счета отдельных фотонов и таким образом реализовывать 
квантовый предел чувствительности (темновой ток ФЭУ можно 
сделать очень малым). 
Высокая чувствительность ФЭУ не исчерпывает его достоинств 
как фоторегистрирующего элемента. Еще одно его несомненное 
преимущество — это высокое быстродействие, прямо связанное с