Практикум по физиологии и биохимии растений

В. В. Рогожин, Т. В. Рогожина

ПРАКТИКУМ ПО ФИЗИОЛОГИИ
И БИОХИМИИ РАСТЕНИЙ

Рекомендовано УМО РАЕ по классическому университетскому и техническому образованию в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлениям подготовки: 
022000 — «Экология и природопользование», 110100 — «Агрохимия 
и агропочвоведение», 110400 — «Агрономия», 110500 — «Садоводство», 110800 — «Агроинженерия», 110900 — «Технология производства 
и переработки сельскохозяйственной продукции», 250100 — «Лесное 
дело», 250400 — «Технология лесозаготовительных и деревоперерабатывающих производств», 250700 — «Ландшафтная архитектура», 
260100 — «Продукты питания из растительного сырья»

Санкт-Петербург
ГИОРД
2013

УДК 581.1:612.8.015.32:577.11
ББК 41.2я73
 
Р598

Рогожин В. В.
Р598  
Практикум по физиологии и биохимии растений : учеб. пособие / 
В. В. Рогожин, Т. В. Рогожина. — СПб. : ГИОРД, 2013. — 352 с.

ISBN 978-5-98879-151-5

В учебном пособии рассматриваются основные физиологические и биохимические методы (в том числе: изучение физиологии растительной клетки, водный 
обмен, дыхание, фотосинтез, элементы растений, рост и развитие, приспособленность и устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды), используемые 
при подготовке и исследовании образцов растительных тканей, а также способы 
расчета содержания в них биологически активных веществ.
Практикум предназначен для студентов биологических, технических и сельскохозяйственных вузов, а также может быть полезен научным работникам.

УДК 581.1:612.8.015.32:577.11
ББК 41.2я73

ISBN 978-5-98879-151-5 
© «Издательство „ГИОРД“», 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

ВВЕДЕНИЕ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

Глава 1. ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА  . . . . . . . 17

1.1. Правила техники безопасности при проведении
исследований в физиолого-биохимической лаборатории  . . . . . . . . . . 18

1.2. Подготовка образцов для физиолого-биохимических. . . . . . . . . . . . 
исследований  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

1.3. Методы расчета экспериментальных данных  . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

1.4. Порядок записи лабораторной работы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

Глава 2. ФИЗИОЛОГИЯ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

2.1. Выделение субклеточных фракций из колеоптилей
пшеницы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.2. Выделение микросомальной фракции в ступенчатом
градиенте плотности сахарозы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.3. Способ выделения ядер из клеток эвглены  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.4. Плазмолиз клеток растений  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.5. Влияние ионов калия и кальция на вязкость цитоплазмы  . . . . . . 46

2.6. Накопление метиленового синего в клетках элодеи  . . . . . . . . . . . 46

2.7. Определение сосущей силы клеток. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

2.8. Определение целлюлозы в растительной ткани
(по Кюршнеру и Ганеку). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

2.9. Определение крахмала в тканях растений  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

2.10. Выделение крахмала из зерновок злаковых культур. . . . . . . . . . . 52

2.11. Выделение крахмала из клубней картофеля. . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

Глава 3. БИОГЕННЫЕ МОЛЕКУЛЫ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

3.1. Определение глюкозы в биологических жидкостях
о-толуидиновым методом. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

3.2. Определение содержания общих липидов в растительных
тканях. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.3. Определение этанола в биологическом материале. . . . . . . . . . . . . 63

Оглавление

3.4. Определение содержания пировиноградной кислоты. . . . . . . . . . 64

3.5. Определение содержания аскорбиновой кислоты  . . . . . . . . . . . . . 66

3.6. Определение АТФ и глюкозо-6-фосфата в растительных
тканях. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

3.7. Определение АТФ с помощью люциферазы
(по Угаровой и Бровко). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

3.8. Определение содержания НАДФ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

3.9. Определение содержания НАД  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

3.10. Определение глутатиона в растительных тканях. . . . . . . . . . . . . . 74

Глава 4. ЭЛЕМЕНТЫ РАСТЕНИЙ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

4.1. Отбор растительного материала для анализа
на микроэлементы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

4.2. Определение зольности зерновок злаковых культур  . . . . . . . . . . . 80

4.3. Озоление растительного материала. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

4.4. Определение фосфора ванадо-молибдатным методом  . . . . . . . . . 83

4.5. Определение марганца в растительных тканях
формальдоксидным методом. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

4.6. Определение калия и натрия на пламенном фотометре  . . . . . . . . 86

4.7. Определение железа роданидным методом  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

4.8. Определение железа с помощью 4,7-дифенил-1,10фенантролин-3,6-дисульфоновой кислоты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

4.9. Определение меди в гомогенатах растительных тканей  . . . . . . . . 91

Глава 5. ФЕРМЕНТЫ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

5.1. Методы осаждения белков (ферментов) сульфатом аммония  . . . 96

5.2. Осаждение белков (ферментов) с помощью органических
растворителей. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

5.3. Методы осаждения белков (ферментов) ацетоном. . . . . . . . . . . . . 99

5.4. Диализ белков (ферментов)  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

5.5. Метод гель-фильтрации раствора пероксидазы
и 2,4-динитрофенола  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

5.6. Метод очистки пероксидазы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

5.7. Определение концентрации пероксидазы
спектрофотометрически. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

5.8. Определение величин каталитических констант (Vm, Km, kcat)
в реакции пероксидазного окисления о-дианизидина  . . . . . . . . . . . . 107

5.9. Определение активности пероксидазы по о-дианизидину  . . . . . 112

Оглавление

5.10. Определение активности пероксидазы по ферроцианиду
калия  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

5.11. Влияние концентрации пероксидазы на скорость
ферментативной реакции. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116

5.12. Получение очищенного препарата алкогольдегидрогеназы
из зерновок пшеницы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

5.13. Определение концентрации алкогольдегидрогеназы методом
титрования активного центра. Выявление функционально
важных SH-групп фермента  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

5.14. Определение активности алкогольдегидрогеназы в реакции
окисления этанола по НАДН  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

5.15. Определение активности алкогольдегидрогеназы в реакции
окисления этанола по иоднитротетразолиевому фиолетовому. . . . . 123

5.16. Определение активности алкогольдегидрогеназы в реакции
восстановления ацетальдегида  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126

5.17. Определение активности альдегиддегидрогеназы  . . . . . . . . . . . 127

5.18. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
по НАДФН  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

5.19. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
по иоднитротетразолиевому фиолетовому  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

5.20. Определение активности 6-фосфоглюконатдегидрогеназы . . . 132

5.21. Определение активности глицерол-3-фосфатдегидрогеназы. . . 134

5.22. Определение активности триозофосфатизомеразы  . . . . . . . . . . 136

5.23. Определение активности глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137

5.24. Определение активности гексокиназы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

5.25. Определение активности лактатдегидрогеназы  . . . . . . . . . . . . . 140

5.26. Определение активности аминотрансфераз  . . . . . . . . . . . . . . . . 142

5.27. Определение активности щелочной фосфатазы. . . . . . . . . . . . . 145

5.28. Определение числа доступных карбоксильных
групп в ферментах с помощью о-дианизидина
и водорастворимого карбодиимида  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147

5.29. Влияние рН среды на активность пероксидазы  . . . . . . . . . . . . . 149

5.30. Кислотная инактивация ферментов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150

5.31. Изучение температурной денатурации ферментов. . . . . . . . . . . 151

Глава 6. АЗОТНЫЙ ОБМЕН  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153

6.1. Определение общего азота в растительных тканях
(по А. Т. Усовичу)  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156

Оглавление

6.2. Определение нитритов в растительных тканях . . . . . . . . . . . . . . . 158

6.3. Определение нитратов в растительных тканях  . . . . . . . . . . . . . . . 160

6.4. Определение содержания мочевины по реакции
с диацетилмонооксимом  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162

6.5. Определение мочевой кислоты по методу 
Мюллера-Зейферта . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164

6.6. Определение содержания креатинина по цветной
реакции Яффе. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165

6.7. Определение креатина. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

6.8. Определение аминокислот с помощью нингидрина  . . . . . . . . . . 167

6.9. Определение содержания глутаминовой кислоты  . . . . . . . . . . . . 169

6.10. Определение общего белка по биуретовой реакции. . . . . . . . . . 171

6.11. Метод определения белка по Лоури  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174

6.12. Метод определения белка по Брэдфорду  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176

6.13. Изучение кислотной денатурации белков  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178

6.14. Изучение температурной денатурации белков  . . . . . . . . . . . . . . 179

6.15. Метод выделения ДНК  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180

6.16. Метод определения содержания ДНК с помощью
дифениламина  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181

6.17. Гидролиз ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182

6.18. Определение содержания пуриновых оснований . . . . . . . . . . . . 182

Глава 7. ВОДНЫЙ ОБМЕН РАСТЕНИЙ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 183

7.1. Содержание влаги в семенах. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185

7.2. Определение содержания воды и сухого вещества
в растительном материале  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186

7.3. Изучение скорости набухания зерновок пшеницы  . . . . . . . . . . . 187

7.4. Определение скорости набухания семян  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188

7.5. Наблюдение за движениями устьиц  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 189

Глава 8. ДЫХАНИЕ РАСТЕНИЙ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191

8.1. Способ выделения митохондрий из растительных тканей  . . . . . 195

8.2. Выделение митохондрий из мезокотилей этиолированных
проростков кукурузы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

8.3. Определение активности ферментов перуватдегидрогеназного
комплекса  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198

8.4. Определение активности ферментов перуватдегидрогеназного
комплекса с помощью ИНТФ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 200

Оглавление

8.5. Определение активности ферментов
кетоглутаратдегидрогеназного комплекса. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201

8.6. Определение активности глутаматдегидрогеназы  . . . . . . . . . . . . 203

8.7. Определение активности цитохромоксидазы  . . . . . . . . . . . . . . . . 205

8.8. Определение активности сукцинатдегидрогеназы . . . . . . . . . . . . 207

8.9. Определение активности НАД-зависимой
малатдегидрогеназы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208

8.10. Определение активности НАДФ-зависимой
малатдегидрогеназы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210

8.11. Определение активности аскорбатоксидазы . . . . . . . . . . . . . . . . 212

8.12. Определение активности полифенолоксидазы. . . . . . . . . . . . . . 213

8.13. Определение активности НАДФ-зависимой
изоцитратдегидрогеназы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 214

8.14. Определение активности каталазы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216

8.15. Определение активности пероксидазы в зерновках,
корнях и надземной части проростков пшеницы  . . . . . . . . . . . . . . . . 217

8.16. Ингибирование дыхания зерновок пшеницы
с помощью 2,4-динитрофенола. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 219

8.17. Исследование перекисного окисления липидов (ПОЛ) . . . . 221

8.18. Определение содержания флавоноидов в биологическом
материале  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222

8.19. Определение общей антиокислительной активности  . . . . . . . . 224

8.20. Определение содержания водорастворимых
антиоксидантов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226

8.21. Определение общего содержания антиоксидантов  . . . . . . . . . . 228

8.22. Определение содержания антиоксидантов в гомогенатах
тканей (по Глевинду). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231

8.23. Определение стероидных (сердечных) гликозидов  . . . . . . . . . . 233

8.24. Влияние низких концентраций аскорбиновой кислоты
на прорастание зерновок пшеницы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 236

Глава 9. ФОТОСИНТЕЗ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238

9.1. Выделение хлоропластов из листьев С3-растений  . . . . . . . . . . . . 240

9.2. Выделение хлоропластов из листьев С4-растений  . . . . . . . . . . . . 241

9.3. Выделение протопластов из листьев С4-растений  . . . . . . . . . . . . 242

9.4. Получение вытяжки пигментов из побегов пшеницы . . . . . . . . . 243

9.5. Разделение пигментов (по Краусу)  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244

9.6. Количественное определение хлорофиллов и каротиноидов . . . . 245

Оглавление

9.7. Омыление хлорофиллов щелочью   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 247

9.8. Разделение пигментов методом бумажной хроматографии  . . . . 247

9.9. Роль света в процессах синтеза хлорофиллов  . . . . . . . . . . . . . . . . 249

9.10. Определение площади листьев методом отпечатков  . . . . . . . . . 252

Глава 10. ПОКОЙ, РОСТ И РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 253

10.1. Прерывание покоя клубней картофеля при помощи
биологически активных веществ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255

10.2. Определение жизнеспособности семян гороха методом
окрашивания индигокармином  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 256

10.3. Определение жизнеспособности зерновок пшеницы
методом окрашивания цитоплазмы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 258

10.4. Определение жизнеспособности зерновок пшеницы
тетразольным методом  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 259

10.5. Определение активности α-амилазы в зерновках пшеницы. . . 260

10.6. Активность пероксидазы в различных частях зерновок
пшеницы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262

10.7. Изучение процесса набухания зерновок пшеницы  . . . . . . . . . . 264

10.8. Изучение процесса проклевывания зерновок пшеницы. . . . . . 265

10.9. Определение основных физиологических показателей
проростков пшеницы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266

10.10. Рост и развитие побегов проростков пшеницы. . . . . . . . . . . . . 268

10.11. Влияние света на прорастание проростков пшеницы . . . . . . . 269

10.12. Определение активности пероксидазы в корнях и побегах
проростков пшеницы на начальных этапах прорастания. . . . . . . . . . 271

10.13. Хемотропизм корней проростков пшеницы  . . . . . . . . . . . . . . . 273

10.14. Рост и развитие различных частей проростков пшеницы . . . . 274

10.15. Значение листьев для укоренения черенков  . . . . . . . . . . . . . . . 276

10.16. Влияние индолил-3-уксусной кислоты на укоренение
черенков фасоли  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 276

Глава 11. ПРИСПОСОБЛЕНИЕ И УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ  . . . . . . . 279

11.1. Изучение термостабильности очищенного препарата
пероксидазы хрена. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281

11.2. Влияние температуры на активность пероксидазы
зерновок пшеницы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 282

11.3. Влияние альбумина и хлорида кальция на стабильность
пероксидазы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284