Химические основы биологических процессов: практикум с основами теории
Покупка
Новинка
Издательство:
ПГНИУ
Автор:
Некрасов Денис Денисович
Год издания: 2017
Кол-во страниц: 120
Дополнительно
Вид издания:
Учебное пособие
Уровень образования:
ВО - Бакалавриат
ISBN: 978-5-7944-2976-3
Артикул: 836547.01.99
Учебное пособие состоит из лабораторного практикума и избранных лекций по курсу «Химические основы биологических процессов». В практической части содержится девять лабораторных работ, каждая из которых имеет краткое теоретическое введение, описание выполнения опытов, а также вопросы для отчета и обсуждения на семинарских занятиях. В лекциях приводится наиболее сложный для усвоения материал, касающийся биосинтеза белка и передачи генетической информации. Цель - помочь студентам овладеть практическими навыками при работе с биологическими объектами и разобраться в наиболее сложных разделах курса.
Издание предназначено для студентов химического факультета, обучающихся по направлениям «Химия», «Химия, физика и механика материалов» и по специальности «Фундаментальная и прикладная химия».
Тематика:
ББК:
УДК:
ОКСО:
- ВО - Бакалавриат
- 04.03.01: Химия
- 04.03.02: Химия, физика и механика материалов
- ВО - Магистратура
- 04.04.01: Химия
- 04.04.02: Химия, физика и механика материалов
- ВО - Специалитет
- 04.05.01: Фундаментальная и прикладная химия
ГРНТИ:
Скопировать запись
Фрагмент текстового слоя документа размещен для индексирующих роботов.
Для полноценной работы с документом, пожалуйста, перейдите в
ридер.
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «ПЕРМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» Д. Д. Некрасов ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ ПРАКТИКУМ С ОСНОВАМИ ТЕОРИИ Допущено методическим советом Пермского государственного национального исследовательского университета в качестве учебного пособия для студентов, обучающихся по направлениям подготовки бакалавров «Химия», «Химия, физика и механика материалов» и специальности «Фундаментальная и прикладная химия» Пермь 2017
УДК 577.1(024) ББК 54: 56 Н48 Н48 Некрасов Д. Д. Химические основы биологических процессов: практикум с основами теории: учеб. пособие / Д. Д. Некрасов; Перм. гос. нац. исслед. ун-т. – Пермь, 2017. – 120 с. ISBN 978-5-7944-2976-3 Учебное пособие состоит из лабораторного практикума и из бранных лекций по курсу «Химические основы биологических процессов». В практической части содержится девять лабораторных работ, каждая из которых имеет краткое теоретическое введение, описание выполнения опытов, а также вопросы для отчета и обсуждения на семинарских занятиях. В лекциях приводится наиболее сложный для усвоения материал, касающийся биосинтеза белка и передачи генетической информации. Цель – помочь студентам овладеть практическими навыками при работе с биологическими объектами и разобраться в наиболее сложных разделах курса. Издание предназначено для студентов химического факульте та, обучающихся по направлениям «Химия», «Химия, физика и механика материалов» и по специальности «Фундаментальная и прикладная химия». УДК 577.1(024) ББК 54: 56 Печатается решению редакционно-издательского совета Пермского государственного национального исследовательского университета Рецензенты: кафедра экологии Пермской государственной сельскохозяйственной академии им. акад. Д. Н. Прянишникова (рец. – зав. кафедрой, доцент, канд. хим. наук Е. В. Пименова); старший научный сотрудний Института технической химии УрО РАН И. А. Толмачева ISBN 978-5-7944-2976-3 © ПГНИУ, 2017 © Некрасов Д. Д., 2017
Оглавление ПРАКТИКУМ ………………………………………………………. 5 ЗАНЯТИЕ 1. Простые белки ………………………………………… 5 Лабораторная работа 1. Хроматографическое определение аминокислот …………………………………………………….. 5 Лабораторная работа 2. Цветные реакции на белки и аминокислоты ………………………………………………… 7 Лабораторная работа 3. Реакции осаждения белка …………… 13 Лабораторная работа 4. Определение изоэлектрической точки желатины …………………………………………………. 17 ЗАНЯТИЕ 2. Продолжение темы «Простые белки» ………………. 19 Лабораторная работа 5. Биохимическое исследование мышечной ткани ………………………………………………… 19 ЗАНЯТИЕ 3. Сложные белки ……………………………………….. 22 Лабораторная работа 6. Гидролиз нуклеопротеидов дрожжей …………………………………………………………. 25 ЗАНЯТИЕ 4. Ферменты ……………………………………………… 30 Лабораторная работа 7. Свойства ферментов ………………… 30 ЗАНЯТИЕ 5. Углеводы ………………………………………………. 37 Лабораторная работа 8. Анализ яблока ……………………….. 46 ЗАНЯТИЕ 6. Липиды ………………………………………………… 54 Лабораторная работа 9. Свойства и химия липидов …………. 64 ЛЕКЦИИ ………………………………………………………….…. 71 БИОСИНТЕЗ БЕЛКА ………………………………………………… 71 РЕПЛИКАЦИЯ ………………………………………………………. 73 Репликация в эукариотических клетках ………………………. 78 ТРАНСКРИПЦИЯ ……………………………………………………. 81 Транскрипция генов ……………………………………………. 81 Транскрипция в бактериальных клетках …………………..….. 83 Биосинтез белка (трансляция) …………………………………. 90 ЭЛОНГАЦИЯ ………………………………………………………… 96
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД ……………………………………………… 101 Свойства генетического кода ………………………………….. 102 ТЕРМИНАЦИЯ ………………………………………………………. 103 ПРОЦЕССИНГ ПОЛИПЕПТИДНЫХ ЦЕПЕЙ ……………………. 106 РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА ……………………………………….. 108 Вопросы к семинарским занятиям по темам «Белки» и «Ферменты» ………………………………………………………… 115 Вопросы к экзамену ………………………………………………….. 117 Рекомендуемая литература ………………………………………….. 119
П Р А К Т И К У М ЗАНЯТИЕ 1. ПРОСТЫЕ БЕЛКИ Белки можно обнаружить с помощью двух типов реакций: цветных и осаждения. При взаимодействии белка с некоторыми реактивами образуются окрашенные продукты реакции, обусловленные наличием в молекуле белка определенной аминокислоты и пептидной химической связи. На основании цветных реакций разработаны методы количественного определения белков и аминокислот. На устойчивость белка в растворе влияет наличие заряда и гидратной оболочки. Осаждение белка бывает обратимым и необратимым. Обратимое осаждение наблюдается при действии органических растворителей или растворов солей щелочных и щелочно-земельных металлов (высаливание). При снятии факторов, вызывающих обратимое осаждение, белок переходит в нативное состояние. При денатурации белки утрачивают свою биологическую активность. Одним из важных признаков белка является его изоэлектрическая точка, т. е. такое значение рН, при котором белок находится в виде нейтральных молекул. Белки в изоэлектрической точке наименее устойчивы и легко выпадают в осадок. Лабораторная работа 1. Хроматографическое определение аминокислот Метод распределительной хроматографии на бумаге является одной из модификаций хроматографического метода, предложенного М. С. Цветом в 1903 г. С помощью этого метода осуществляется разделение и определение аминокислот в смеси. Суть метода заключается в том, что каплю смеси аминокислот или гидролизата белка наносят на полоску фильтровальной бумаги, конец которой опускают в подходящий органический растворитель. Растворитель увлекает за собой нанесенные на бумагу аминокислоты, скорость перемещения которых зависит от химического строения и их способности растворяться в растворителе. Чем меньше растворимость аминокислот в воде и больше растворимость в органическом растворителе, тем быстрее они движутся за фронтом органического растворителя. Положение аминокислот на бумаге можно обнаружить путем цветной реакции с нингидрином:
производят опрыскивание из пульверизатора высушенной полоски бумаги 0,1–0,2%-ным спиртовым раствором нингидрина. Аминокислоты обнаруживаются в виде пятен, окрашенных в голубой, фиолетовый или оранжевый цвета в зависимости от структуры аминокислоты. Скорость перемещения отдельных аминокислот может быть выражена с помощью коэффициента распределения (Rf). Коэффициентом распределения называется отношение расстоя ний от места нанесения аминокислоты до середины ее пятна (а) к расстоянию от места нанесения аминокислоты до фронта растворителя (b) Rf = a (мм) b (мм) Выполнение работы. На нижнем конце полоски хроматогра фической бумаги длиной 10 см, шириной 4,5 см на расстоянии 1 см от края отчеркивают карандашом черту и на нее наносят капилляром поочередно примерно через 0,5–0,8 мм каждую из предложенных аминокислот и задачу из смеси аминокислот. Нанесение капиляром повторяют 2–3 раза (для большей яркости пятен). Сверху подписывают карандашом названия аминокислот. Приготовленную бумажную полоску опускают в хроматографическую камеру с водонасыщенным бутанолом таким образом, чтобы она погрузилась в жидкость на 2–3 мм. Камеру плотно закрывают пришлифованным стеклом и оставляют на 30– 60 мин. За это время фронт растворителя поднимается на 10–12 см, полоску достают, высушивают и опрыскивают из пульверизатора раствором нингидрина, снова высушивают и нагревают над плиткой. В местах, где присутствуют аминокислоты, появляются синие или фиолетовые пятна, их обводят карандашом и вычисляют коэффициенты распределения аминокислот. Данный метод позволяет определять микроколичества аминокислот. Наряду с восходящей хроматографией нередко используют и радиальную хроматографию. Выполнение радиальной хроматографии. Бумажный диск диаметром 12 см (большим, чем диаметр чашки Петри) делят карандашом на 4 равные части. В центре диска делают небольшой вырез, в который помещают ножку высотой 2 см, сделанную из фильтровальной бумаги в виде трубочки. В центре карандашом чертят круг диаметром 1 см и на него в каждый сектор наносят капилляром определенную аминокислоту, подписывают карандашом, бумажный диск высушивают. На дно чашки Петри наливают примерно 10 мл водонасыщенного раствора бутанола, бумажный диск накладывают на края
чашки Петри так, чтобы ножка касалась раствора, чашку Петри накрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре на 1 ч, затем хроматограмму проявляют спиртовым раствором нингидрина и бумажный диск высушивают. Вычисляют Rf (аналогично восходящей хроматограмме). Указания к составлению отчета по работе. Студенты запи сывают принцип хроматографического метода, зарисовывают или подклеивают в тетрадь полученные хроматограммы. Линейкой измеряют расстояние от места нанесения капли раствора до середины каждого пятна и от места нанесения капли раствора до линии фронта растворителя, вычисляют коэффициент распределения для каждой аминокислоты. По хроматограмме и вычисленным Rf определяют состав аминокислот в задаче. Лабораторная работа 2. Цветные реакции на белки и аминокислоты Опыт 1. Биуретовую реакцию на пептидную связь способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей – СО-NH-. Порядок выполнения опыта. К 5 каплям раствора белка добав ляют 3 капли 10%-ного раствора едкого натра и 1 каплю 1%-ного раствора сернокислой меди, перемешивают и содержимое пробирки приобретает сине-фиолетовый цвет. Нельзя добавлять избыточное количество сернокислой меди, т. к. синий осадок гидрата окиси меди маскирует фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка. Химизм реакции: OH C NH N H C NH2 O + Cu(OH)2 + O C H2N NH C NH OH 2NaOH 2Na+ N N Cu N N NH N O O H H H O H O H - - 4H2O Кетоенольная форма биурета Комплексная соль биурета Указания к составлению отчета по цветным реакциям Наблюдения оформляются в виде таблицы с определением типа реакции (общая, групповая, специфическая).
№ п/п Название и тип реакции Используемые реактивы Наблюдаемое окрашивание Какие группировки открываются в белке 1 Биуретовая Опыт 2. Нингидриновая реакция на аминокислоты харак терна для аминогрупп, находящихся в -положении. Нагревание растворы белка, -аминокислот и пептидов с нингидрином дают синее или фиолетовое окрашивание. Порядок выполнения опыта. К 5 каплям раствора белка при ливают 5 капель 0,1%-ного водного раствора нингидрина, кипятят 1– 2 мин и появляется розово-фиолетовое или сине-фиолетовое окрашивание. С течением времени раствор синеет. Химизм реакции: O O OH OH H C NH2 + R COOH C R O H + NH3 + CO2 + H O H O O Восстановленный нингидрин O O OH OH H O H O O + NH3 + - 3H2O O O N H O O O O O O N + H Продукт конденсации Опыт 3. Ксантопротеиновая реакция открывает ароматиче ские аминокислоты: триптофан, фенилаланин, тирозин и др. Порядок выполнения опыта. К 5 каплям раствора белка добав ляют 3 капли концентрированной азотной кислоты и осторожно кипятят. Вначале появляется осадок свернувшегося белка, который при нагревании окрашивается в желтый цвет. После охлаждения в пробирку наливают по каплям 10%-ный раствор едкого натра до появления оранжевого окрашивания натриевой соли динитротирозина.
Химизм реакции. Реакция обусловлена нитрованием бензоль ного кольца аминокислот с образованием нитросоединений желтого цвета. При подщелачивании возникает хиноидная структура, окрашенная в оранжевый цвет. OH CH2 CH COOH NH2 2HNO3 - 2H2O OH CH2 CH COOH NH2 O2N NO2 O CH2 CH COOH NH2 O2N N ONa O NaOH - H2O Динитротирозин (желтого цвета) Натриевая соль динитротирозина (оранжевого цвета) Опыт 4. Реакция Милона является специфической реакцией на тирозин. Белки, не содержащие тирозина, этой реакции не дают. Порядок выполнения опыта. К 5 каплям раствора белка при ливают 3 капли реактива Миллона (состоящего из смеси азотнокислых и азотистокислых солей закиси и окиси ртути, растворенных в концентрированной азотной кислоте). Появляется осадок белка, принимающий при нагревании кирпично-красный цвет. Следует избегать прибавления избытка реактива Миллона, поскольку он содержит азотную кислоту, которая при взаимодействии с белком может дать желтое окрашивание (ксантопротеиновую реакцию), маскирующее реакцию Миллона. Химизм реакции: OH CH2 CH COOH NH2 HNO3 O CH2 CH COOH NH2 O2N N OHg O Ртутная соль динитротирозина (кирпично-красного цвета) HgNO3 - 2H2O Тирозин Опыт 5. Реакция Фоля указывает на присутствие в белке ци стеина и цистина, содержащих слабосвязанную серу. Метианин также содержит серу, но этой реакции не дает, поскольку сера связана в нем прочно.
Порядок выполнения опыта. К 5 каплям раствора белка прибав ляют 5 капель 30%-ного раствора гидроксида натрия и 1 каплю 5%-ного раствора уксуснокислого свинца, кипятят и дают постоять 1–2 мин, после чего появляется бурый или черный осадок сульфида свинца. Химизм реакции: NH2 CH2 COOH S H NaOH / H2O NH2 CH2 COOH HO Na2S Na2S PbS + NaOH 2 + + Na4 Pb (OH)6 [ ]] 6 Опыт 6. Реакция Адамкевича обусловлена наличием в белке аминокислоты триптофана. Порядок выполнения опыта. В пробирку наливают 5 капель яичного или пшеничного белка или раствора желатины, добавляют 5 капель концентрированной уксусной кислоты, слегка нагревают и затем подслаивают равным объемом концентрированной серной кислоты. На границе двух слоев появляется красно-фиолетовое кольцо, постепенно распространяющееся на всю жидкость. Химизм реакции. Триптофан, присутствующий в белке, реаги рует с глиоксиловой кислотой, присутствующей в виде примеси в концентрированной уксусной кислоте, образуя окрашенный продукт конденсации. Концентрированная серная кислота принимает участие в реакции в качестве водоотнимающего средства. Интенсивность окраски зависит от количества триптофана в белке. В яичном и соевом белке его в два раза больше, чем в пшеничном, в желатине триптофан отсутствует. При использовании вместо уксусной кислоты тростникового сахара (в этом случае реакция называется по имени Шульца-Распайля) в реакции принимает участие оксиметилфурфурол, образующийся из фруктозы. NH CH2 CH NH2 COOH + + CH O COOH NH CH2 CH NH2 COOH NH CH2 CH NH2 COOH CH COOH COOH NH2 CH CH2 NH - H2O Продукт конденсации
Опыт 7. Реакция Сакагучи обусловлена присутствием в белке аминокислоты аргинина, имеющей в своем составе гуанидиновую группировку. Порядок выполнения опыта. В пробирку помещают 5 капель яичного или пшеничного белка и добавляют 5 капель 10%-ного раствора едкого натра и 3 капли 0,1%-ного спиртового раствора нафтола и 1-5 капель 2%-ного раствора гипобромита натрия. Жидкость в пробирке окрашивается в красный цвет. Присутствие аммиака и избыток гипобромита мешают реакции Химизм реакции. В результате реакции аргинина с -нафтолом образуется продукт конденсации окисленного аргинина -нафтолом. Гипобромид играет роль окислителя. NH2 C NH CH2 CH2 CH2 CH COOH NH NH2 + 2 OH O N O Br C NH CH2 CH2 CH2 CHNH2 COOH NH 3 NaOBr - 2H2O, - 2NaBr NaOH Продукт конденсации красного цвета Аргинин -Нафтол Опыт 8. Реакция Паули обусловлена в белке аминокислот ги стидина или тирозина, которые, реагируя с диазобензосульфокислотой, образуют азакраситель красного цвета. Порядок выполнения опыта. В пробирку наливают 3 капли 1%-ной сульфаниловой кислоты, 3 капли 5%-ного раствора азотистокислого натрия и перемешивают. К полученному диазореактиву добавляют 5 капель яичного или пшеничного белка и 3–5 капель 10%ного раствора углекислого натрия. Жидкость окрашивается в красный цвет. Если реакцию производить с раствором желатины, то окраска получается меньшей интенсивности, т. к. в желатине нет тирозина и
мало гистидина. Описанная реакция может быть выполнена иным путем. К небольшому количеству приготовленного диазореактива добавляют 5 капель 10%-ного раствора соды и осторожно по стенке пробирки наслаивают раствор белка. На границе двух жидкостей появляется красное кольцо. При смешивании вся жидкость окрашивается в оранжевый или желтый цвет. Химизм реакции основан на образовании азокрасителя Азакраситель красного цвета Гистидин - 2 NaHCO3 S O O ONa N N NH N N N S O ONa O CH2 CH COOH NH2 2 Na2CO3 + 2 N N S O O O N NH CH2 CH COOH NH2 Диазобензосульфокислота Сульфаниловая кислота - NaCl, 2H2O HCl NaNO2 N N S O O O H2N S O OH O + + Реакция Паули не является строго специфичной для гистидина и тирозина, так как ее вызывают любые вещества, имеющие в своей структуре фенольное, имидазольное или тиазольное кольцо (адреналин, тиамин, гистамин и др.). Однако все они отсутствуют в белке и не мешают реакции. Опыт 9. Нитропруссидная реакция обусловлена присутствием в белке серусодержащих аминокислот, которые при кипячении со щелочью разрушаются, образуя сернистый натрий. Нитропруссид натрия [NaFe+3(CN)5 NO] при взаимодействии с сернистым натрием превращается в соединение, окрашенное в красный цвет. Порядок выполнения опыта. В пробирку помещают 5 капель раствора яичного или пшеничного, или соевого белка, 5 капель 10– 30%-ного раствора щелочи и кипятят несколько минут. После охлаждения добавляют 1–3 капли нитропруссида натрия. В пробе с яичным или пшеничным белком получается красное окрашивание, исче