Инженерная энзимология
Покупка
Новинка
Издательство:
Оренбургский государственный университет
Год издания: 2021
Кол-во страниц: 182
Дополнительно
Вид издания:
Учебное пособие
Уровень образования:
ВО - Специалитет
ISBN: 978-5-7410-2538-3
Артикул: 839098.01.99
Учебное пособие составлено в соответствии с рабочей программой дисциплины «Инженерная энзимология» и включает в себя семь разделов, посвященных строению и классификации ферментов, кинетике и термодинамике ферментативных реакций, регуляции активности ферментов, синтезу белков и пептидов, лабораторный практикум, перечень вопросов к экзамену, а также тестовые задания. Учебное пособие предназначено для самостоятельной подготовки обучающихся к лекциям, практическим занятиям, лабораторным работам и экзамену по дисциплине «Инженерная энзимология» для очной формы обучения, обучающихся по специальности 06.05.01 Биоинженерия и биоинформатика.
Скопировать запись
Фрагмент текстового слоя документа размещен для индексирующих роботов.
Для полноценной работы с документом, пожалуйста, перейдите в
ридер.
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Оренбургский государственный университет» О.А. Науменко, Е.С. Барышева, Е.В. Бибарцева ИНЖЕНЕРНАЯ ЭНЗИМОЛОГИЯ Учебное пособие Рекомендовано ученым советом федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Оренбургский государственный университет» для обучающихся по образовательным программам высшего образования по специальности 06.05.01 Биоинженерия и биоинформатика Оренбург 2021
УДК 577.15 (076.5) ББК 28.072я7 Н 34 Рецензент – доцент, доктор биологических наук Е.В. Сальникова Н 34 Науменко, О.А. Инженерная энзимология : учебное пособие / О. А. Науменко, Е.С. Барышева, Е. В. Бибарцева ; Оренбургский гос. ун-т. – Оренбург : ОГУ, 2021 – 182 с. ISBN 978-5-7410-2538-3 Учебное пособие составлено в соответствии с рабочей программой дисциплины «Инженерная энзимология» и включает в себя семь разделов, посвященных строению и классификации ферментов, кинетике и термодинамике ферментативных реакций, регуляции активности ферментов, синтезу белков и пептидов, лабораторный практикум, перечень вопросов к экзамену, а также тестовые задания. Учебное пособие предназначено для самостоятельной подготовки обучающихся к лекциям, практическим занятиям, лабораторным работам и экзамену по дисциплине «Инженерная энзимология» для очной формы обучения, обучающихся по специальности 06.05.01 Биоинженерия и биоинформатика. УДК 577.15 (076.5) ББК 28.072я7 ISBN 978-5-7410-2538-3 © Науменко О.А., Барышева Е.С., Бибарцева Е.В.,2021 © ОГУ, 2021
Содержание Введение ............................................................................................................................... 7 Обозначения и сокращения ................................................................................................ 8 1 Общие принципы структурной организации белков и молекулярные механизмы их сворачивания в функционально активную конформацию .............................................. 9 1.1 Определение энзимологии как науки, история открытия, номенклатура и классификация ферментов .............................................................................................. 9 1.1.1 Определение энзимологии как науки ................................................................ 9 1.1.2 История развития энзимологии как науки ...................................................... 10 1.1.3 Направления исследований в области энзимологии ..................................... 11 1.1.4 Номенклатура и классификация ферментов ................................................... 12 1.1.5 Мономеры и олигомеры ................................................................................... 17 1.2 Надмолекулярная организация ферментов ........................................................... 19 1.2.1 Виды надмолекулярных форм организации ферментов ............................... 19 1.2.3 Роль металлов в качестве кофакторов ............................................................. 22 1.2.4 Активный центр ферментов ............................................................................. 23 1.2.5 Особенности строения активного центра ....................................................... 24 1.2.6 Свойства среды активного центра ферментов ............................................... 25 1.2.7 Аллостерический центр .................................................................................... 27 1.2.8 Определение активности ферментов ............................................................... 27 1.3 Принципы пространственной организации молекулы фермента ....................... 28 1.3.1 Силы стабилизирующие третичную структуру белка – фермента .............. 28 1.3.2 Термодинамика сворачивания третичной структуры белка ......................... 29 1.3.3 Значение водородной связи в процессе сворачивания белка в нативную конформацию .............................................................................................................. 29 1.3.4 Роль гидрофобных связей ................................................................................. 31 1.3.5 Значение Ван – дер - Ваальсовых связей ........................................................ 32 1.3.6 Значение электростатических связей .............................................................. 32 1.3.7 Роль дисульфидной связи ................................................................................. 33 1.3.8 Физическая форма третичной структуры белка – фермента ........................ 34 1.4 Механизм формирования пространственной структуры белков – ферментов . 36 1.4.1 Парадокс С. Левенталя ...................................................................................... 36 1.4.2 Стадии сворачивания белка, иерархический принцип сворачивания ......... 37 1.4.3 Термодинамическая характеристика процесса сворачивания ...................... 37 1.4.4 Внутриклеточная регуляция пространственной структуры белка ............... 38 1.5 Домены, структурная и функциональная характеристика .................................. 40 1.5.1 Определение доменов ....................................................................................... 40 1.5.2 Доказательства доменной стадии сворачивания белка ................................. 40
1.5.3 Свойства доменов .............................................................................................. 42 1.5.4 Мультидоменная организация молекулы фермента ...................................... 43 1.6 Характеристика фермент - субстратного комплекса ........................................... 43 1.6.1 Механизм образования фермент - субстратных комплексов в растворителе ...................................................................................................................................... 44 1.6.2 Оценка свободной энергии сорбции комплекса фермент – лиганд ............. 46 1.6.3 Модели взаимодействия фермента и субстрата в катализе .......................... 47 2 Общие вопросы кинетики и термодинамики ферментативных реакций ................. 50 2.1 Законы классической термодинамики в биохимии .............................................. 50 2.1.1 Основные понятия кинетики и термодинамики. Термодинамические системы (ТС) ............................................................................................................... 50 2.1.2 Термодинамический процесс ........................................................................... 53 2.1.3 Первый закон термодинамики ......................................................................... 54 2.1.4 Второй закон термодинамики .......................................................................... 55 2.1.5 Характеристические функции состояния ТС ................................................. 56 2.2 Кинетика Михаэлиса – Ментена ............................................................................ 58 2.2.1 Химическая кинетика. Понятие порядка реакции ......................................... 58 2.2.2 Кинетика Михаэлиса – Ментена ...................................................................... 59 2.2.3 Ограничения кинетики Михаэлиса-Ментена ................................................. 63 2.2.4 Образование кинетически устойчивого фермент-субстратного комплекса (обоснование первого постулата) ............................................................................. 63 2.3 Природа константы К в уравнении Михаэлиса - Ментена .................................. 64 2.3.1 Стационарная кинетика Бриггса и Холдейна (обоснование второго постулата) .................................................................................................................... 64 2.3.2 Природа константы К в уравнении Михаэлиса-Ментена ............................. 65 2.3.3 Методы графического определения кинетических параметров ................... 67 2.4 Кинетический анализ двухстадийных ферментативных реакций, не подчиняющихся уравнению Михаэлиса-Ментена ......................................................... 69 2.4.1 Изменение концентрации субстрата в ходе ферментативной реакции (обоснование третьего постулата) ............................................................................ 70 2.4.2 Методика нахождения кинетических констант при условии [S]0 [S]t ....... 73 2.5 Влияние обратимых эффекторов на кинетику ферментативной реакции ......... 74 2.5.1 Механизмы влияния обратимых эффекторов на кинетику ферментативной реакции ........................................................................................................................ 74 2.5.2 Кинетика ферментативных реакций, протекающих с участием эффектора 75 3 Механизмы регуляция активности ферментов ........................................................... 84 3.1 Виды механизмов регуляции. Определение метаболизма. Понятие конститутивных и адаптивных ферментов ................................................................. 84 3.1.1 Классификация механизмов регуляции активности ферментов по интенсивному пути ..................................................................................................... 85 3.1.2 Понятие активаторов и ингибиторов .............................................................. 86 3.1.3 Необратимая ковалентная модификация, ограниченный протеолиз ........... 88
3.1.4 Обратимая ковалентная модификация, регуляция ковалентным связыванием ................................................................................................................ 89 3.1.5 Механизмы регуляции активности ферментов в без ковалентной модификации ............................................................................................................... 91 3.2 Ассоциативный механизм регуляции активности ферментов ............................ 93 3.2.1 Механизмы ассоциаций ферментов................................................................. 94 3.2.2 Зависимость активности фермента от его олигомерной ассоциации ......... 95 3.2.3 Регуляция активности олигомерных ферментов специфическими лигандами .................................................................................................................... 96 3.3 Адсорбционный механизм регуляции активности ферментов ........................... 97 3.3.1 Физиологическое значение адсорбции ферментов на субклеточных структурах ................................................................................................................... 97 3.3.2 Адсорбционный механизм регуляции ............................................................. 97 3.3.3 Эстафетная модель работы фермента ............................................................. 99 3.4 Факторы, влияющие на ферментативную активность. Влияние рН и температуры на кинетику ферментативных реакций .............................................. 101 3.4.1 Факторы, влияющие на ферментативную активность ................................ 101 3.4.2 Обратимое влияние температуры на каталитическую активность фермента .................................................................................................................................... 101 3.4.3 Влияние рН на кинетику ферментативных реакций в растворах ............... 102 4 Пептидный синтез и химическая модификация белков и пептидов ....................... 104 4.1 История и значение пептидного синтеза ............................................................. 104 4.2 Методы определения первичной структуры белка ............................................ 104 4.2.1 Этапы определения первичной структуры белка......................................... 105 4.2.2 Методы определения аминокислотного состава белка ............................... 106 4.2.3 Методы определения N-концевых АК .......................................................... 108 4.2.4 Определение С - концевой аминокислоты.................................................... 109 4.3 Методы фрагментации полипептидной цепи ..................................................... 110 4.3.1 Ферментативный гидролиз ............................................................................. 110 4.3.2 Метод ограниченного протеолиза ................................................................. 111 4.4 Пептидный синтез .................................................................................................. 115 4.4.1 Классический пептидный синтез в растворе ................................................ 115 4.4.2 Ферментативный пептидный синтез ............................................................. 116 4.4.3 Метод твердофазного синтеза пептидов ....................................................... 119 4.4.4 Методы создания пептидной связи ............................................................... 120 4.5 Защитные группировки, используемые в пептидном синтезе .......................... 121 4.5.1 Требования к защитным группам .................................................................. 121 4.5.2 Два типа защитных групп в пептидном синтезе .......................................... 122 4.5.3 NH2-защитные группировки .......................................................................... 122 4.5.4 СООН-защитные группировки ...................................................................... 123 4.5.5 Защитные группировки для функциональных групп боковых цепей аминокислот .............................................................................................................. 124 4.6 Химическая модификация белков и пептидов .................................................... 125 4.6.1 Химическая модификация .............................................................................. 125
4.6.2 Селективная модификация аминокислотных остатков ............................... 126 4.6.3 Бифункциональные реагенты ......................................................................... 128 5 Лабораторный практикум ............................................................................................ 134 5.1 Проведение реакций осаждения белков с оценкой их первичного и вторичного состава с помощью цветных реакций ........................................................................ 134 5.2 Количественное определение белка биуретовым методом ............................... 138 5.3 Диализ солевого раствора белка .......................................................................... 140 5.4 Бумажная хроматография аминокислот .............................................................. 142 5.5 Титрометрическое определение активности каталазы ...................................... 145 5.6 Определение активности амилазы ....................................................................... 147 5.7 Определение активности пероксидазы ................................................................ 149 5.8 Влияние рН среды на активность амилазы ......................................................... 152 5.9 Влияние температуры на активность фермента амилазы .................................. 154 5.10 Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы ........................ 158 5.11 Очистка алкогольдегидрогеназы методом гель – хроматографии ................. 161 5.12 Обнаружение НАД в дрожжах ........................................................................... 163 5.13 Обнаружение цитохромоксидазы в мышцах .................................................... 164 5.14 Обнаружение каталазы в крови .......................................................................... 165 5.15 Сукцинатдегидрогеназа мышц и конкурентное торможение еѐ активности 166 6 Перечень вопросов, выносимых на экзамен .............................................................. 168 7 Фонд тестовых заданий ............................................................................................... 173 Список использованных источников ............................................................................ 179
Введение Изучение структуры ферментов, их активных центров и регуляции скорости ферментативных реакций является актуальной задачей биохимии. Современные биотехнологическое и фармацевтическое производства активно используют белки ферменты в качестве катализаторов при получении новых продуктов и лекарств, поэтому изучение основ инженерной энзимологии является важным этапом подготовки специалистов биоинженеров. Разделы учебного пособия составлены в соответствии с рабочей программой дисциплины «Инженерная энзимология» и включает в себя семь разделов, посвященных строению и классификации ферментов, кинетике и термодинамике ферментативных реакций, регуляции активности ферментов, синтезу белков и пептидов, лабораторный практикум, перечень вопросов к экзамену, а также тестовые задания. Каждый раздел учебного пособия содержит контрольные вопросы для самоподготовки и самоконтроля полученных знаний. Лабораторные работы, приведенные в пособии, позволят приобрести студентам навыки определения скорости ферментативных реакций, проводить расчеты термодинамических характеристик в зависимости от заданных параметров, выделять белки для исследования, научиться технологиям выделения и очистки белков, а также определения активности ферментов.
Обозначения и сокращения АДФ – аденозиндифосфат ФАД – флавинадениндинуклеотид окисленный АКО – аминокислотный остаток ФМН – флавинмононуклеотид АМФ – аденозинмонофосфат АК – аминокислота ХФР – химическая ферментативная реакция АТФ – аденозинтрифосфат ЦПЭ – цепь переноса электронов АлЦ – аллостерический центр ЦТК – цикл трикарбоновых кислот АЦ – активный центр цАМФ – циклический АМФ БАПНА – N – бензоил –L – аргинин-паранитроанилид НАД – никотинамидаденин динуклеотид окисленный НАДН – никотинамидаденин динуклеотид восс тановленный ФАДН2 –флавинадениндинуклеотид восстановленный ВМП – внутренняя мембрана митохондрий ММП – межмембранное пространство митохондрий ГФА – гликогентрансфераза А РНК – рибонуклеиновая кислота ГФВ – гликогентрансфераза В ТС – термодинамическая система ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ТП – термодинамический процесс
1 Общие принципы структурной организации белков и молекулярные механизмы их сворачивания в функционально активную конформацию 1.1 Определение энзимологии как науки, история открытия, номенклатура и классификация ферментов 1.1.1 Определение энзимологии как науки Энзимология – это раздел биохимии, который изучает ферменты. Энзимы – это специализированные белки, которые являются биологическими катализаторами и обладают нативной конформацией. От обычных функциональных белков ферменты отличает то, что на поверхности белковой глобулы у них имеется активный центр (АЦ). Это участок, образованный из различных аминокислотных остатков, собранных из различных областей полипептидной цепи, где происходит связывание и превращение субстрата. При этом субстратом называется химическое соединение, претерпевающее изменение в ходе каталитического процесса, с образованием продукта реакции. Кроме активного центра, у некоторых ферментов имеется еще и регуляторный участок – аллостерический центр (АлЦ). В этом участке связываются молекулы, оказывающие влияние на превращение субстрата в химической ферментативной реакции. При этом сами ферменты не претерпевают изменений. В активном центре фермента располагаются аминокислотные остатки, содержащие функциональные группы (-SH, -СООН, -ОН, -NH2), которые принимают участие в каталитическом процессе. Условно активный центр фермента можно разделить на два участка: сорбционный, отвечающий за связывание субстрата, и каталитический, в котором происходит превращение субстрата. Размер активного центра фермента определяется размером субстрата, реализуя в действии принцип индуцированного соответствия. Геометрия расположения
функциональных групп активного центра соответствует природе субстрата, определяя эффективность его связывания и превращение в ходе химической ферментативной реакции. Константа, характеризующая эффективность превращения субстрата в активном центре фермента, называется каталитической константой (Кк), а константа, определяющая сродство субстрата к ферменту, - константой связывания (Ks). Действие эффекторов (активаторов и ингибиторов) определяют с помощью констант активирования (Ка) и ингибирования (Кi). Активность фермента зависит от природы фермента, субстрата, их концентраций, межсубъединичных взаимодействий белковых глобул, состава раствора, природы растворителя, ионной силы раствора, рН среды, присутствия ингибиторов и активаторов, температуры, давления, УФ-облучения и других физических факторов. С повышением температуры среды активность ферментов возрастает, однако при температуре выше 50°С наблюдается снижение активности фермента из-за разрушения нативной структуры белковой глобулы. Возрастание температуры сопровождается увеличением подвижности функциональных групп в области активного центра и изменением нативной конформации белка. Влияние рН на активность фермента может проявляться через ассоциативное поведение ионизирующих групп активного центра и функциональных групп суб страта. На активность фермента может также повлиять поведение групп, расположенных на поверхности белковой глобулы, ионизация которых может приводить к изменению конформации белка фермента. 1.1.2 История развития энзимологии как науки Зарождение учения о ферментах относится к первой половине XIX века. Первое научное представление о ферментах было дано еще в 1814 г. Петербургским ученым К.С. Кирхгофом, который показал, что не только проросшие зерна ячменя, но и экстракты из солода способны осахаривать крахмал с превращением его в
мальтозу. Вещество, извлекаемое из проросшего ячменя и обладающее способностью превращать крахмал в мальтозу, получило название амилазы. Ю. Либих и Ф. Веллер открыли агент, расщепляющий амигдалин, содержащийся в эфирном масле горького миндаля. Этот агент был назван эмульсином. В последующие годы были описаны другие ферменты, в частности пепсин и трипсин, вызывающие распад (гидролиз) белков в пищеварительном тракте. В 1913 году Михаэлис и Ментен выдвинули теорию механизма работы ферментов. В 1926 году (считается официальным годом рождения энзимологии как науки) Самнер выделил кристаллическую уреазу и доказал ее белковую природу. С тех пор было обнаружено и выделено более 700 ферментов, но в живых организмах их существует гораздо больше. В 1929 году другой биохимик – Д. Нортроп сообщил о выделении им кристаллического препарата пепсина, а затем трипсина и других ферментов. В 1946 году Нортроп и Самнер были удостоены Нобелевской премии за открытие белков ферментов. В 1969 году Меррифильд (Нью Йорк) синтезировал искусственно рибонуклеазу и доказал, что все ферменты являются белками. 1.1.3 Направления исследований в области энзимологии Перечислим основные современные направления исследований в энзимологии: 1) исследования более тонких деталей молекулярного механизма и принципов действия ферментов в соответствии с законами классической органической химии и квантовой механики, а также совершенствование теории ферментативного катализа;
2) изучение ферментов на более высоких уровнях (надмолекулярном и клеточном) структурной организации живых систем, причем не столько отдельных ферментов, сколько ферментных комплексов в сложных системах; 3) исследование механизмов регуляции активности и синтеза ферментов и вклада химической модификации в действие ферментов; 4) развитие исследований в области создания искусственных низкомолекулярных ферментов – абзимов (синтетические аналоги ферментов), наделенных аналогично нативным ферментам высокой специфичностью действия и каталитической активностью, но лишенных побочных антигенных свойств; 5) исследования в области инженерной энзимологии (белковая инженерия), создание «гибридных» катализаторов, сочетающих свойства ферментов, антител и рецепторов, а также создание биотехнологических реакторов с участием индивидуальных ферментов или полиферментных комплексов, обеспечивающих получение и производство наиболее ценных материалов и средств для народного хозяйства и медицины; 6) исследования в области медицинской энзимологии, основной целью которых является выяснение молекулярных основ наследственных и соматических болезней человека, в основе развития, которых, лежат дефекты синтеза ферментов или нарушения регуляции активности ферментов в организме человека. 1.1.4 Номенклатура и классификация ферментов Существуют три основных принципа классификации ферментов: 1) по химической природе фермента; 2) по химической природе субстрата; 3) по типу катализируемой реакции. Вопрос рациональной классификации ферментов весьма труден. Специфическим признаком, отличающим один фермент от другого, является катализируемая ферментами химическая реакция. Этот классификационный признак
и положен в основу систематической классификации ферментов, которая утверждена Комиссией по ферментам Международного биохимического союза (IUBМВ) в 1961 году. Вместе с этим продолжают применяться и тривиальные (рабочие) названия, которые, как правило, короче и поэтому более употребительны. Систематическая классификация учитывает реакционную и субстратную специфичность ферментов. Все ферменты включены в «Каталог ферментов» под своим классификационным номером или кодом фермента (КФ), состоящим из 4 цифр. Первая цифра КФ указывает на принадлежность фермента к одному из 6 главных классов, в зависимости от типа реакции. Внутри каждого класса ферменты подразделяются на подклассы в зависимости от типа субстрата (2 цифра КФ), а подклассы в свою очередь подразделяются на подподклассы в зависимости от типа кофермента, реагента или особенностей реакции (3 цифра КФ). Четвертая цифра указывает порядковый номер фермента в пределах данного подподкласса. Согласно Международной классификации, ферменты делят на шесть главных классов, в каждом из которых выделяют несколько подклассов, подподклассов и каждый фермент имеет свой порядковый номер. В зависимости от типа катализируемой химической реакции были признаны 6 классов ферментов: оксидоредуктазы (EC 1), трансферазы (EC 2), гидролазы (EC 3), лиазы (EC 4), изомеразы (EC 5) и лигазы (EC 6): 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы; 4) лиазы; 5) изомеразы; 6) лигазы (синтетазы). 1.1.4.1 Оксидоредуктазы. К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие окислительно - восстановительные реакции с участием двух субстратов, лежащие в основе биологического окисления. Систематические
названия их составляют по форме «донор: акцептор оксидоредуктаза». Например, лактат: НАД+ оксидоредуктаза для фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Различают следующие основные подклассы оксидоредуктаз: - аэробные дегидрогеназы или оксидазы, катализирующие перенос протонов (электронов) непосредственно на кислород; - анаэробные дегидрогеназы, ускоряющие перенос протонов (электронов) на промежуточный субстрат, но не на кислород; - цитохромы, катализирующие перенос только электронов. К этому классу относят также гемсодержащие ферменты каталазу и пероксидазу, катализирующие реакции с участием перекиси водорода. 1.1.4.2 Трансферазы. К классу трансфераз относят ферменты, катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных атомов, групп атомов и радикалов. Наименование их составляется по форме «донор: транспортируемая группа – трансфераза». Различают трансферазы, катализирующие перенос одноуглеродных остатков, ацильных, гликозильных, альдегидных или кетонных, нуклеотидных остатков, азотистых групп, остатков фосфорной и серной кислот и др. Например: метил- и формил - трансферазы, ацетилтрансферазы, аминотрансферазы, фосфотрансферазы и др. 1.1.4.3 Гидролазы. В класс гидролаз входит большая группа ферментов, катализирующих расщепление внутримолекулярных связей органических веществ при участии молекулы воды. Наименование их составляют по форме «субстрат - гидролаза». К ним относятся: 1) эстеразы – ферменты, катализирующие реакции гидролиза и синтеза сложных эфиров; 2) гликозидазы, ускоряющие разрыв гликозидных связей;