Книжная полка Сохранить
Размер шрифта:
А
А
А
|  Шрифт:
Arial
Times
|  Интервал:
Стандартный
Средний
Большой
|  Цвет сайта:
Ц
Ц
Ц
Ц
Ц

Руководство к научно-исследовательской практике: Раздел «Эндокринология»

Покупка
Новинка
Артикул: 823099.01.99
Доступ онлайн
439 ₽
В корзину
Данное руководство содержит практические задачи, позволяющие освоить основные подходы и методы современной эндокринологии. После каждой темы можно найти контрольные вопросы для проверки пройденного материала. Практикум ориентирован на студентов, обучающихся по программе магистратуры биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова по на-правлению подготовки «Биология», профиль «Физиология», а также на научных сотрудников, преподавателей, магистров естественных факультетов университетов и медицинских вузов.
Руководство к научно-исследовательской практике: Раздел «Эндокринология» : практикум / О. В. Смирнова, Т. А. Щелкунова, Т. А. Балакина [и др.]. – Москва : КМК, 2022. - 128 с. – ISBN 978-5-907533-08-0. - Текст : электронный. - URL: https://znanium.ru/catalog/product/2134169 (дата обращения: 25.05.2024). – Режим доступа: по подписке.
Фрагмент текстового слоя документа размещен для индексирующих роботов. Для полноценной работы с документом, пожалуйста, перейдите в ридер.
Московский государственный университет 
имени М.В. Ломоносова 
Биологический факультет МГУ 

О.В. Смирнова, Т.А. Щелкунова, Т.А. Балакина, 
Н.С. Сиротина, А.И. Гончаров

РУКОВОДСТВО 
К НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ ПРАКТИКЕ: 
РАЗДЕЛ «ЭНДОКРИНОЛОГИЯ»

Товарищество научных изданий КМК
Москва 2022
УДК [611.43+612.43](075.8)
ББК 28.707.37я73-1
 
Р85

Смирнова О.В., Щелкунова Т.А., Балакина Т.А., Сиротина Н.С., Гончаров 
А.И.
Руководство к научно-исследовательской практике: Раздел «Эндокринология». — 
Москва: Товарищество научных изданий КМК, 2022. — 127 с.
Данное руководство содержит практические задачи, позволяющие освоить 
основные подходы и методы современной эндокринологии. После каждой 
темы можно найти контрольные вопросы для проверки пройденного материала. 
Практикум ориентирован на студентов, обучающихся по программе 
магистратуры биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова по направлению 
подготовки «Биология», профиль «Физиология», а также на научных 
сотрудников, преподавателей, магистров естественных факультетов 
университетов и медицинских вузов.

Рецензенты: 
Буравкова Л.Б. — чл.-корр. РАН, проф., д. мед. н., Института медико-биологических 
проблем РАН
Каменский А.А. — д. биол. н., проф., зав. кафедрой физиологии человека и 
животных биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

© Коллектив авторов, текст, иллюстрации, 2022
© Товарищество научных изданий КМК, издание, 2022
ISBN 978-5-907533-08-0

Р85
СОДЕРЖАНИЕ

Предисловие  .........................................................................................................5

Общие требования к проведению научно-исследовательской практики 
по эндокринологии  ..................................................................................7

Тема I. Морфофизиологическая характеристика желез внутренней 
секреции  ................................................................................................9
Задача «Топография и анатомическая характеристика желез внутренней 
секреции»  ..........................................................................................9
Задача «Гистологическое строение желез внутренней секреции»  .........12
Задача «Гипофизэктомия крысы и ее последствия»  ................................31
А. Методика трансаурикулярного удаления гипофиза у крысы  ...........................................................................................................
32
Б. Изучение последствий гипофизэктомии самок крыс  ..................33
Задача «Адреналэктомия крысы»  ..............................................................34
Задача «Роль гонад в регуляции вторичных половых признаков»  .........35
А. Определение фаз полового цикла у самок крыс по влагалищному 
мазку  .....................................................................................35
Б. Гонадэктомия самки крысы (овариэктомия)  .................................36
В. Гонадэктомия самца крысы (кастрация)  .......................................37
Г. Изменения массы репродуктивных органов самок и самцов 
крыс после гонадэктомии  ............................................................37
Контрольные вопросы по Теме I  ...............................................................38

Тема II. Методы иммуногистохимии (ИГХ) и полимеразной цепной 
реакции (ПЦР) для изучения зависимых от пола показателей  ............................................................................................................
39
Задача «Исследование половой дифференцировки экспрессии 
эстрогенсульфотрансферазы в печени крыс методом ИГХ»  ..................39
Задача «Выявление половых различий в экспрессии мРНК эстро-
генсульфотрансферазы в печени крыс методом ПЦР»  ...........................51
Контрольные вопросы по Теме II  ..............................................................58

Тема III. Биохимические методы определения стероидных гормонов 
в биологических жидостях  ...............................................................61
Задача «Определение суммарных 17-оксикортикостероидов в 
моче»  ............................................................................................................62
Задача «Определение суммарных 17-кетостероидов в моче»  ................67
Задача «Разделение 17-кетостероидов и 17-оксистероидов на 
фракции с помощью тонкослойной хроматографии»  .............................71
А. «Определение 17-кетостероидов в моче по фракциям»  ..............73
Б. «Определение 17-оксикортикостероидов в моче по фракциям»  .....................................................................................................
74
Руководство к научно-исследовательской практике: Раздел «Эндокринология»

Задача «Флюорометрический метод определения кортикостероидов 
в плазме крови»  ....................................................................................76
Задача «Количественное определение кортизола в сыворотке крови 
морских свинок методом одностадийного конкурентного иммуноферментного 
анализа»  .......................................................................79
Задача «Определение содержания эстрадиола в плазме крови радиоиммунологическим 
методом»  .............................................................85
Контрольные вопросы по Теме III .............................................................88
Тема IV. Белки, специфически связывающие гормоны, и сатура-
ционный анализ гормонов  ......................................................................90
Задача «Изучение основных гормонсвязывающих характеристик 
специфических транспортных белков плазмы крови»  ............................97
А. Характеристика стероидсвязывающи х свойств α-фетопро-
теина крысы с использованием 3H-эстрадиола  .................................99
Б. Характеристика стероидсвязывающих свойств сексстеро-
идсвязывающего белка человека с использованием 3H-ди-
гидротестостерона  ...............................................................................99
В. Характеристика стероидсвязывающих свойств секс-
стероидсвязывающего белка человека с использованием 
3H-эстрадиола  .......................................................................................99
Г. Характеристика стероидсвязывающих свойств транскорти-
на крысы с использованием 3H-прогестерона  ...................................99
Задача «Определение кортикостерона в сыворотке крови крыс 
методом сатурационного анализа с использованием транскортина 
(безэкстракционый вариант метода)»  .....................................................106
Контрольные вопросы по Теме IV  ..........................................................108
Тема V. Методы изучения гормона роста (Распределение гормона 
в организме, содержание его в биологических жидкостях и липо-
литическое действие) ................................................................................110
Задача «Йодирование гормона роста и изучение его распределения 
в различных органах крысы»  ............................................................110
Задача «Радиоиммунологическое определение гормона роста»  ..........114
Задача «Действие гормона роста на липолиз у крыс» ...........................118
Контрольные вопросы по Теме V  ............................................................121
Тема VI. Изучение действия инсулина и адреналина на содержание 
глюкозы в крови у крыс  .................................................................122
Задача «Изучение действия инсулина и адреналина на содержание 
глюкозы в крови у крыс»  ...................................................................122
Контрольные вопросы по Теме VI  ..........................................................125 
Список используемой литературы  .................................................................126
ПРЕДИСЛОВИЕ

Все больше исследователей-физиологов используют в своей научно-
экспериментальной работе методы, относящиеся к экспериментальной 
эндокринологии. 
Для оценки функционального состояния эндокринной системы 
используют клинические и инструментальные методы диагностики, 
различные диагностические пробы и тесты, а также методы лабораторной 
диагностики. 
Широкий спектр методов позволяет исследовать физиологические 
функции компонентов эндокринной системы и регуляцию метаболизма 
гормонов на всех стадиях фило- и онтогенеза человека и 
экспериментальных животных, с учетом половых различий и динамики 
возрастного становления и угасания функций желез внутренней 
секреции, а также особенностей их функционирования при беременности.

Ниже приведены некоторые рекомендации, которые необходимо 
учитывать при планировании экспериментов с использованием методов 
лабораторной диагностики в эндокринологии: 
• учитывать видоспецифичность большинства белково-пептидных 
гормонов (например, АКТГ, пролактина и т.д.); 
• концентрацию гормона можно исследовать не только в крови, но 
и в слюне, кале, различных компартментах;
• биоматериал для определения концентрации гормонов следует 
собирать у испытуемых натощак, также следует учитывать циркади-
анные ритмы и сезонную динамику секреции гормонов;
• при взятии биоматериала необходимо минимизировать влияние 
стресса и наркоза на исследуемый объект;
• собранный для исследования биоматериал рекомендуется сразу 
замораживать и хранить в аликвотированном виде, избегая повторных 
замораживаний. 
В книге «Руководство к научно-исследовательской практике: раздел «
Эндокринология»» представлены темы и задачи, позволяющие 
освоить основные подходы и методы современной эндокринологии. 
В задачах Темы I, посвященной морфофизиологической характеристике 
желез внутренней секреции, студенты знакомятся с топографией, 
анатомией и гистологией желез, учатся проведению операций 
по удалению ряда эндокринных желез, а также изучают роль гонад 
в становлении вторичных половых признаков на органном уровне. 
Руководство к научно-исследовательской практике: Раздел «Эндокринология»

Методы иммуногистохимии и полимеразной цепной реакции для 
изучения зависимых от пола показателей представлены в Теме II. 
В задачах Темы III студентов знакомят с биохимическими методами 
определения стероидных гормонов в биологических жидкостях, 
включающими экстракцию стероидов из биологических жидкостей, 
очистку экстрактов и последующее количественное определение, а 
также разделение групп стероидов на фракции с помощью тонкослойной 
хроматографии. Использование метода одностадийного конкурентного 
иммуноферментного анализа описано для определения 
концентрации кортизола в крови. В задачах Темы IV представлено 
ознакомление с сатурационным анализом связывания гормонов с 
применением радиолигандного метода исследования. Студенты учатся 
определять гормонсвязывающие характеристики белков и их применение 
для количественного определения активного транспортного 
белка в крови, рецептора в ткани-мишени, а также концентрации 
гормона в крови. Тема V специально посвящена методам изучения 
гормона роста, включая его йодирование, распределение в различных 
органах, радиоиммунологическое определение и влияние этого 
гормона на липолиз. Тема VI знакомит студентов с действием инсулина 
и адреналина на содержание глюкозы в крови, определяемой 
различными методами.
Целевой аудиторией данного издания являются студенты, обучающиеся 
по программе магистратуры, биологического факультета 
МГУ им. М.В. Ломоносова по направлению подготовки «Биология», 
профиль «Физиология». Данное пособие может быть использовано 
студентами и преподавателями биологических и медицинских или 
смежных специальностей других факультетов МГУ, а также других 
вузов, а также научными сотрудниками в области экспериментальной 
эндокринологии. 
ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ К ПРОВЕДЕНИЮ 
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ ПРАКТИКИ 
ПО ЭНДОКРИНОЛОГИИ 

Уважаемые читатели! Освоение экспериментальной эндокринологии 
предполагает работу в лаборатории, которая неизбежно связана с 
возможным воздействием на организм вредных и (или) опасных производственных 
факторов (формалин, хлороформ и т.п.), обязательно 
наличие тяги. Просьба соблюдать правила работы в гистологических 
и биохимических лабораториях с целью снижения воздействия вредных 
и (или) опасных производственных факторов. Также студенты 
знакомятся с радиоиндикаторным методом в биологии и получают 
перед началом задач инструктаж о безопасности работы с низкоактивными 
источниками радиации.
Важно работать в средствах индивидуальной защиты (халат, перчатки, 
при необходимости — ношение маски), во время выполнения 
задач недопустим прием пищи.
В связи с этим перед началом выполнения практикума студенты 
должны пройти полный инструктаж по охране труда работы в биохимических 
лабораториях и работы с животными, пожаробезопасности, 
технике безопасности работы с низкоактивными источниками 
радиации в биологических лабораториях и расписаться в контрольных 
листах у преподавателя, ответственного за проведение практикума. 

Для оказания первой помощи в лаборатории обязательно должна 
быть аптечка. 
В задачах для проведения практикума по эндокринологии используются 
различные приборы и оборудование, реактивы и объекты исследования. 
В начале каждой задачи дается подробное их описание. 
Поэтому студентам нужно заранее ознакомиться с содержанием экспериментальных 
задач и знать их методические особенности (животные 
натощак, сухая лабораторная посуда и т.п.). 
Ткани для исследования в данном практикуме используются от 
различных объектов — крыс, морских свинок, кроме того используется 
моча, сыворотка или плазма крови человека. Соблюдение правил 
гуманного обращения с животными является обязательным условием 
проведения задач по экспериментальной эндокринологии. 
Перед проведением учебной работы с тканями животных или мочой 
и кровью человека необходимо согласовать заявку в комиссии по 
Руководство к научно-исследовательской практике: Раздел «Эндокринология»

биоэтике, придерживаясь основных положений Европейской Конвенции № 
123 о защите позвоночных животных (использовать минимальное 
число животных, предпринимать различные меры для 
облегчения боли и страданий животных и другие). С необходимыми 
нормативными документами для работы с лабораторными животными 
можно ознакомиться на сайте комиссии по биоэтике той организации, 
где будут проводиться эксперименты. Важно соблюдать 
правила содержания экспериментальных животных, манипуляции 
проводить на наркотизированных животных (тип любого разрешенного 
наркоза для проведения задач данного практикума, способы его 
введения не имеют принципиального значения, его действие должно 
длиться в среднем не более 1,5 ч) и умерщвление животных проводить 
гуманным методом (согласно Правилам проведения эвтаназии). 
В некоторых задачах практикума используется кровь и моча человека. 
Предварительно необходимо заполнить бланк информированного 
согласия, подписанный исследователем и испытуемым перед началом 
эксперимента. Ретроплацентарную кровь (циркулирует в лакунах 
децидуальной оболочки) собирают также с согласия пациенток 
(сбор биоматериала возможен при наличии договоренностей и совместных 
работ с соответствующими клиническими центрами), заморозив 
ее до начала проведения практикума.
После освоения каждой темы и выполнения заданий к каждой 
задаче студенту задаются контрольные вопросы по теме. Студентов 
знакомят не только с различными экспериментальными методами, но 
 и учат умению правильно представить свои результаты по задачам 
и применить теоретические знания для объяснения полученных результатов.

Тема I. МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ 
ХАРАКТЕРИСТИКА ЖЕЛЕЗ ВНУТРЕННЕЙ 
СЕКРЕЦИИ 

В данном разделе будут рассмотрены как основные «классические» 
эндокринные железы, так и железы смешанной секреции. 
Важно помнить, что эндокринные железы в процессе эволюции часто 
формировались как объединение клеток различного эмбрионального 
происхождения. В каждой железе присутствуют клетки разных 
типов, секретирующие разные гормоны. При этом гормон может се-
кретироваться и множеством других клеток организма. Системные 
и паракринные эффекты гормона могут существенно различаться 
(Смирнова, 2018).

Задача
«Топография и анатомическая характеристика 
желез внутренней секреции» 
(Вскрытие самца и самки крысы)

Все действия выполняются с соблюдением норм биоэтики в эксперименте 
над лабораторными животными.
Оборудование: ванночка, залитая воском, ножницы большие и 
глазные, 2 пинцета, иглы препаровальные.
Ход работы После эвтаназии производится вскрытие крысы для 
изучения топографии и анатомической характеристики желез внутренней 
секреции. 
ГИПОФИЗ. Для открытия доступа к гипофизу крысы необходимо 
провести вскрытие черепной коробки. Аккуратно удаляя головной 
мозг, гипофиз достают лопаточкой из fossa hypophysialis 
турецкого седла. Небольшое уплощенно-овальное образование располагается 
у основания черепа. Гипофиз — непарная железа. Гипофиз 
самок крыс крупнее, чем у самцов, его размерные/весовые показатели 
зависят от репродуктивного статуса животного. 
Гипофиз состоит из передней доли (аденогипофиз), промежуточной 
доли и задней доли (нейрогипофиз). Аденогипофиз и нейрогипофиз 
имеют различное эмбриональное происхождение — из эктодермы 
глотки и нейроэктодермы нервной трубки, соответственно. 
Гипофиз соединяется с гипоталамусом ножкой или стеблем. Гипофиз 
обильно снабжается кровью. Особенностью кровоснабжения 
Руководство к научно-исследовательской практике: Раздел «Эндокринология»

передней доли гипофиза является портальная (воротная) система 
сосудов. В гипоталамусе синтезируются вазопрессин и окситоцин, 
которые затем поступают по аксонам в заднюю долю гипофиза. 
Основные гормоны аденогипофиза: гонадотропные (фолликуло-
стимулирующий и лютеинизирующий гормоны), тиреотропный, 
адренокортикотропный, соматотропный, пролактин. В средней, промежуточной 
доле гипофиза образуются меланоцитстимулирующие 
гормоны. 
ЩИТОВИДНАЯ ЖЕЛЕЗА. Разрезав кожу на шее крысы, обнаруживают 
крупные слюнные железы и расположенные ближе к голове 
лимфатические узлы. Раздвинув их, находят вентральные мышцы 
шеи. Осторожно разделяют по срединной линии грудинно-подъязычны 
е мышцы и обнаруживают под ними трахею. Щитовидная железа 
крысы состоит из двух долей, расположенных по бокам трахеи под 
щитовидным хрящом на уровне 4–5-го колец трахеи. Доли соединены 
между собой тонким перешейком. Средний вес щитовидной железы 
крысы — 15–20 мг.
Хотелось бы отметить, что щитовидная железа или ее аналоги 
в виде скопления отдельных клеток есть у всех позвоночных с различными 
вариациями расположения, наличия/отсутствия перешейка 
между долями и несколько модифицированными функциями, оказываемыми 
железой на организм в целом. В качестве примера: у лягушек 
щитовидная железа — парный орган, принимает участие в регуляции 
метаморфоза. 
В составе щитовидной железы клетки различного происхождения — 
основные фолликулярные клетки, продуцирующие тирео-
идные гормоны, энтодермального происхождения, а небольшое количество 
С-клеток, продуцирующих кальцитонин, — из нервного 
гребня. 
ОКОЛОЩИТОВИДНЫЕ 
(ПАРАЩИТОВИДНЫЕ) 
ЖЕЛЕЗЫ. 
Число и расположение околощитовидных желез неодинаково 
у разных позвоночных. Крысы, как правило, имеют только одну 
пару желез, которые расположены под капсулой щитовидной железы 
в толще последней. Паращитовидные железы имеют вид светлых 
округлых небольших образований на фоне красной ткани щитовидной 
железы.
Околощитовидные железы впервые появились у земноводных, 
что связано с выходом на сушу. У наземных позвоночных — развиваются 
как самостоятельные железы и продуцируют паратгормон.
Далее вскрывают полость тела крысы.
Тема I. Морфофизиологическая характеристика желез внутренней секреции 

НАДПОЧЕЧНИКИ. Парный орган. Надпочечники располагаются 
близ верхнего полюса почек в жировой капсуле и представляют 
собой плотные образования округлой формы. Надпочечники состоят 
из двух эндокринных структур: коры надпочечников, которая состоит 
из так называемой интерренальной ткани, образующейся из мезодермы 
и вырабатывающей стероидные гормоны, и мозгового слоя, 
который состоит из хромаффинной ткани, образуется из общего эк-
тодермального зачатка с пограничными симпатическими стволами и 
вырабатывает катехоламины и некоторые другие гормоны. Корковый 
и мозговой слои хорошо различимы визуально при разрезе надпочечника. 
Средний вес надпочечника крысы — 40–50 мг. Площадь коркового 
и мозгового слоя надпочечников у самок крыс больше, чем у 
самцов. Разница в размерах коркового слоя связана с более высокой 
продукцией кортикостерона у самок.
Надпочечники в ходе эволюции сформировались из двух независимых 
групп клеток, имевших разное происхождение и функции. 
При объединении интерренальная ткань окружает хромаффинную у 
хвостатых амфибий, змей, птиц и млекопитающих.
ПОДЖЕЛУДОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА. Железа смешанной секреции. 
Сложно-трубчатое непарное образование плоской формы, красновато-
серого цвета у крыс. Лежит позади желудка, под двенадцати-
перстной кишкой. Поджелудочная железа очень рыхлая и состоит из 
множества отдельных долек. Выводные протоки экзокринной части 
железы крысы впадают в общий желчный проток и уже вместе с ним 
в двенадцатиперстную кишку. Все элементы железы — эндокринная 
и экзокринная части, сосуды и протоки густо оплетены нервами, в 
самой ткани железы имеются скопления нервных ганглиев. В поджелудочной 
железе различают: головку (дуоденальная часть), тело и 
хвост (селезеночная часть). Эндокринная часть представлена островками 
Лангерганса разного размера, которые расположены у крысы в 
основном в селезеночной части. В островках Лангерганса различают 
несколько типов клеток, секретирующих различные гормоны (инсулин, 
глюкагон и другие).
ПОЛОВОЙ АППАРАТ САМЦА КРЫСЫ состоит из семенников, 
расположенных у взрослого самца в мошонке, и добавочных 
(акцессорных) половых желез, основные из которых — простата и 
семенные пузырьки. Опознавательным местом при вскрытии может 
служить мочевой пузырь: выше него расположены семенные пузырьки, 
которые имеют вид двух крупных вытянутых образований, заполненных 
густым секретом. Под мочевым пузырем и несколько ниже 
Руководство к научно-исследовательской практике: Раздел «Эндокринология»

расположена предстательная железа (простата), состоящая из вентральных 
и дорзальных долей. Кроме того, к добавочным половым 
железам относятся бульбоуретральные (куперовы) железы, расположенные 
у основания полового члена, и препуциальные железы, маленькие 
образования, прилегающие к головке полового члена. Чтобы 
одновременно видеть все части половой системы, можно, нажимая 
на мошонку, переместить в брюшную полость семенники с их придатками (
эпидидимисом). От семенников к месту соединения семенных 
пузырьков и простаты подходят семявыносящие протоки. Яички — 
парная железа смешанной секреции. Семенники продуцируют 
гормоны, важные для репродуктивной функции (андрогены, эстрогены, 
ингибин, активин, антимюллеров гормон и другие). Средний вес 
семенников крысы — 2,5–3 г. 
ПОЛОВОЙ АППАРАТ САМКИ КРЫСЫ. Яичники расположены 
у нижнего полюса почки. Эти небольшие округлые образования 
с бугристой поверхностью из-за выпячивания крупных желтых 
тел являются железами смешанной секреции. Яичники продуцируют 
как стероидные гормоны (эстрогены, андрогены, прогестерон) , так и 
белково-пептидные (ингибин, активин и другие). Яичники позвоночных — 
чаще парный орган (исключением являются птицы, у которых 
один яичник полностью редуцирован). Матка у крысы двурогая. 
Каждый рог кончается яйцеводом с воронкой, расположенной у яичника. 
Нижняя часть тела матки переходит во влагалище. Средний вес 
яичников крысы — 50–60 мг.
Задание к Задаче: схематично зарисовать железы внутренней секреции.


Задача
«Гистологическое строение желез внутренней секреции»

Оборудование: микроскоп, готовые препараты эндокринных желез.

Описание препаратов:
Гипофиз
Гипофиз состоит из передней, промежуточной и задней долей. 
Передняя доля (аденогипофиз) состоит из переплетающихся тяжей 
и групп эпителиальных клеток, которые по разному отношению к 
красителям делят на три группы: хромофобные, оксифильные и базофильные. 
Хромофобные, или главные, клетки по размерам меньше 
других, имеют округлую форму, большое светлое ядро, не содержат 
Доступ онлайн
439 ₽
В корзину