Аналитические методы исследования гомоцистеина

УДК 616
ББК 28.707
 
K88

Рецензенты:
член-корреспондент РАН  В.С. РЕПИН
академик РАН  В.А. ЮРКИВ

Кубатиев А.А., Иванов А.В., Лузянин Б.П. 
Аналитические методы исследования гомоцистеина / ФГБНУ НИИ 
общей патологии и патофизиологии М. : Наука, 2016. – 172 с. – ISBN 
978-5-02-039214-4.
В монографии наряду с описанием метаболизма гомоцистеина, «редокс-статуса» 
тиолов, вопросов подготовки и хранения проб представлен материал по количественному 
определению гомоцистеина и других аминотиолов. Обсуждаются возможности применения различных реагентов с целью повышения чувствительности детектирования аминотиолов и оптимизации процесса их разделения. Работа содержит обзор опубликованных за 
последние десятилетия отечественных и зарубежных исследований по инструментальным 
методам анализа аминотиолов с использованием капиллярного электрофореза, высокоэффективной жидкостной хроматографии и применением различных видов детектирования, 
включая масс-спектрометрическое, флуорометрическое и УФ-детектирование. 
Для биохимиков, токсикологов, врачей санитарно-эпидемиологической службы и 
специалистов клинических лабораторий.

ISBN 978-5-02-039214-4 
© Кубатиев А.А., Иванов А.В.,
 
 Лузянин Б.П., 2016
 
© ФГБНУ НИИ общей патологии
 
 и патофизиологии, 2016
 
© ФГУП Издательство «Наука», 2016

CПИСОК  СОКРАЩЕНИЙ

2MEA 
2-меркаптоэтиламин
2MC  
2-метилцистеин
4-MSA 
4-малеимидилсалициловая кислота
ANM 
анилиннафтилмалеимид 
ARM 
анилинфенилмалеимид 
ABD-F 
4-аминосульфонил-7-фтор-2,1,3-бензоксидиазол 
AcABD-F 4-(N-ацетиламиносульфонил)-7-фтор-2,1,3 
бензоксидиазол
BIPM 
N-[4-(2-бензимидазолил)фенил]-малеимид
bHcy 
связанный гомоцистеин 
CMQTB 
2-хлоро-1-метилхинолинтетрафторборат
CMPI 
2-хлор-1-метилпиридин иодид
CSF 
спинномозговая жидкость
Cys 
цистеин
Cysta  
цистатионин
Cys-Gly 
цистеинилглицин
CV 
коэффициент вариации
DTTI 
дитиотреитол
DTE 
дитиоэритриол
DTDNA 
6,6’-дитиодиникотиновая кислота 
DTNBA 
5,5’-дитио-бис(2-нитробензойная кислота)
DMANSC 5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорид
DAM 
диметиламинофенилмалеимид 
dPA 
d-пеницилламин
DBPM 
N-[4-(6-диметиламино-2-бензофуранил)фенил]
 
малеимид 
DTDP 
4,4’-дитиодипиридин
DACM 
N-(7-диметиламино-4-метил-2-оксо-3-хрометил)
 
малеимид
DBD-F 
4’-(N,N-диметиламиносульфонил)-7-фтор-2,1,3 
бензоксидиазол
EDTA 
калиевая/натриевая соль этилендиаминтетрауксус 
ной кислоты

EOF 
электро-осмотический поток (ЭОП)
FITC 
флуоресцеинизотиоцианат 
FM 
флуоресцеин-5-малеимид
FPIA 
флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ
GC 
газовая хроматография (ГХ) 
GITC 
2,3,4,6-тетра-О-ацето-β-D-глюкопиранозил 
 
изотиоцианат
GSH 
глутатион
Glu-Cys 
глутамилцистеин
Hcy 
гомоцистеин
ITC 
изотиоцианат
IAF 
иодоацетаминофлуоресцеин
МАТ  
метионинаденозинтрансфераза 
MCE 
меркаптоэтанол
MeCys 
метилцистеин
МEKC 
мицеллярный капиллярный электрофорез 
Met 
метионин
mBrB 
монобромбиман
mBrTMAB монобромтриметиламинобиман 
MPA 
3-меркаптопропионовая кислота
MPG  
N-(2-меркаптопропионил)глицин
MS  
метионинсинтаза
МТ  
метилтрансфераза
MTBSTFA N-метил-N-(трет-бутил-диметилсилил)трифтор 
ацетамид
MTHFR  
метилентетрагидрофолатредуктаза
NA-Cys 
N-ацетилцистеин
NDA 
2,3-нафталиндикарбоксиальдегид
NEM 
N-этилмалеимид
NAM 
N-(9-акридинил)малеимид
NSHBA 
2-нитро-5-сульфгидрилбензойная кислота
NMDG 
N-метил-D-глюкамин (меглумин)
NPM 
N-(1-пиринил)малеимид
NG 
нингидрин
OPA 
О-фталальдегид
oxHcy 
окисленный гомоцистеин
PBS 
фосфатно-солевой буфер 
rHcy 
восстановленный гомоцистеин
SAH  
S-аденозилгомоцистеин 
SAM 
S-аденозилметионин
SSA 
сульфосалициловая кислота

SBD-F 
аммониум – 7-фтор-2,1,3-бензоксидиазол-4 
сульфонат
SAMSA 
флуоресцеин-5((2-(и 3)-S-(ацетилмеркапто)сукцноил) 
 
амино)флуоресцеин
TBP 
три-n-бутилфосфин
TCEP 
трис-(2-карбоксиэтил)фосфин
TEA 
триэтиламин
TFA 
трифторуксусная кислота
TPP 
трифенилфосфин
TcAcABD 4(N-трихлорацетиламиносульфонил)-7-фтор-2,1,3 
бензоксадиазол
TCAA 
трихлоруксусная кислота
TCDI 
1,1-тиокарбонилдиимидазол
tHcy 
общий гомоцистеин
АТФ 
аденозинтрифосфат
АФК 
активные формы кислорода
БГМТ  
бетаин-гомоцистеин метилтрансфераза
ВЭЖХ 
высокоэффективная жидкостная хроматография
ГГЦ 
гипергомоцистеинемия
ГМК 
гладкомышечные клетки
ДГФК 
дигидрофолиевая кислота
ДНК 
дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА 
иммуноферментный анализ 
ЛПНП 
липопротеины низкой плотности
К(З)Э 
капиллярный (зонный) электрофорез
(Л)ФД 
(лазерный) флюоресцентный детектор 
МС 
масс-спектрометрия
НАДФ 
никотинамиддинуклеотидфосфат
ТГФ 
тетрагидрофолат 
ТЛ 
тиолактон гомоцистеина
УФ 
ультрафиолет(овый)
ФК 
фолиевая кислота
ХПН 
хроническая почечная недостаточность
ЭХД 
электрохимический детектор

ВВЕДЕНИЕ

Патология сердечно-сосудистой системы остается основной 
причиной заболеваемости и смертности населения. В связи с этим 
актуален поиск новых факторов риска, идентификация которых позволила бы влиять на уровень смертности от этих заболеваний [Баранова и др., 2004; Arboix, 2015; Vishram, 2014; Anthony et al., 2014].
К настоящему времени резко вырос интерес исследователей 
к изучению нарушений метаболизма серосодержащих аминокислот, приводящих к патогенезу целого ряда болезней человека. 
С начала 1990-х годов экспоненциально растет число исследований, посвященных различным аспектам изучения гомоцистеина 
[Stampfer et al., 1995; Mayer et al., 1996; Graham et al., 1997; Кустов, 2009; Debreceni, Debreceni, 2014; Santilli et al., 2015]. Многочисленные данные последних лет достоверно указывают на повышенное содержание гомоцистеина как независимый фактор риска 
сердечно-сосудистых заболеваний. Таким образом, гомоцистеин 
как фактор риска или как маркер риска различных заболеваний 
постепенно превращается в биомедицинскую концепцию.
Гипергомоцистеинемия (ГГЦ) является состоянием, при 
котором уровень гомоцистеина в крови превышает 10–15 мкМ. 
Гомоцистеин – это серосодержащая аминокислота, деметилированное производное аминокислоты метионина со свободной 
тиольной [сульфгидрильной] группой. Гомоцистеин впервые был 
описан в 1932 г. Будцом [Butz] и Виньо [Vigneaud]. Они получили 
его, обработав метионин концентрированной серной кислотой. 
В 1962 г. гомоцистеин был идентифицирован в моче умственно отсталых детей [Gerritaen et al., 1962]. Через несколько лет 
было установлено, что гомоцистинурия (повышенный уровень 
гомоцистеина в плазме) ассоциирована с тяжелым генетическим 
дефектом, приводящим к нарушению функции цистатионин-βсинтазы. Было показано, что пациенты, имеющие этот генетический деффект, страдают от тромбоэмболии и преждевременного 
атеросклероза [Gibson et al., 1964]. Среди этих пациентов более 
50 % имели сердечно-сосудистую патологию и 25 % скончались 
в возрасте до 30 лет. В 1969 г. МакКали [McCully] обнаружил у 

пациентов, страдающих этой патологией, пролиферацию гладких 
мышц, прогрессивный стеноз артерии и гемостатические изменения. Он предположил, что пациенты, страдающие тромбозом 
и атеросклерозом, потенциально имеют дефицит цистатионин-βсинтазы. Позже были обнаружены дефекты в других ферментах 
(метионинсинтазы, метилентетрагидрофолатредуктазы), участвующих в метаболизме гомоцистеина. Природа эпидемиологии 
(ГГЦ) и механизмы ее развития на протяжении многих лет являются одними из наиболее сложных и дискуссионных разделов профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний 
[Stampfer et al., 1995]. В настоящее время число публикаций, посвященных рассмотрению этой проблемы, ежегодно превышает 
тысячу. Эпидемиологические исследования свидетельствуют, что 
даже умеренная хроническая гомоцистеинемия способствует развитию инфаркта миокарда, инсульта, окклюзий периферических 
артерий и тромбоэмболий вен. Известно, что гомоцистеин может 
способствовать окислению липопротеинов низкой плотности 
[Loscalo et al., 1996], нарушению функции эндотелия, пролиферации гладкомышечных клеток сосудов, активации тромбоцитов и 
коагуляционного каскада [Mayer et al., 1996; Booth et al., 2000]. 
Установлено, что гомоцистеин приводит к эндотелиальной 
дисфункции путем ослабления тонуса сосудов и тока крови в них, 
активации и адгезии воспалительных клеток и ослаблению антитромботической функции эндотелиальных клеток. Повышенные 
уровни гомоцистеина являются факторами риска развития сердечной недостаточности у лиц, ранее не подверженных сердечным 
приступам. Показано, что при снижении уровней гомоцистеина 
на 3 мкМ риск развития ишемической болезни сердца (ИБС) снизился бы на 16 %, тромбоза глубоких вен – на 25 %, а инсульта – 
на 24 % [Sen et al., 2010; Santilli et al., 2015; Дунаевская и др., 
2015].  
Проведенные исследования свидетельствуют о том, что ГГЦ 
способствует гиперкоагуляции, что имеет особое значение у больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями, представляющими 
группу с высоким риском тромбообразования.
Среди взрослого населения умеренная ГГЦ встречается часто 
(1 : 70) и обнаруживается приблизительно у 30 % лиц с атеротромботическим поражением коронарных, церебральных и периферических артерий. Безусловно, изучение гипергомоцистеинемии невозможно без развития прецизионных аналитических 
методов определения гомоцистеина в различных биологических 
матрицах. В связи с этим актуальным остается поиск информативных лабораторных показателей, позволяющих оценить риск 
тромбообразований, ассоциированных с ГГЦ.

Часть I

АМИНОТИОЛЫ  В  ОРГАНИЗМЕ 

Глава 1

БИОХИМИЯ  АМИНОТИОЛОВ

1.1. Метаболизм гомоцистеина и его регуляция

Гомоцистеин (Hcy) – серосодержащая аминокислота, имеющая 
структурное сходство с метионином (Met) и цистеином (Cys). Его 
метаболизм тесно связан с этими аминокислотами. Это непротеогенная аминокислота, обладающая множеством молекулярных мишеней, обусловливающих многообразие патогенетических механизмов клеточного повреждения с его участием. В отличие от Met 
и Cys, Hcy не включается в первичную структуру белков, однако 
он может модифицировать их цистеиновые и лизиновые остатки.
Млекопитающие, в отличие от бактерий и растений, не могут 
синтезировать свой собственный метионин, поэтому на интенсивность его обмена озывает большое влияние алиментарный 
фактор. Известно два основных пути, по которым происходит 
метаболизм метионина в клетках млекопитающих. Первый путь 
(анаболический) основан на использвании метионина в качестве 
«строительного материала» для синтеза новых белков. Второй 
путь (катаболический) называется метиониновым циклом и представляет собой цепь реакций превращения: метионин – S-аденозилметионин (SAM) – S-аденозилгомоцистеин (SAH) – Hcy, который замыкается регенерацией (реметилированием) метионина 
за счет использования 5-метилТГФ или бетаина (в печени) как 
доноров метильной группы. Таким образом, метионин можно 
считать основным источником гомоцистеина в организме человека. Метиониновый цикл представлен на рис. 1. 
Образование SAM из метионина и АТФ катализируется метионинаденозинтрансферазой (МАТ). Он как продукт ингибирует 
эту реакцию, что особенно значимо в эритроцитах. Метильная 
группа метионина активируется под действием положительного 
заряда соседнего атома серы, поэтому реакционная способность 

данной группы очень высока. На промежуточной стадии синтеза 
SAM образуется трифосфат, гидролиз которого до ортофосфата 
и пирофосфата происходит также в реакционном центре МАТ. 
Стадия гидролиза трифосфата является скорость-лимитирующим 
процессом и, кроме того, МАТ может осуществлять его в отсутствие АТФ и метионина [Lu, Mato, 2012]. NO является физиологическим ингибитором фосфатазной активности МАТ [del Pino 
et al., 2000] и тем самым регулирует содержание SAM в печени 
при ее регенерации [Vazquez-Chantada et al., 2009]. Передача метильных групп с SAM на многочисленные субстраты катализируется метилтрансферазами (МТ), коих насчитывается у человека 
более 200 [Petrossian, Clarke, 2011; Brosnan, 2005]. SAM осуществляет метилирование ДНК, белков, аминокислот, углеводов, 
жиров, катехоламинов и других соединений. Реакция передачи 
метильной группы на субстрат проходит по механизму sn2-замещения. В качестве нуклеофила могут выступать атомы углерода 
(С-метилирование цитозина ДНК), азота (N-метилирование глицина), кислорода (О-метилирование катехоламинов), серы (S-метилирование тиопуринов) [Lu, Mato, 2012].
Таким образом, S-аденозилметионин (SAM) и S-аденозилгомоцистеин (SAH) играют ключевую роль в обмене метильных групп организма. Эти соединения были открыты в 50-х гг.
ХХ в. как участники реакций трансметилирования [Cantoni, 1952]. 
Такие реакции характерны для всех типов клеток, но у животных 
они наиболее активно протекают в печени, поэтому на ее долю 
приходится ~85 % оборота SAM [Finkelstein, 1990]. Уникальность этого соединения для человека заключается не только в его 
универсальности как донора метильных групп, но также в том, 

Рис. 1. Цикл метилирования (метиониновый цикл)

ТГФ – тетрагидрофолат, MTHFR – метилентетрагидрофолатредуктаза, MS – метионинсинтаза, SAM – S-аденозилметионин, SAH – S-аденозилгомоцистеин, MAT – метионинаденозинтрансфераза, АТФ – аденозинтрифосфат, БГМТ – бетаин-гомоцистеин метилтрансфераза

что не существует иного источника его образования, кроме как из 
метионина и АТФ [Kaul et al., 2006]. Кроме того, SAM необходим 
для синтеза полиаминов (спермидина и спермина), а также участвует в специфических радикальных реакциях [Lu, Mato, 2012].
SAM является ионом сульфония, где атом серы имеет три 
заместителя и несет на себе положительный заряд. За счет того 
что третий заместитель добавляет хиральный центр, для SAM 
возможны четыре энантиомерные структуры. Так как в организме источником SAM является только L-метионин, то присутствуют только две формы SAM, обозначаемые по номенклатуре как 
(S,S) и (R,S). Первый символ относится к атому серы, второй – к 
α-углероду метионинового остатка. Биологической активностью 
обладает только (S,S) форма, которая спонтанно может рацемизироваться в неактивную (R,S) форму. Содержание последней в 
тканях невелико и составляет до 3 % [Hoffman, 1986]. Являясь 
нестабильным соединением, SAM может при физиологических 
условиях подвергаться распаду на метилтиоаденозин и гомосеринлактон, а также гидролизу с образованием аденозина и S-пентозилметионина. Все эти реакции, включая рацемизацию, происходят со скоростями ~2–5 · 106 с–1 и, за исключением гидролиза, 
протекают при рН вплоть до 1,5 [Hoffman, 1986]. 
SAM как продукт ингибирует реакцию своего образования, 
особенно в эритроцитах. Так, Кi SAM для эритроцитарной метионинаденозилтрансферазы составляет 2–2,9 мкМ [Oden et al., 1983], 
что близко к его внутриклеточной концентрации и отличает ее от 
аналогичных ферментов других клеток, имеющих Ki в десятки и 
сотни мкМ. Также Km для метионина у эритроцитарной метионинаденозилтрансферазы в несколько раз ниже, чем у других форм 
[Oden et al., 1983]. Поэтому эритроциты характеризуются низким 
содержанием SAM, ограниченными возможностями реметилирования Hcy [Blom et al., 2000], и его изменения во многих случаях 
не коррелируют с изменениями в других клетках и плазме крови. 
На промежуточной стадии синтеза SAM образуется трифосфат, гидролиз которого до ортофосфата и пирофосфата происходит также в реакционном центре метионинаденозилтрансферазы. 
Стадия гидролиза трифосфата является скорость-лимитирующим 
процессом и, кроме того, МАТ может осуществлять его в отсутствие АТФ и метионина [Lu, Mato, 2012]. Оксид азота является 
физиологическим ингибитором фосфатазной активности метионинаденозилтрансфераз и поэтому может регулировать содержание SAM [Vazquez-Chantada et al., 2009].
Дефицит метионинаденозилтрансфераз приводит к повышению концентрации метионина и снижению концентрации SAM.