Стереоспецифические взаимодействия. Инструментальные и неинструментальные методы в иммуноаналитике

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное 

образовательное учреждение высшего образования

«ПЕРМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ 

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

П. В. Храмцов, М. Б. Раев, С. А. Заморина

СТЕРЕОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ 

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ И НЕИНСТРУМЕНТАЛЬНЫЕ 

МЕТОДЫ В ИММУНОАНАЛИТИКЕ

Допущено методическим советом

Пермского государственного национального
исследовательского университета в качестве
учебного пособия для студентов, обучающихся

по направлению подготовки магистров 

«Биология»

Пермь 2020

УДК 612.017;612.018;571.27
ББК 28.591: 20.18я73

Х89

Х89

Храмцов П. В.

Стереоспецифические взаимодействия. Инструментальные и неинструментальные методы в иммуноаналитике [Электронный ресурс] : 
учебное пособие / П. В. Храмцов, М. Б. Раев, С. А. Заморина ; 
Пермский государственный национальный исследовательский университет. – Электронные данные. – Пермь, 2020. – 6,25 Мб ; 105 с. –
Режим доступа: http://www.psu.ru/files/docs/science/books/uchebnieposobiya/hramcov-raev-zamorina-stereospecificheskievzaimodejstviya.pdf. – Заглавие с экрана.

ISBN 978-5-7944-3590-0

В пособии рассмотрены базовые принципы разработки, функционирования 

и оценки диагностических систем, использующихся в биомедицине, сельском 
хозяйстве, пищевой промышленности и ряде других отраслей. Существенное 
внимание уделено перспективам применения различных наноматериалов для 
конструирования тест-систем. Учебное пособие предназначено студентам биологического факультета при изучении ими курса «Стереоспецифические взаимодействия».

Ил. 68. Библиогр. 60 назв.

УДК 612.017;612.018;571.27

ББК 28.591: 20.18я73

Печатается по решению ученого совета биологического факультета

Пермского государственного национального исследовательского университета

Рецензенты: лаборатория экологической иммунологии «ИЭГМ УрО РАН», 

г. Пермь (зав. лабораторией д-р мед. наук К. В. Шмагель);

профессор кафедры факультетской терапии № 2, профпатологии 
и клинической лабораторной диагностики Пермского государственного
медицинского
университета
им.
академика 

Е. А. Вагнера, д-р мед. наук Д. Ю. Соснин

ISBN 978-5-7944-3590-0

© Храмцов П. В., Раев М. Б., Заморина С. А., 2020
© ПГНИУ, 2020

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………….
4

ГЛАВА 1. Поиск иголки в стоге сена: лабораторная
диагностика, аналитика и стереоспецифические 
взаимодействия…………………………………………………………………………...
5

ГЛАВА 2. Молекулы, способные к стереоспецифическеому 
взаимодействию: Натуральные, полусинтетеические 
и синтетические……………………………………………………………………………
9

ГЛАВА 3. Виды анализов, основанные на стереоспецифических 
взаимодействиях…………………………………………………………………………
26

ГЛАВА 4. Разнообразие диагностических систем на примере 
иммуноферментного анализа……………………………………………………….
43

ГЛАВА 5. Аналитические характеристики тест-систем………………..
64

ГЛАВА 6. Наноматериалы и их применение в лабораторной
диагностике…………………………………………………………………………………
70

ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………….………………………
97

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ…………………………………………………………….
98

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………………
99

ВВЕДЕНИЕ

В учебном пособии изложены базовые принципы разработки, 

функционирования и оценки диагностических систем, которые используются в биомедицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности 
и ряде других отраслей. Примерами таких тест-систем являются экспресс-тесты на беременность, продающиеся в любой аптеке, тесты на 
ВИЧ, гепатиты, сифилис, аллергии, которые делают в клинических лабораториях, а также целый ряд тест-систем, использующихся в ветеринарии, при оценке качества пищевых продуктов, научных исследованиях и т. д. Особенностью этих систем диагностики является то, что они 
основаны на стереоспецифических взаимодействиях, на узнавании целевых молекул другими молекулами или композитами.

Первые два раздела знакомят читателя с понятием о стереоспеци
фических взаимодействиях, их использовании для разработки систем 
диагностики, а также в них изложен материал о спектре ключевых молекул, которые способны к стереоспецифическим взаимодействиям. В 
следующих двух разделах представлено разнообразие форматов современных систем диагностики, включая их преимущества и недостатки. 
Пятый раздел посвящен оценке эффективности работы тест-систем, а 
также факторам, которые могут на нее повлиять. В последнем разделе, 
который носит название «Наноматериалы и их применение в лабораторной диагностике», мы рассмотрели основные типы наноматериалов, 
которые являются перспективными с точки зрения их использования в 
тест-системах. Кратко описаны их физико-химические свойства, делающие эти наночастицы привлекательными для практического здравоохранения. Вместе с тем мы выделили факторы, препятствующие быстрому внедрению наноматериалов и их коммерциализации.

В пособии не только описаны принципы функционирования тест
систем и дана их классификация, но и кратко изложены проблемы, которые стоят перед разработчиками тест-систем на пути их внедрения в 
практику. Пособие предназначено для студентов, слушающих курс 
«Стереоспецифические взаимодействия» в Пермском государственном 
национальном исследовательском университете. Для лучшего усвоения 
материала необходимо знать основы иммунологии и биохимии, а именно разделы, посвященные гуморальному иммунитету и межмолекулярным взаимодействиям.

ГЛАВА 1. ПОИСК ИГОЛКИ В СТОГЕ СЕНА: ЛАБОРАТОРНАЯ
ДИАГНОСТИКА, АНАЛИТИКА И СТЕРЕОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ 
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

Зачем и как выявлять нужные молекулы, клетки и вирусы?

В медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве и других отраслях 

существует необходимость оценивать наличие в различных образцах 
молекул, клеток, вирусов. Для ответа на обычные вопросы – «Чем болен 
человек?», «Каков риск развития патологии?», «В норме ли уровень 
гормона?», «Заражен ли картофель вирусом?», «Производят ли бактерии в реакторе достаточное количество белка?» – требуется взять соответствующий образец – несколько миллилитров крови человека, кусочки тканей растений, пробы из среды культивирования бактерий –
и провести анализ. В дальнейшем мы будем называть аналитом то вещество (соединение), наличие и/или концентрацию которого необходимо установить.

Как было сказано выше, необходимость определения разнообраз
ных аналитов существует в самых различных отраслях деятельности человека. Мы будем уделять внимание прежде всего области клинической 
лабораторной диагностики, направленной на выявление заболеваний 
человека и оценку состояния систем его органов с целью профилактики 
болезней или мониторинга процесса выздоровления. Иногда, тем не менее, мы будем затрагивать аспекты тех или иных видов анализа, которые 
используются в областях, не связанных с медициной, например пищевой 
промышленности, мониторинге состояния окружающей среды или сельского хозяйства. 

В чем состоит принцип обнаружения аналита в исследуемых об
разцах? Большинство соединений, с которыми имеют дело лаборатории,
не видны невооруженным глазом. Это клетки, вирусы или молекулы, 
которые имеют размеры менее нескольких микрометров, а зачастую в 
диапазоне нескольких нанометров. Например, размер сывороточного 
альбумина, основного белка крови человека, составляет примерно 5 нм. 
Такие молекулы нельзя увидеть и подсчитать, а значит, надо использовать какие-то другие способы оценки их концентрации и наличия в образце. Стоит учитывать, что большинство исследуемых образцов в меди

цинской диагностике – это ткани человека, выделения желез, биоптаты. 
Кровь, слюна, моча, спинномозговая жидкость, смывы со слизистых –
вот с чем имеют дело в лабораториях. Каждая из этих сред представляет 
собой сложную смесь макромолекул, солей, клеток, пигментов и т. д. Таким образом, задача аналитиков зачастую сводится к количественной 
оценке содержания вещества в сложных смесях, которые, помимо прочих, включают в себя соединения такой же природы, часто обладающие
идентичными физико-химическими свойствами. Как же решить эту задачу?

В большинстве случаев для нахождения нужного объекта в массе 

других необходимы отличительные признаки этого объекта. Возьмем в качестве примера задачу обнаружения патогенной бактерии в образцах носоглоточных смывов. Это типичная задача при диагностике 
заболеваний дыхательных путей. Как узнать, есть ли среди множества 
клеток носоглоточного смыва, в том числе бактериальных, интересующий нас патоген? Для этого необходимо выяснить – чем этот бактериальный патоген отличается от других компонентов носоглоточного смыва. От мелких молекул и биополимеров, таких как углеводы и белки, он 
отличается размером. Но в чем его отличие от других бактерий? Этим 
отличием могут быть особая среда роста, на которой не могут расти другие бактерии (селективная среда), устойчивость к определенным веществам (как вариант селективной среды), особая отличительная форма 
или цвет образуемых им при росте на питательной среде колоний, по которым можно однозначно определить возбудителя, что может быть использовано, например, для выявления золотистого стафилококка.

Если говорить про молекулы, то и у них могут быть уникальные 

особенности, например окраска, как у гемоглобина или билирубина, каталитическая активность у ферментов. Используя спектроскопию или 
оценивая интенсивность ферментативной реакции, можно сделать вывод о наличии и количестве таких белков. Только далеко не все молекулы имеют такие уникальные особенности, присущие только им и никаким другим. Иногда требуется выявить среди массы одинаковых молекул отдельные группы, например, среди всех антител в организме – те, 
которые специфичны к ВИЧ или бледной трепонеме, для того чтобы 
определить, болен человек этими заболеваниями или нет. Иногда требу

ется оценить соотношение изоформ какого-либо белка, которые отличаются друг от друга лишь некоторыми структурными особенностями. 
Какие методы можно использовать в этом случае?

Отличия в аминокислотной последовательности белков могут быть 

выявлены при помощи методов протеомики, в частности массспектрометрии, однако такой подход едва ли применим в больших масштабах ввиду трудоемкости, сложности и высокой стоимости оборудования. В случаях, когда речь идет о массовом обследовании сотен и даже 
тысяч пациентов поликлиники в течение пары дней, нужны кардинально иные подходы. Такие подходы существуют, и, более того, они, по сути 
своей, созданы или вдохновлены самой природой. Основой их являются 
стереоспецифические взаимодействия.

Что такое стереоспецифические взаимодействия?

Стереоспецифические взаимодействия между молекулами обусловлены 

структурным и пространственным соответствием. Обычно для иллюстрации таких взаимодействий используют пример замка с ключом. 

РИСУНОК 1. Пространственное и структурное соответствие 

двух молекул

Определенные участки двух молекул соответствуют друг другу про
странственно, например, имеются соответствующие друг другу углубления и выпячивания на поверхности молекулы. Под структурным соответствием мы понимаем наличие на соответствующих поверхностях дополняющих друг друга функциональных групп (рис. 1), обусловливающих гидрофобные, электростатические и водородные взаимодействия 
между этими двумя молекулами. Подобные взаимодействия термодинамически выгодны, вследствие чего образуются устойчивые межмолекулярные комплексы. Примерами молекул, способных к стереоспецифическому взаимодействию, огромное количество: это пары гормонрецептор, фермент-субстрат, антитело-антиген, ДНК-ДНК и многие другие. 

С точки зрения анализа наиболее ценно то, что такие взаимодей
ствия могут быть использованы для обнаружения молекул в клинических образцах, поскольку способность стереоспецифически, комплементарно взаимодействовать с другой молекулой – это как раз то самое уникальное отличительное свойство, по которому эту молекулу можно отличить от других. Но у каждой ли молекулы в природе есть такая «пара», с которой они образуют тот самый желанный комплекс? Можно ли 
найти такую пару, если речь идет не о молекуле, а о бактерии, вирусе 
или же, наоборот, о чем-то необычайно маленьком, как ионы? Это возможно, если использовать в своих целях комплекс знаний об иммунной системе и эволюции. В следующей главе мы рассмотрим молекулы, способные к стереоспецифическому взаимодействию и их ключевые свойства.

ГЛАВА 2. МОЛЕКУЛЫ, СПОСОБНЫЕ 
К СТЕРЕОСПЕЦИФИЧЕСКЕОМУ ВЗАИМОДЕЙСТВИЮ: 
НАТУРАЛЬНЫЕ, ПОЛУСИНТЕТЕИЧЕСКИЕ 
И СИНТЕТИЧЕСКИЕ

Моноклональные и поликлональные антитела

Иммунная система высших животных продуцирует антитела в от
вет на введение в организм антигенов. Антитела обладают способностью 
с высокой специфичностью связываться с эпитопами антигенов, реализуя свои защитные функции. Это ключевое свойство антител может быть 
использовано для разработки различных систем анализа, поскольку есть 
возможность производить антитела против широкого спектра мишеней, 
которые являются важными для лабораторной диагностики. Это могут 
быть белки, гликопротеины, липопротеины, ДНК, низкомолекулярные 
соединения (стероидные гормоны, пигменты), вирусы и целые клетки. 
Существенная часть диагностически значимых маркеров относится к 
перечисленным группам. Как правило, в лабораторной диагностике используются антитела мышей, кроликов, коз, лошадей, крыс, относящиеся к классу IgG.

Выделенные и очищенные антитела могут быть использованы для 

улавливания и обнаружения целевых антигенов. Для этого достаточно 
создать такие условия, при которых будет обеспечен контакт между ними. Антитела при этом образуют комплекс с антигеном. Это может происходить как в объеме жидкости, так и в том случае, если антитела или 
антигены закреплены на какой-либо поверхности. 

Отдельный вопрос: а что последует за этим? Как узнать, образовал
ся ли такой комплекс и если да, то сколько их получилось? Как сделать 

взаимодействие 
антигена 
и 
антитела 
видимым 
для 
человека? 

В некоторых случаях такие комплексы видны невооруженным глазом, 

например, если в качестве мишени выступают бактериальные клетки. 

При их взаимодействии с антителами в физиологическом растворе об
разуются хорошо различимые глазом пленки или агрегаты. Такой тип 

анализов называют агглютинационным и используют для идентифика

ции бактерий, обнаружения антител к бактериям, эритроцитам, а также 

к антигенам, сорбированным на поверхности крупных частиц. Этот тип 

анализов будет рассмотрен в главе «

Агглютинационные анализы: агглютинация бактерий, понятие 

о гомогенном и гетерогенном анализе». Другим подходом является использование метки – атома, молекулы или частицы, которые обладают 
свойствами, позволяющими обнаружить их присутствие и оценить количество визуально либо при помощи специального прибора. Примером 
такой метки являются окрашенные частицы латекса, которые используются в тестах на беременность (рис. 2).

РИСУНОК 2. Комплекс, образующийся на поверхности тест-полоски в 
ходе теста на беременность. Одно из антител ковалентно прикреплено 
к ярко окрашенной частице. Справа тест-полоска в пластиковом корпу
се с двумя четко различимыми синими полосами в тестовой и кон
трольной зонах (обведено кружком), ХГЧ – хорионический 

гонадотропин

Принцип теста заключается в улавливании гормона хорионическо
го гонадотропина человека (ХГЧ) из образца мочи на поверхности пористой мембраны (см. главу «Форматы ИФА: дот-иммунонализ (иммуноблот), иммунохроматография, иммунофильтрация»). Одно из антител 
закреплено на самой мембране, оно улавливает антиген (ХГЧ), второе 
прикреплено ковалентно к синей латексной частице. При наличии гор