Культура животных клеток

КУЛЬТУРА  
ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК

ПРАКТИЧЕСКОЕ РУКОВОДСТВО

СULTURE 
OF ANIMAL 
CELLS

A  MANUAL OF BASIC TECHNIQUE 
AND SPECIALIZED APPLICATIONS

R. Jan Freshney

Cancer Research UK Centre or Oncology and Applied Pharmacology 
Division of Cancer Sciences and Molecular PharmacologyUniversity of Glasgow
Willey-Liss

Sixth Edition

КУЛЬТУРА
ЖИВОТНЫХ
КЛЕТОК

 

ПРАКТИЧЕСКОЕ  РУКОВОДСТВО

5-е издание, электронное

Р. Я. Фрешни

Перевод 6-го английского издания

Москва
Лаборатория знаний
2022

УДК 57.08
ББК 28.03
Ф87

П е р е в о д ч и к и:
д-р биол. наук Ю. Н. Хомяков,
канд. мед. наук Т. И. Хомякова
Фрешни Р. Я.
Ф87
Культура животных клеток : практическое руководство /
Р. Я. Фрешни
;
пер.
6-го
англ.
изд. — 5-е
изд.,
электрон. —
М. : Лаборатория знаний, 2022. — 791 с. — Систем. требования:
Adobe Reader XI ; экран 10". — Загл. с титул. экрана. — Текст :
электронный.
ISBN 978-5-00101-974-9
Учебное издание, написанное ведущим специалистом в данной области,
содержит наиболее полное описание теоретических основ и практических
приемов работы с культурами животных клеток, а также необходимого
оборудования, включая лабораторный дизайн. В достаточном объеме освещены вопросы техники безопасности. Подробно обсуждаются методика
подготовки сред, приемы работы с первичной культурой и клеточными
линиями. Описано специальное оборудование, в том числе для манипуляций
с культурами животных клеток. Книга прекрасно иллюстрирована и удобна
для использования как руководство в лаборатории.
Для студентов-биологов, биотехнологов, медиков, а также исследователей, специалистов биофармацевтических центров и сотрудников диагностических лабораторий.
УДК 57.08
ББК 28.03

Приведенные в книге показания к применению, противопоказания и дозировки препаратов настоятельно рекомендуется сверять с информацией их производителей и соотносить с клиническими процедурами.
Авторы, редакторы и издатель не несут никакой юридической ответственности за любые содержащиеся в тексте
и иллюстрациях ошибки или упущения.

В соответствии со ст. 1299 и 1301 ГК РФ при устранении ограничений, установленных техническими
средствами защиты авторских прав, правообладатель вправе требовать от нарушителя возмещения убытков
или выплаты компенсации

ISBN 978-5-00101-974-9

©
Copyright
2010 by John Wiley & Sons. Inc. All rights reserved.
Все права защищены. Авторизованный перевод издания
на английском языке, опубликованного John Wiley & Sons
Limited. Ответственность за точность перевода полностью
возложена на издательство Лаборатория знаний и не является
ответственностью John Wiley & Sons Limited. Никакая часть
данной книги не может быть воспроизведена в любой форме
без письменного разрешения первоначального правообладателя,
John Wiley & Sons Limited.

© Перевод на русский язык, оформление, Лаборатория знаний,
2015

Оглавление

Список иллюстраций . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Список цветных вклеек . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Список протоколов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Список таблиц . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Предисловие и благодарности  . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Список сокращений  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

Глава 1
ВВЕДЕНИЕ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

1.1. 
Исторические сведения . . . . . . . . . . . . . . . 30

1.2. 
Преимущества культуры ткани  . . . . . . . 35

1.2.1. 
Контроль окружающей среды . . . . . . . . . . . 35

1.2.2. 
Характеристика и однородность образцов  36

1.2.3. 
Экономичность, эффективность и автоматизация процесса  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

1.2.4. 
Моделирование in vitro условий in vivo . . . 36

1.3. 
Ограничения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

1.3.1. 
Наличие специальных навыков  . . . . . . . . . 36

1.3.2. 
Затраты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

1.3.3. 
Дифференцировка и селекция  . . . . . . . . . . 37

1.3.4. 
Происхождение клеток  . . . . . . . . . . . . . . . . 37

1.3.5. 
Нестабильность  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

1.4. 
Основные отличия культуры in vitro  . . . 38

1.5. 
Типы культуры ткани . . . . . . . . . . . . . . . . 38

Глава 2
БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.1. 
Влияние окружающей среды на культуру 
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.2. 
Клеточная адгезия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.2.1. 
Молекулы клеточной адгезии . . . . . . . . . . . 41

2.2.2. 
Межклеточные контакты . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.2.3. 
Внеклеточный матрикс  . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.2.4. 
Цитоскелет  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.2.5. 
Клеточная подвижность  . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.3. 
Клеточная пролиферация . . . . . . . . . . . . . 45

2.3.1. 
Клеточный цикл . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.3.2. 
Контроль клеточной пролиферации . . . . . . 46

2.4. 
Дифференцировка  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

2.4.1. 
Поддержание дифференцировки  . . . . . . . . 47

2.4.2. 
Дедифференцировка  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

2.5. 
Передача клеточных сигналов  . . . . . . . . 50

2.6. 
Энергетический метаболизм  . . . . . . . . . . 51

2.7. 
Происхождение культивируемых клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

2.7.1. 
Получение первичной культуры . . . . . . . . . 52

2.7.2. 
Эволюция клеточных линий . . . . . . . . . . . . 53

2.7.3. 
Старение  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

2.7.4. 
Трансформация и развитие постоянных 
клеточных линий  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

Глава 3
СТРУКТУРА, ПЛАНИРОВКА И ОБОРУДОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОМЕЩЕНИЙ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  56

3.1. 
Планировка, меблировка и оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.1.1. 
Требования к помещениям  . . . . . . . . . . . . . 57

3.1.2. 
Обслуживание  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.1.3. 
Вентиляция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.2. 
Планировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.2.1. 
Помещение для стерильных манипуляций  61

3.2.2. 
Ламинарное оборудование  . . . . . . . . . . . . . 62

3.2.3. 
Служебный лабораторный стол  . . . . . . . . . 62

3.2.4. 
Карантин и изоляция . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

3.2.5. 
Инкубация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

3.2.6. 
Зона подготовительных работ . . . . . . . . . . . 66

3.2.7. 
Хранение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

Глава 4
ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ . . . . 70

4.1. 
Потребности 
лаборатории 
культуры 
ткани . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.2. 
Асептическая зона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.2.1. 
Ламинарные шкафы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.2.2. 
Сервисные тележки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.2.3. 
Стерильные манипуляции с жидкостями — 
пипетирование и дозирование  . . . . . . . . . . 75

4.2.4. 
Инвертированный микроскоп . . . . . . . . . . . 79

4.2.5. 
CCD-камера и монитор  . . . . . . . . . . . . . . . . 79

4.2.6. 
Препаровальная лупа . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

4.2.7. 
Центрифуга . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

4.2.8. 
Подсчет клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

4.3. 
Инкубация и культура  . . . . . . . . . . . . . . . 80

4.3.1. 
Инкубатор . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

4.3.2. 
Влажный СО2-инкубатор  . . . . . . . . . . . . . . 81

4.3.3. 
Регистратор температуры  . . . . . . . . . . . . . . 83

4.3.4. 
Роллерные штативы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

4.3.5. 
Магнитная мешалка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

4.3.6. 
Культуральные сосуды . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

4.4. 
Препаративные работы и стерилизация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

4.4.1. 
Мытье посуды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

4.4.2. 
Приготовление сред и реактивов  . . . . . . . . 84

4.4.3. 
Стерилизация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

4.5. 
Хранение  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

4.5.1. 
Расходные материалы  . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

Оглавление

4.5.2. 
Холодильники и морозильники  . . . . . . . . . 88

4.5.3. 
Контейнеры для криоконсервации . . . . . . . 88

4.5.4. 
Мультилокусный 
ДНК-фингерпринтинг 
с управляемым процессом замораживания  89

4.6. 
Дополнительное лабораторное оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

4.6.1. 
Компьютеры и cети  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

4.6.2. 
Прямой микроскоп . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

4.6.3. 
Низкотемпературный морозильник  . . . . . . 89

4.6.4. 
Конфокальный микроскоп  . . . . . . . . . . . . . 90

4.6.5. 
PCR-термоциклер (ДНК-амплификатор) . . 90

4.7. 
Специальное оборудование  . . . . . . . . . . . 90

4.7.1. 
Установка для микроинъекций . . . . . . . . . . 90

4.7.2. 
Счетчик колоний  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

4.7.3. 
Центрифужный элютриатор  . . . . . . . . . . . . 90

4.7.4. 
Проточный цитометр . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

Глава 5
МЕТОДЫ АСЕПТИКИ  . . . . . . . . . . . . . . . 91

5.1. 
Цели асептики  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

5.1.1. 
Риск контаминации  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

5.1.2. 
Поддержание стерильности  . . . . . . . . . . . . 91

5.2. 
Элементы асептического окружения . . . 91

5.2.1. 
Ламинарный поток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

5.2.2. 
Стерильная зона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

5.2.3. 
Рабочая поверхность  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

5.2.4. 
Личная гигиена . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

5.2.5. 
Реагенты и среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

5.2.6. 
Культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

5.3. 
Стерильные манипуляции . . . . . . . . . . . . 97

5.3.1. 
Протирание поверхностей . . . . . . . . . . . . . . 97

5.3.2. 
Закрывание емкостей . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

5.3.3. 
Работа с горелкой . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

5.3.4. 
Манипуляции с бутылями и колбами . . . . . 97

5.3.5. 
Пипетирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

5.3.6. 
Переливание . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

5.4. 
Стандартная процедура  . . . . . . . . . . . . . . 99
Протокол 5.1.  Асептический метод работы в вертикальном ламинарном потоке . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

Протокол 5.2.  Работа на открытой поверхности  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

Протокол 5.3.  Работа 
с 
планшетами 
и чашками  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

5.5. 
Приборы и оборудование  . . . . . . . . . . . . . 104

5.5.1. 
Инкубаторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104

5.5.2. 
Коробки для влажного инкубатора . . . . . . . 104

5.5.3. 
Культивирование в атмосфере СО2 . . . . . . . . . 104

Глава 6
БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА И ВАЛИДАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

6.1. 
Лабораторная безопасность . . . . . . . . . . . 105

6.2. 
Оценка риска  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

6.3. 
Стандартные рабочие процедуры . . . . . . 107

6.4. 
Контроль безопасности . . . . . . . . . . . . . . . 107

6.5. 
Общая безопасность  . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

6.5.1. 
Оператор . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

6.5.2. 
Оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

6.5.3. 
Стеклянные и острые предметы . . . . . . . . . 108

6.5.4. 
Химическая токсичность . . . . . . . . . . . . . . . 110

6.5.5. 
Газы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

6.5.6. 
Жидкий азот  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

6.5.7. 
Ожоги  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

6.6. 
Пожар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

6.7. 
Ионизирующее излучение  . . . . . . . . . . . . 112

6.7.1. 
Попадание в организм . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

6.7.2. 
Утилизация радиоактивных отходов  . . . . . 112

6.7.3. 
Излучение от меченых реагентов . . . . . . . . 112

6.7.4. 
Излучение от высокоэнергетических источников  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

6.8. 
Биологическая опасность . . . . . . . . . . . . . 113

6.8.1. 
Уровни биологической защиты  . . . . . . . . . 113

6.8.2. 
Ламинарные 
шкафы 
микробиологической защиты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

6.8.3. 
Человеческий биопсийный материал . . . . . 116

6.8.4. 
Манипуляции с генетическим материалом  119

6.8.5. 
Уничтожение биологически опасных отходов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

6.8.6. 
Дезинфекция окуриванием . . . . . . . . . . . . . 120

6.9. 
Биоэтика  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

6.9.1. 
Ткани животных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

6.9.2. 
Ткани человека . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

6.10. 
Обеспечение качества . . . . . . . . . . . . . . . . 121

6.10.1. 
Процедуры  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

6.10.2. 
Контроль качества  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

6.11. 
Валидация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

6.11.1. 
Подтверждение аутентичности . . . . . . . . . . 122

6.11.2. 
Происхождение  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

6.11.3. 
Контаминация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

Глава 7
ПОСУДА И СУБСТРАТЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК . . . . . . . . . . . . . . . 124

7.1. 
Субстрат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

7.1.1. 
Прикрепление и рост клеток . . . . . . . . . . . . 124

7.1.2. 
Общепринятые материалы для субстрата  . 124

7.1.3. 
Альтернативные субстраты . . . . . . . . . . . . . 124

7.2. 
Обработка поверхности  . . . . . . . . . . . . . . 125

7.2.1. 
Покрытие матриксом . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
Протокол 7.1.  Приготовление ECM  . . . . . 126

7.2.2. 
Фидерные слои . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126

7.2.3. 
Неадгезивные субстраты . . . . . . . . . . . . . . . 126

7.3. 
Выбор культуральных сосудов  . . . . . . . . 127

7.3.1. 
Клеточный выход . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

7.3.2. 
Суспензионная культура  . . . . . . . . . . . . . . . 129

7.3.3. 
Вентиляция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

7.3.4. 
Отбор и анализ проб  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

7.3.5. 
Неравномерный рост . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132

7.3.6. 
Расходы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

7.4. 
Специализированные системы . . . . . . . . 133

7.4.1. 
Проницаемые подложки  . . . . . . . . . . . . . . . 133

7.4.2. 
Трехмерные матриксы . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

Глава 8
СРЕДЫ И ДОБАВКИ  . . . . . . . . . . . . . . . . 135

8.1. 
Составление сред  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

8.2. 
Физико-химические свойства  . . . . . . . . . 135

8.2.1. 
Значение pH  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

Оглавление 
7

Протокол 8.1.  Приготовление стандартных буферных растворов  . . . . . . . . . . . 135

8.2.2. 
CO2 и бикарбонат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136

8.2.3. 
Буферная система . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137

8.2.4. 
Кислород . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138

8.2.5. 
Осмотическое давление . . . . . . . . . . . . . . . . 138

8.2.6. 
Температура  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

8.2.7. 
Вязкость  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

8.2.8. 
Поверхностное натяжение и пенообразование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

8.3. 
Сбалансированные солевые растворы  . 142

8.4. 
Полная среда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

8.4.1. 
Аминокислоты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

8.4.2. 
Витамины  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

8.4.3. 
Соли . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

8.4.4. 
Глюкоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

8.4.5. 
Органические добавки . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

8.4.6. 
Гормоны и факторы роста . . . . . . . . . . . . . . 144

8.4.7. 
Антибиотики . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

8.5. 
Сыворотка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

8.5.1. 
Белки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

8.5.2. 
Факторы роста  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

8.5.3. 
Гормоны  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146

8.5.4. 
Питательные вещества и метаболиты  . . . . 146

8.5.5. 
Липиды  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146

8.5.6. 
Неорганические вещества . . . . . . . . . . . . . . 146

8.5.7. 
Ингибиторы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146

8.6. 
Выбор среды и сыворотки  . . . . . . . . . . . . 146

8.6.1. 
Резервирование партии сыворотки  . . . . . . 147

8.6.2. 
Тестирование сыворотки . . . . . . . . . . . . . . . 148

8.6.3. 
Термическая инактивация . . . . . . . . . . . . . . 149

8.7. 
Другие добавки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

8.7.1. 
Гидролизаты аминокислот  . . . . . . . . . . . . . 149

8.7.2. 
Эмбриональный экстракт  . . . . . . . . . . . . . . 149

8.7.3. 
Кондиционированная среда  . . . . . . . . . . . . 149

Глава 9
БЕССЫВОРОТОЧНЫЕ СРЕДЫ . . . . . . . 150

9.1. 
Недостатки сыворотки  . . . . . . . . . . . . . . . 150

9.2. 
Преимущества бессывороточных сред  . 154

9.2.1. 
Определение стандартной среды  . . . . . . . . 154

9.2.2. 
Селективные среды  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154

9.2.3. 
Регуляция пролиферации и дифференцировки  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154

9.3. 
Недостатки бессывороточных сред  . . . . 156

9.4. 
Замена сыворотки  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156

9.4.1. 
Коммерчески доступные бессывороточные среды  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156

9.4.2. 
Заменители сыворотки  . . . . . . . . . . . . . . . . 156

9.4.3. 
Бессывороточная субкультура  . . . . . . . . . . 157

9.4.4. 
Гормоны  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

9.4.5. 
Факторы роста  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

9.4.6. 
Питательные вещества сыворотки . . . . . . . 158

9.4.7. 
Белки и полиамины  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

9.4.8. 
Вязкость  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

9.5. 
Выбор бессывороточной среды . . . . . . . . 158

9.5.1. 
Специфичность клеток или продукта  . . . . 158

9.5.2. 
Адаптация клеток к бессывороточной 
среде  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165

9.6. 
Разработка бессывороточной среды . . . . 165

9.7. 
Приготовление бессывороточной среды  165

9.8. 
Среда, не содержащая животных белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166

9.9. 
Заключение  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166

Глава 10
ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

10.1. 
Приготовление реактивов и материалов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

10.2. 
Стерилизация оборудования и жидкостей  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

10.3. 
Оборудование  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168

10.3.1. 
Стеклянная посуда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
Протокол 10.1.  Подготовка и стерилизация изделий из стекла  . . . . . . . . . . . . . . 169

10.3.2. 
Стеклянные пипетки  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
Протокол 10.2.  Подготовка и стерилизация стеклянных пипеток . . . . . . . . . . . . 173

10.3.3. 
Завинчивающиеся крышки . . . . . . . . . . . . . 175
Протокол 10.3.  Подготовка и стерилизация завинчивающихся крышек . . . . . . . . 175

10.3.4. 
Выбор детергента . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176

10.3.5. 
Прочее оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177

10.3.6. 
Стерилизационные фильтры многократного использования  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177
Протокол 10.4.  Стерилизация комплекта 
фильтров . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178

10.4. 
Реагенты и среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178

10.4.1. 
Вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
Протокол 10.5.  Приготовление и стерилизация сверхчистой воды (UPW)  . . . . . . 179

10.4.2. 
Техническое обслуживание водоочистительной установки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180

10.4.3. 
Сбалансированный солевой раствор (BSS)  180
Протокол 10.6.  Приготовление и стерилизация D-PBSA  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181

10.4.4. 
Приготовление и стерилизация среды . . . . 181
Протокол 10.7.  Приготовление 
среды 
из концентрата с кратностью 1×  . . . 182

Протокол 10.8.  Приготовление 
среды 
из концентрата с кратностью 10×  . . 182

10.4.5. 
Порошкообразные среды . . . . . . . . . . . . . . . 184
Протокол 10.9.  Приготовление 
среды 
из порошка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184

10.4.6. 
Специализированная среда . . . . . . . . . . . . . 184
Протокол 10.10.  Приготовление специализированной среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185

10.5. 
Стерилизация среды  . . . . . . . . . . . . . . . . . 185

10.5.1. 
Автоклавируемые среды  . . . . . . . . . . . . . . . 185

10.5.2. 
Стерилизация методом фильтрации . . . . . . 185
Протокол 10.11.  Стерилизация 
с 
использованием фильтрующих насадок 
на шприцы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186

Протокол 10.12.  Стерилизация с использованием фильтрующей вакуумной насадки на колбу . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188

Оглавление

Протокол 10.13.  Стерилизация с использованием малого встроенного фильтра  . 189

Протокол 10.14.  Стерилизационная фильтрация с использованием большого прямоточного фильтра . . . . . . . . . . . . . . . . 190

10.5.3. 
Сыворотка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
Протокол 10.15.  Сбор и стерилизация сывороток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192

Протокол 10.16.  Диализ сывороток  . . . . . 194

10.5.4. 
Приготовление и стерилизация других реагентов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

10.6. 
Контроль, проверка качества и хранение 
сред  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

10.6.1. 
Контроль качества  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

10.6.2. 
Проверка стерильности . . . . . . . . . . . . . . . . 196

10.6.3. 
Проверка культуральных свойств . . . . . . . . 197

10.6.4. 
Хранение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198

Глава 11
ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА . . . . . . . . . . . . . 199

11.1. 
Инициация первичной культуры клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199

11.1.1. 
Ферменты, используемые для дезагрегации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199

11.1.2. 
Общие характеристики дезагрегации  . . . . 199

11.2. 
Выделение образцов ткани . . . . . . . . . . . . 200

11.2.1. 
Мышиный эмбрион  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
Протокол 11.1.  Выделение мышиного эмбриона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201

11.2.2. 
Куриный эмбрион . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
Протокол 11.2.  Выделение куриного эмбриона  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204

11.2.3. 
Биопсийный материал человека . . . . . . . . . 204
Протокол 11.3.  Передача и получение биопсийного материала человека . . . . . . . 206

11.3. 
Типы первичной культуры  . . . . . . . . . . . 206

11.3.1. 
Первичный эксплантат  . . . . . . . . . . . . . . . . 206
Протокол 11.4.  Первичные эксплантаты . 206

11.3.2. 
Ферментативная дезагрегация  . . . . . . . . . . 208

11.3.3. 
Теплый трипсин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Протокол 11.5.  Дезагрегация ткани теплым трипсином . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209

11.3.4. 
Трипсинизация с преинкубацией на холоде  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
Протокол 11.6.  Дезагрегация ткани в холодном трипсине  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212

11.3.5. 
Рудиментарные органы куриного эмбриона  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
Протокол 11.7.  Рудиментарные 
органы 
куриного эмбриона  . . . . . . . . . . . . . . . . . 213

11.3.6. 
Дезагрегация с использованием других 
ферментов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215

11.3.7. 
Коллагеназа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
Протокол 11.8.  Дезагрегация ткани с помощью коллагеназы  . . . . . . . . . . . . . . . . 215

11.3.8. 
Механическая дезагрегация  . . . . . . . . . . . . 219
Протокол 11.9.  Механическая дезагрегация ткани путем просеивания  . . . . . . . 220

11.3.9. 
Разделение жизнеспособных и нежизнеспособных клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220
Протокол 11.10.  Обогащение доли жизнеспособных клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220

11.3.10. Первичная культура, краткие выводы  . . . . 222
11.3.11. 
Первичная документация  . . . . . . . . . . . . . . 222

Глава 12
СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ  
ЛИНИИ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223

12.1. 
Субкультивирование . . . . . . . . . . . . . . . . . 223

12.1.1. 
Перекрестная контаминация и неправильная 
идентификация   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223

12.1.2. 
Микоплазменная контаминация . . . . . . . . . 227

12.1.3. 
Терминология . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228

12.1.4. 
Маркировка клеточной культуры . . . . . . . . 228

12.1.5. 
Возраст культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229

12.2. 
Выбор клеточной линии . . . . . . . . . . . . . . 229

12.3. 
Обычный порядок поддержания культуры  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230

12.3.1. 
Значение клеточной морфологии . . . . . . . . 230

12.3.2. 
Замена среды  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231

12.3.3. 
Стандартный протокол замены среды  . . . . 232
Протокол 12.1.  Питание 
монослойной 
культуры во флаконах  . . . . . . . . . . . . . . 232

Протокол 12.2.  Питание 
монослойной 
культуры в чашках и планшетах  . . . . . 233

12.4. 
Субкультивирование . . . . . . . . . . . . . . . . . 233

12.4.1. 
Критерии субкультивирования . . . . . . . . . . 234

12.4.2. 
Стандартный протокол субкультивирования 
клеток, образующих монослой  . . . . . . . . . . 236
Протокол 12.3.  Субкультивирование клеток, образующих монослой . . . . . . . . . . 236

12.4.3. 
Цикл роста и индекс разведения  . . . . . . . . 238

12.4.4. 
Концентрация клеток в субкультуре  . . . . . 239

12.4.5. 
Размножение в суспензии  . . . . . . . . . . . . . . 239

12.4.6. 
Субкультивирование клеток, растущих в суспензии  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240
Протокол 12.4.  Суспензионное субкультивирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240

12.4.7. 
Стандартизация условий культивирования  241

12.4.8. 
Использование антибиотиков . . . . . . . . . . . 242

12.4.9. 
Ведение документации  . . . . . . . . . . . . . . . . 242

Глава 13
КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ  . . . . . 244

13.1. 
Клонирование клеток  . . . . . . . . . . . . . . . . 244
Протокол 13.1.  Клонирование с разведением  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245

13.2. 
Стимуляция эффективности посева  . . . 247

13.2.1. 
Условия, которые улучшают клональный рост  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248

13.2.2. 
Кондиционированные среды . . . . . . . . . . . . 249
Протокол 13.2.  Приготовление кондиционированной среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249

13.2.3. 
Фидерные слои . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250
Протокол 13.3.  Приготовление фидерных 
слоев . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250

13.3. 
Суспензионное клонирование  . . . . . . . . . 251

Оглавление 
9

Протокол 13.4.  Клонирование в агаре . . . . 251
Протокол 13.5.  Клонирование в Methocel . 252

13.4. 
Выделение клонов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255
Протокол 13.6.  Выделение клонов с использованием колец для клонирования . . . . . 255

Протокол 13.7.  Выделение клеточных колоний путем облучения  . . . . . . . . . . . . . 257

13.4.1. 
Другие методы выделения монослойных клонов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257

13.4.2. 
Суспензионные клоны . . . . . . . . . . . . . . . . . 257
Протокол 13.8.  Выделение 
суспензионных клонов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257

13.5. 
Получение репликативных колоний  . . . 258

13.6. 
Селективные ингибиторы  . . . . . . . . . . . . 259

13.7. 
Выделение генетических вариантов  . . . 259
Протокол 13.9.  Метотрексат-резистентность и DHFR-амплификация . . . . . . . . 259

13.8. 
Взаимодействие с субстратом  . . . . . . . . . 261

13.8.1. 
Селективная адгезия  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261

13.8.2. 
Селективное открепление . . . . . . . . . . . . . . 261

13.8.3. 
Природа субстрата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261

13.8.4. 
Селективные фидерные слои  . . . . . . . . . . . 261

13.8.5. 
Селекция на полужидкой среде  . . . . . . . . . 261

Глава 14
РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК  . . . . . . . . . . . . . . 263

14.1. 
Плотность клеток и изопикническая седиментация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
Протокол 14.1.  Разделение клеток центрифугированием в градиенте плотности  263

14.2. 
Размер клеток и скорость седиментации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266

14.2.1. 
Гравитационная седиментация . . . . . . . . . . 266

14.2.2. 
Элютриация центрифугированием . . . . . . . 266

14.3. 
Методы, основанные на применении антител . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266

14.3.1. 
Иммунный пэннинг . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267

14.3.2. 
Магнитный сортинг . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
Протокол 14.2.  Магнитно-активированный 
клеточный сортинг (MACS)  . . . . . . . . . 269

14.4. 
Флуоресцентно-активируемый клеточный сортинг  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270

14.5. 
Другие методы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272

14.6. 
Подходы для начинающих к освоению 
клеточного сортинга  . . . . . . . . . . . . . . . . . 273

Глава 15
ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК  . . . . . . . . 274

15.1. 
Необходимость характеристики  . . . . . . . 274

15.2. 
Аутентификация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274

15.3. 
Ведение документации и происхождение 
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275

15.4. 
Параметры характеристики  . . . . . . . . . . 275

15.4.1. 
Видовая идентификация  . . . . . . . . . . . . . . . 275

15.4.2. 
Происхождение тканевых маркеров . . . . . . 276

15.4.3. 
Уникальные маркеры . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277

15.4.4. 
Трансформация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278

15.5. 
Морфология клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278

15.5.1. 
Микроскопия  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284

Протокол 15.1.  Использование инвертированного микроскопа  . . . . . . . . . . . . . . . . 284

15.5.2. 
Окрашивание  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285
Протокол 15.2.  Окрашивание по Гимзе . . . 285
Протокол 15.3.  Окрашивание кристаллвиолетом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  286

15.5.3. 
Культуральные сосуды для цитологии: монослойные культуры  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286

15.5.4. 
Приготовление суспензионной культуры для 
цитологии  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286
Протокол 15.4.  Подготовка суспензионной 
культуры клеток для цитологических 
исследований методом цитоцентрифугирования  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287

Протокол 15.5.  Фильтрационная цитология  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288

15.5.5. 
Микрофотография  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288
Протокол 15.6.  Цифровая 
фотография 
на микроскопе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289

15.6. 
Конфокальная микроскопия . . . . . . . . . . 289

15.7. 
Хромосомный состав . . . . . . . . . . . . . . . . . 290
Протокол 15.7.  Приготовление хромосомного препарата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290

15.7.1. 
Дифференциальное окрашивание хромосом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292

15.7.2. 
Хромосомный анализ  . . . . . . . . . . . . . . . . . 293

15.8. 
Анализ ДНК  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293

15.8.1. 
Гибридизация ДНК  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293

15.8.2. 
Фингерпринтинг ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . 293

15.8.3. 
Анализ профиля ДНК  . . . . . . . . . . . . . . . . . 294
Протокол 15.8.  Анализ STR-профиля ДНК 
клеточных линий  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296

15.9. 
Рнк и экспрессия белка . . . . . . . . . . . . . . . 298

15.10. 
Активность ферментов . . . . . . . . . . . . . . . 298

15.10.1. Изоферменты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 298
15.10.2. Изоферментный электрофорез с набором для 
определения аутентичности Authentikit . . . 300
Протокол 15.9.  Изоферментный анализ . . 300

15.11. 
Антигенные маркеры  . . . . . . . . . . . . . . . . 303

15.11.1. Иммунное окрашивание  . . . . . . . . . . . . . . . 304

Протокол 15.10.  Непрямая иммунофлуоресценция  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304

15.11.2. Иммунный анализ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305
15.12. 
Дифференцировка  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306

Глава 16
ДИФФЕРЕНЦИРОВКА . . . . . . . . . . . . . . . 307

16.1. 
Экспрессия фенотипа in vivo  . . . . . . . . . . 307

16.1.1. 
Дедифференцировка  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307

16.1.2. 
Линейная селекция  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307

16.2. 
Стадии дифференцировки  . . . . . . . . . . . . 307

16.3. 
Пролиферация и дифференцировка . . . . 308

16.4. 
Коммитирование и линии дифференцировки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308

16.5. 
Пластичность стволовых клеток  . . . . . . 309

16.6. 
Маркеры дифференцировки  . . . . . . . . . . 310

16.7. 
Индукция дифференцировки . . . . . . . . . . 311

16.7.1. 
Межклеточные взаимодействия . . . . . . . . . 311

Оглавление

16.7.2. 
Системные факторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313

16.7.3. 
Взаимодействия клетки с матриксом . . . . . 315

16.7.4. 
Полярность и форма клетки  . . . . . . . . . . . . 316

16.7.5. 
Давление кислорода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 316

16.8. 
Дифференцировка и злокачественность  317

16.9. 
Практические аспекты . . . . . . . . . . . . . . . 317

Глава 17
ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318

17.1. 
Роль в характеристике клеточных линий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318

17.2. 
Что такое трансформация?  . . . . . . . . . . . 318

17.3. 
Генетическая нестабильность и гетерогенность  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318

17.3.1. 
Генетическая нестабильность . . . . . . . . . . . 318

17.3.2. 
Хромосомные аберрации . . . . . . . . . . . . . . . 320

17.4. 
Иммортализация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321

17.4.1. 
Контроль физиологического старения . . . . 322

17.4.2. 
Иммортализация с использованием вирусных генов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322

17.4.3. 
Иммортализация человеческих фибробластов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
Протокол 17.1.  Иммортализация фибробластов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324

17.4.4. 
Теломеразоиндуцированная иммортализация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326
Протокол 17.2.  Иммортализация мезенхимальных стволовых клеток человека 
с помощью теломеразы . . . . . . . . . . . . . 327

17.4.5. 
Иммортализация лимфоцитов  . . . . . . . . . . 329

17.4.6. 
Трансгенные мыши  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329

17.5. 
Аберрантный контроль роста  . . . . . . . . . 329

17.5.1. 
Независимость от прикрепления к субстрату . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329

17.5.2. 
Контактное ингибирование . . . . . . . . . . . . . 330
Протокол 17.3.  Ограничение 
клеточной 
пролиферации плотностью суспензии . 330

17.5.3. 
Зависимость от сыворотки  . . . . . . . . . . . . . 331

17.5.4. 
Онкогены . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332

17.6. 
Туморогенность  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332

17.6.1. 
Малигнизация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332

17.6.2. 
Опухолевая трансплантация . . . . . . . . . . . . 333

17.6.3. 
Инвазивность  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333

17.6.4. 
Ангиогенез  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334
Протокол 17.4.  Исследование ангиогенеза 
in vitro  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335

17.6.5. 
Активатор плазминогена . . . . . . . . . . . . . . . 337

Глава 18
КОНТАМИНАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338

18.1. 
Источники контаминации  . . . . . . . . . . . . 338

18.1.1. 
Техника работы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338

18.1.2. 
Окружающая среда  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338

18.1.3. 
Использование и обслуживание ламинарного шкафа  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338

18.1.4. 
Инкубаторы с увлажнением  . . . . . . . . . . . . 341
Протокол 18.1.  Обработка инкубаторов . 341

18.1.5. 
Холодильные камеры . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342

18.1.6. 
Стерильные материалы . . . . . . . . . . . . . . . . 342

18.1.7. 
Доставленные клеточные линии и образцы биопсии  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342

18.1.8. 
Карантин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342

18.2. 
Виды микробной контаминации  . . . . . . 342

18.3. 
Контроль контаминации  . . . . . . . . . . . . . 342

18.3.1. 
Визуально определяемая микробная контаминация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343

18.3.2. 
Микоплазмы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343

18.3.3. 
Флуоресцентное окрашивание микоплазм  345
Протокол 18.2.  Выявление микоплазм методом флуоресценции  . . . . . . . . . . . . . . 345

18.3.4. 
Использование PCR для обнаружения микоплазм  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 346
Протокол 18.3.  Использование PCR для обнаружения микоплазм  . . . . . . . . . . . . . . 346

18.3.5. 
Альтернативные методы детекции микоплазм  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 348

18.3.6. 
Сервисные службы по обнаружению микоплазм  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350

18.3.7. 
Вирусная контаминация  . . . . . . . . . . . . . . . 350

18.4. 
Уничтожение контаминированных культур . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350

18.5. 
Устранение контаминации . . . . . . . . . . . . 350

18.5.1. 
Бактерии, грибы и дрожжи  . . . . . . . . . . . . . 350
Протокол 18.4.  Устранение 
микробной 
контаминации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350

18.5.2. 
Устранение микоплазм  . . . . . . . . . . . . . . . . 351
Протокол 18.5.  Устранение микоплазменной контаминации  . . . . . . . . . . . . . . . . . 351

18.5.3. 
Устранение вирусной контаминации . . . . . 352

18.5.4. 
Персистирующая контаминация  . . . . . . . . 352

18.6. 
Перекрестная контаминация  . . . . . . . . . 354

18.7. 
Заключение  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354

Глава 19
КРИОКОНСЕРВАЦИЯ  . . . . . . . . . . . . . . . 355

19.1. 
Предпосылки метода замораживания . . 355

19.2. 
Подготовка к криоконсервации  . . . . . . . 355

19.2.1. 
Валидация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356

19.2.2. 
Когда нужно замораживать . . . . . . . . . . . . . 356

19.3. 
Принципы криоконсервации  . . . . . . . . . 356

19.3.1. 
Теоретическое обоснование замораживания клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356

19.3.2. 
Концентрация клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356

19.3.3. 
Среда для замораживания . . . . . . . . . . . . . . 356

19.3.4. 
Скорость охлаждения  . . . . . . . . . . . . . . . . . 357

19.3.5. 
Ампулы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359

19.3.6. 
Криоморозильники  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359

19.3.7. 
Замораживание культивируемых клеток . . 362
Протокол 19.1.  Замораживание клеток . . 362

19.3.8. 
Протоколирование работы морозильника . 364

19.3.9. 
Размораживание хранившихся ампул  . . . . 364
Протокол 19.2.  Размораживание клеток . 364

19.3.10. Флаконы для замораживания  . . . . . . . . . . . 367
19.4. 
Витрификация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367

19.4.1. 
Криоконсервация эмбриональных стволовых клеток человека (hES)  . . . . . . . . . . . . . 367
Протокол 19.3.  Криоконсервация 
hESклеток путем витрификации . . . . . . . . 367

Оглавление 
11

19.4.2. 
Размораживание hES-клеток . . . . . . . . . . . . 368
Протокол 19.4.  Размораживание 
hESклеток, криоконсервированных путем 
витрификации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 368

19.5. 
Дизайн и контроль замороженных запасов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 369

19.5.1. 
Инвентарный контроль морозильника . . . . 369

19.5.2. 
Периодическая замена запасов культур . . . 370

19.6. 
Банки клеток  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 370

19.7. 
Транспортировка клеточных культур . . 371

19.7.1. 
Замороженные ампулы  . . . . . . . . . . . . . . . . 371

19.7.2. 
Живые культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371

Глава 20
КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ  . . . . . . . 373

20.1. 
Подсчет клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373

20.1.1. 
Гемоцитометр . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 374
Протокол 20.1.  Подсчет клеток при помощи гемоцитометра  . . . . . . . . . . . . . . 374

20.1.2. 
Электронный счетчик  . . . . . . . . . . . . . . . . . 377
Протокол 20.2.  Электронный 
подсчет 
клеток на основе электрического сопротивления  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 378

20.1.3. 
Окрашенные монослои  . . . . . . . . . . . . . . . . 380

20.1.4. 
Проточная цитометрия  . . . . . . . . . . . . . . . . 380

20.2. 
Вес клеток  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381

20.3. 
Содержание ДНК  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382
Протокол 20.3.  Оценка содержания ДНК 
с использованием красителя Hoechst 
33258  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382

20.4. 
Белок . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382

20.4.1. 
Солюбилизация образца  . . . . . . . . . . . . . . . 382

20.4.2. 
Метод исследования белка по Брэдфорду . 382
Протокол 20.4.  Оценка содержания белка 
методом Брэдфорда . . . . . . . . . . . . . . . . 382

20.5. 
Скорость синтеза  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384

20.5.1. 
Синтез ДНК  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384
Протокол 20.5.  Оценка уровня синтеза ДНК 
методом включения [3Н]-тимидиновой 
метки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 384

20.5.2. 
Синтез белка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 385
Протокол 20.6.  Синтез белка . . . . . . . . . . . 385

20.6. 
Приготовление образцов для ферментного и иммуноферментного анализа  . . . 386

20.7. 
Цитометрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386

20.7.1. 
Мечение in situ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 386

20.7.2. 
Проточная цитометрия  . . . . . . . . . . . . . . . . 386

20.8. 
Репликация образцов  . . . . . . . . . . . . . . . . 386

20.8.1. 
Сбор данных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387

20.8.2. 
Анализ данных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 387

20.9. 
Клеточная пролиферация . . . . . . . . . . . . . 387

20.9.1. 
Разработка эксперимента  . . . . . . . . . . . . . . 387

20.9.2. 
Цикл роста  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 389
Протокол 20.7.  Кривая роста монослоя 
во флаконах . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 391

Протокол 20.8.  Кривая роста монослоя 
в многолуночном планшете . . . . . . . . . . 391

20.9.3. 
Анализ кривых роста монослоя  . . . . . . . . . 392

20.9.4. 
Объем среды, концентрация и плотность клеток  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393

20.9.5. 
Суспензионные культуры  . . . . . . . . . . . . . . 394
Протокол 20.9.  Кривая роста суспензионной культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394

20.9.6. 
Фазы цикла роста . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 394

20.9.7. 
Производные кривой роста . . . . . . . . . . . . . 395

20.10. 
Эффективность культивирования . . . . . 396
Протокол 20.10.  Определение эффективности посева на чашки Петри  . . . . . . . 397

20.10.1. Анализ формирования колоний  . . . . . . . . . 399
20.10.2. Автоматический счетчик колоний . . . . . 399
20.11. 
Индекс мечения  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 399
Протокол 20.11.  Индекс мечения [3Н]-тими ди ном . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 400

20.11.1. Ростовая фракция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 401

Протокол 20.12.  Определение фракции пролиферирующих клеток . . . . . . . . . . . . . . 401

20.11.2. Митотический индекс  . . . . . . . . . . . . . . . . . 401
20.11.3. 
Индекс пролиферации . . . . . . . . . . . . . . . . 401

20.12. 
Время клеточного цикла  . . . . . . . . . . . . . 402

20.13. 
Миграция клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402

Глава 21
ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ . . . . . . . . . . . . . . . 403

21.1. 
Жизнеспособность, токсичность и выживаемость  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 403

21.2. 
Ограничения in vitro  . . . . . . . . . . . . . . . . . 404

21.2.1. 
Фармакокинетика . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 404

21.2.2. 
Метаболизм . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 404

21.2.3. 
Тканевой и системный ответы  . . . . . . . . . . 404

21.3. 
Характер исследований  . . . . . . . . . . . . . . 404

21.3.1. 
Жизнеспособность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 405
Протокол 21.1.  Оценка жизнеспособности 
методом отторжения красителя  . . . . 405

Протокол 21.2.  Оценка жизнеспособности 
методом поглощения красителя  . . . . . 405

21.3.2. 
Выживаемость  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 406
Протокол 21.3.  Клоногенный анализ прикрепленных клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . 406

21.3.3. 
Анализ, основанный на клеточной пролиферации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 410

21.3.4. 
Метаболический анализ цитотоксичности  410

21.3.5. 
Микротитрационный анализ . . . . . . . . . . . . 410
Протокол 21.4.  Оценка цитотоксичности 
при помощи МТТ-теста  . . . . . . . . . . . . 411

21.3.6. 
Сравнительная оценка микротитрационного 
и клоногенного анализа выживания . . . . . . 414

21.3.7. 
Взаимодействие лекарственных препаратов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415

21.4. 
Применение исследования цитотоксичности . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 415

22.4.1. 
Скрининг противораковых препаратов  . . . 415

21.4.2. 
Прогностические исследования противоопухолевых препаратов . . . . . . . . . . . . . . . . 415

21.4.3. 
Фармацевтическое тестирование  . . . . . . . . 416

21.5. 
Генотоксичность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416

Оглавление

21.5.1. 
Анализ мутагенеза методом обмена сестринских хроматид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416
Протокол 21.5.  Обмен сестринских хроматид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 416

21.5.2. 
Канцерогенность  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 418

21.6. 
Воспаление  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 419

Глава 22
КУЛЬТУРЫ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ КЛЕТОК  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420

22.1. 
Клеточные культуры специализированных клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 420

22.2. 
Эпителиальные клетки  . . . . . . . . . . . . . . 422

22.2.1. 
Эпидермис  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423
Протокол 22.1.  Эпидермальные кератиноциты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 424

22.2.2. 
Роговица  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 427
Протокол 22.2.  Эпителиальные 
клетки 
роговицы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 427

22.2.3. 
Молочная железа  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 429
Протокол 22.3.  Получение эпителиальных 
клеток молочной железы из тканей, 
отобранных при маммопластике . . . . . 429

22.2.4. 
Шейка матки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 431
Протокол 22.4.  Цервикальный эпителий  . 431

22.2.5. 
Желудочно-кишечный тракт . . . . . . . . . . . . 433
Протокол 22.5.  Выделение и культивирование клеток крипт толстого кишечника  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433

22.2.6. 
Печень . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 434

22.2.7. 
Первичная культура гепатоцитов . . . . . . . . 434
Протокол 22.6 А. Выделение гепатоцитов 
крысы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 435

22.2.8. 
Гепатоциты человека HepaRG  . . . . . . . . . . 436
Протокол 22.6 Б. Очистка гепатоцитов человека HepaRG  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 437

22.2.9. 
Поджелудочная железа  . . . . . . . . . . . . . . . . 438
Протокол 22.7.  Эпителий 
поджелудочной железы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 438

22.2.10. Почка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 439

Протокол 22.8.  Эпителий почки  . . . . . . . . 440

22.2.11. Бронхиальный и трахеальный эпителий  . . 441

Протокол 22.9.  Бронхиальный и трахеальный эпителий  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 441

22.2.12. Эпителий ротовой полости . . . . . . . . . . . . . 442

Протокол 22.10.  Кератиноциты ротовой 
полости . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442

22.2.13. Простата  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 443

Протокол 22.11.  Эпителий простаты  . . . 444

22.3. 
Мезенхимальные клетки  . . . . . . . . . . . . . 445

22.3.1. 
Соединительная ткань . . . . . . . . . . . . . . . . . 445

22.3.2. 
Жировая ткань  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 445
Протокол 22.12.  Первичная культура адипоцитов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 446

22.3.3. 
Мышцы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 447
Протокол 22.13.  Выделение и культивирование гладкомышечных клеток . . . . . . . 447

Протокол 22.14.  Культура 
миобластов 
взрослой скелетной мышцы  . . . . . . . . . 448

Протокол 22.15.  Культура 
отдельного 
мышечного волокна скелетной мышцы  450

22.3.4. 
Хрящи  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451
Протокол 22.16.  Хондроциты на альгинатных бусинах . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 451

22.3.5. 
Кости . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453
Протокол 22.17.  Остеобласты  . . . . . . . . . 454

22.3.6. 
Эндотелий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 455
Протокол 22.18.  Выделение и культивирование клеток сосудистого эндотелия  . 455

22.4. 
Нейроэктодермальные клетки  . . . . . . . . 459

22.4.1. 
Нейроны  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 459
Протокол 22.19.  Выделение и культивирование тучных клеток мозжечка . . . . . . 459

22.4.2. 
Глиальные клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 460
Протокол 22.20.  Первичная 
культура 
астроцитов человека . . . . . . . . . . . . . . . 461

Протокол 22.21.  Обонятельные клетки . . 463

22.4.3. 
Эндокринные клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465

22.4.4. 
Меланоциты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 465
Протокол 22.22.  Культура меланоцитов  . 466

22.5. 
Гематопоэтические клетки . . . . . . . . . . . . 467

22.6. 
Гонады  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469

22.6.1. 
Яичники  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469

22.6.2. 
Тестикулы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 469

Глава 23
СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ, ГАМЕТЫ И АМНИОЦИТЫ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 470

23.1. 
Стволовые клетки  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 470

23.1.1. 
Эмбриональные стволовые клетки . . . . . . . 470

23.1.2. 
Происхождение эмбриональных стволовых клеток мыши . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 470
Протокол 23.1.  Получение и первичное 
культивирование эмбриональных стволовых клеток мыши . . . . . . . . . . . . . . . . 471

23.1.3. 
Субкультура и размножение эмбриональных 
стволовых клеток мыши  . . . . . . . . . . . . . . . 474
Протокол 23.2.  Размножение 
эмбриональных стволовых клеточных линий 
мыши  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 474

23.1.4. 
Первичная культура эмбриональных стволовых клеток человека   . . . . . . . . . . . . . . . . 476
Протокол 23.3.  Получение эмбриональных 
стволовых клеток человека . . . . . . . . . . 476

23.1.5. 
Пересадка hES-клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . 477
Протокол 23.4.  Пересадка hES-клеток . . . 477

23.1.6. 
Плюрипотентные стволовые клетки из эмбрионов рыбы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 478
Протокол 23.5.  Культуры клеток эмбриона 
данио-рерио . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 479

23.2. 
Половые клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 481

23.3. 
Экстраэмбриональные клетки  . . . . . . . . 481

23.3.1. 
Культура амниоцитов . . . . . . . . . . . . . . . . . . 481
Протокол 23.6.  Культура амниоцитов  . . . 482

23.3.2. 
Неонатальные и ювенильные клетки . . . . . 485

23.3.3. 
Мультипотентные стволовые клетки взрослых   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 485

23.3.4. 
MSC из костного мозга человека  . . . . . . . . 486

Оглавление 
13

Протокол 23.7.  Получение MSC из костного мозга человека  . . . . . . . . . . . . . . . . 487

23.3.5. 
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 488
Протокол 23.8.  Перепрограммирование 
человеческих дермальных фибробластов 
для генерации плюрипотентных стволовых клеток  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 489

23.3.6. 
Долгоживущие культуры костного мозга 
мыши . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 491
Протокол 23.9.  Долгоживущие гематопоэтические клеточные культуры из костного мозга мыши  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 491

23.3.7. 
Долгоживущие культуры человеческих примитивных гематопоэтических клеток  . . . . 493
Протокол 23.10.  Исследование инициирующих долгоживущую культуру человеческих клеток (LTC-IC) . . . . . . . . . . . . . . . 493

23.3.8. 
Исследование гематопоэтических колониеобразующих клеток  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 496
Протокол 23.11.  Исследование гематопоэтических колониеобразующих клеток  . 496

Глава 24
КУЛЬТУРА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК . . 499

24.1. 
Проблемы культивирования опухолевых 
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 499

24.2. 
Получение образцов . . . . . . . . . . . . . . . . . . 500

24.2.1. 
Селекция репрезентативных клеток . . . . . . 500

24.2.2. 
Сохранение тканей замораживанием . . . . . 500
Протокол 24.1.  Замораживание образцов 
биопсии  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 500

24.3. 
Дезагрегация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 501

24.4. 
Первичная культура  . . . . . . . . . . . . . . . . . 501

24.5. 
Селективная культура опухолевых клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502

24.5.1. 
Селективные среды  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502

24.5.2. 
Конфлюэнтные фидерные слои  . . . . . . . . . 502
Протокол 24.2.  Рост на конфлюэнтных 
фидерных слоях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 503

24.5.3. 
Суспензионное клонирование  . . . . . . . . . . 505

24.5.4. 
Ксенотрансплантаты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505

24.6. 
Размножение клеточных линий  . . . . . . . 505

24.6.1. 
Субкультивирование первичной опухолевой культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 505

24.6.2. 
Постоянные клеточные линии  . . . . . . . . . . 506

24.7. 
Характеристика культур опухолевых клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 506

24.7.1. 
Гетерогенность опухолевых культур  . . . . . 506

24.7.2. 
Гистотипическая культура . . . . . . . . . . . . . . 507

24.8. 
Специфические опухолевые культуры  . 507

24.8.1. 
Молочная железа  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 507
Протокол 24.3.  Культивирование клеток 
опухоли молочной железы  . . . . . . . . . . . 508

24.8.2. 
Легкое  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 509

24.8.3. 
Желудок . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 509

24.8.4. 
Толстый кишечник . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 509
Протокол 24.4.  Культура колоректальных 
опухолей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 510

24.8.5. 
Поджелудочная железа  . . . . . . . . . . . . . . . . 512

24.8.6. 
Яичники  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 512

24.8.7. 
Простата  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513

24.8.8. 
Мочевой пузырь . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513

24.8.9. 
Кожа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513

24.8.10. Шейка матки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513
24.8.11. Глиома . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514
24.8.12. Нейробластома . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514
24.8.13. Сперматоцитома . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514
24.8.14. Лимфома и лейкемия . . . . . . . . . . . . . . . . . . 514

Протокол 24.5.  Определение постоянных 
клеточных линий лейкемии и лимфомы  515

Глава 25
ТРЕХМЕРНАЯ КУЛЬТУРА  . . . . . . . . . . . 516

25.1. 
Межклеточное взаимодействие и фенотипическая экспрессия . . . . . . . . . . . . . . . 516

25.1.1. 
Роль плотности клеточной суспензии  . . . . 516

25.1.2. 
Реципрокные взаимодействия  . . . . . . . . . . 516

25.1.3. 
Выбор моделей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 517

25.2. 
Органная культура  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 517

25.2.1. 
Обмен питательных веществ и газов . . . . . 517

25.2.2. 
Структурная целостность  . . . . . . . . . . . . . . 519

25.2.3. 
Рост и дифференцировка . . . . . . . . . . . . . . . 519

25.2.4. 
Ограничения метода органной культуры . . 519

25.2.5. 
Типы органных культур . . . . . . . . . . . . . . . . 520
Протокол 25.1.  Органная культура . . . . . . 520

25.3. 
Гистотипическая культура . . . . . . . . . . . . 521

25.3.1. 
Метод геля и губки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 521

25.3.2. 
Полые волокна  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 522

25.3.3. 
Сфероиды  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 522
Протокол 25.2.  3D-культуры в сфероидах   523

25.3.4. 
Система вращающихся камер . . . . . . . . . . . 525

25.3.5. 
Иммобилизация живых клеток в альгинате  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 525

25.3.6. 
Фильтрационные вкладыши для лунок . . . 526
Протокол 25.3.  Фильтрационные 
вкладыши для лунок . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 526

25.3.7. 
Культуры нейрональных агрегатов . . . . . . . 528
Протокол 25.4.  Нейрональные агрегаты  . 528

25.4. 
Органотипическая культура . . . . . . . . . . 529

25.4.1. 
Тканевые эквиваленты . . . . . . . . . . . . . . . . . 529

25.4.2. 
Тканевая инженерия  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 529

25.5. 
Создание трехмерных изображений клеток (3D-реконструкций)  . . . . . . . . . . . . . . 531

Глава 26
УВЕЛИЧЕНИЕ ПРОИЗВОДСТВА КЛЕТОК 
И АВТОМАТИЗАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . 532

26.1. 
Увеличение производства суспензионных 
культур . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 532
Протокол 26.1.  Перемешивание 4-литровой 
партии суспензионной культуры  . . . . . 533

26.1.1. 
Постоянная культура  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 535

26.1.2. 
Масштаб и сложности . . . . . . . . . . . . . . . . . 536

26.1.3. 
Перемешивание и аэрация  . . . . . . . . . . . . . 536

26.2. 
Крупномасштабное производство монослойных культур  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 539

26.2.1. 
Мультиповерхностные культиваторы  . . . . 539

Оглавление

Протокол 26.2.  Система 
Nunc 
Cell 
Factory . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 539

26.2.2. 
Роллерные культуры  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 542
Протокол 26.3.  Культура в роллерных бутылях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 542

26.2.3. 
Микроносители  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 544
Протокол 26.4.  Микроносители . . . . . . . . . 544

26.2.4. 
Крупные микроносители . . . . . . . . . . . . . . . 546

26.2.5. 
Перфузионные монослойные культуры . . . 546

26.3. 
Управление процессом  . . . . . . . . . . . . . . . 547

26.4. 
Автоматизация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 549

26.4.1. 
Роботизированная система культуры клеток   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  550

26.4.2. 
Высокопроизводительный скрининг  . . . . . 550

Глава 27
СПЕЦИАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ  . . . . . . . . . . 551

27.1. 
Методы подготовки и исследования лимфоцитов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 551

27.1.1. 
Выделение по плотности . . . . . . . . . . . . . . . 551
Протокол 27.1.  Подготовка 
препарата 
лимфоцитов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 551

27.1.2. 
Бласттрансформация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552
Протокол 27.2. РНА-стимуляция лимфоцитов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552

27.2. 
Авторадиография . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552
Протокол 27.3.  Микроавторадиография  . 554

27.3. 
Съемка в режиме замедленного времени  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 557
Протокол 27.4.  Видеосъемка в режиме замедленного времени  . . . . . . . . . . . . . . . . 557

27.4. 
Синхронизация клеток . . . . . . . . . . . . . . . 559

27.4.1. 
Разделение клеток  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 559

27.4.2. 
Блокирование пролиферации  . . . . . . . . . . . 559

27.5. 
Культуры клеток пойкилотермных животных  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 559

27.5.1. 
Клетки рыб  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 560

27.5.2. 
Клетки насекомых  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 560
Протокол 27.5.  Культивирование клеток 
насекомых  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 560

27.6. 
СЛИЯНИЕ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 561

27.6.1. 
Клеточная гибридизация . . . . . . . . . . . . . . . 561
Протокол 27.6.  Клеточная гибридизация . 561

27.6.2. 
Ядерный перенос . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 563

27.7. 
Продукция моноклональных антител . . 563
Протокол 27.7.  Продукция моноклональных антител . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 564

Глава 28
ТРЕНИРОВОЧНЫЕ ПРОГРАММЫ . . . . 567

28.1. 
Цели и задачи главы  . . . . . . . . . . . . . . . . . 567

28.2. 
Навыки препаративных работ и обращения с оборудованием  . . . . . . . . . . . . . . . . . 567
Упражнение 1.  Стерильное пипетирование 
и перенос жидкостей . . . . . . . . . . . . . . . 569

Упражнение 2.  Мытье и стерилизация 
стеклянной посуды . . . . . . . . . . . . . . . . . 571

Упражнение 3.  Приготовление и стерилизация воды   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 572

Упражнение 4.  Приготовление и стерилизация фосфатного буферного раствора 
Дульбекко (D-PBS) без Ca2+ и Mg2+ 
(D-PBSА)  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 573

Упражнение 5.  Приготовление стандартных рН-растворов  . . . . . . . . . . . . . . . . . 574

Упражнение 6.  Приготовление основной 
питательной среды из порошка и стерилизация методом фильтрования  . . . 575

28.3. 
Основные методы работы с культурой 
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 577
Упражнение 7.  Наблюдение за культурой 
клеток  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 577

Упражнение 8.  Приготовление стерильной 
питательной среды  . . . . . . . . . . . . . . . . 579

Упражнение 9.  Смена среды в монослойной культуре  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 580

Упражнение 10.  Приготовление 
полной 
среды из концентрата 10×  . . . . . . . . . . 582

Упражнение 11.  Подсчет клеток с помощью гемоцитометра и электронного 
счетчика  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 584

Упражнение 12.  Субкультивирование клеток, растущих в суспензии  . . . . . . . . . . 587

Упражнение 13.  Субкультивирование клеточных линий, растущих в монослое . . 589

Упражнение 14.  Окрашивание монослойной клеточной культуры по Гимзе . . . . 591

Упражнение 15.  Построение и анализ кривой роста  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 592

28.4. 
Упражнения повышенной сложности  . . 595
Упражнение 16.  Характеристика клеточных линий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 595

Упражнение 17.  Обнаружение микоплазм  596
Упражнение 18.  Криоконсервация культивируемых клеток  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 597

Упражнение 19.  Первичная культура . . . . 600
Упражнение 20.  Клонирование 
клеток, 
растущих в монослое . . . . . . . . . . . . . . . 604

28.5. 
Специализированные упражнения  . . . . 606

Глава 29
РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМ  . . . . . . . . . . . . . . . 607

29.1. 
Аномальный внешний вид клеток . . . . . 607

29.2. 
Медленный рост клеток  . . . . . . . . . . . . . . 608

29.2.1. 
Проблемы, ограниченные вашими собственными культурами  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 608

29.2.2. 
Более общие проблемы. Проблемы, с которыми столкнулись другие исследователи  . 608

29.3. 
Среда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 610

29.3.1. 
Состав, приготовление и хранение . . . . . . . 610

29.3.2. 
Нестабильные реагенты  . . . . . . . . . . . . . . . 612

29.3.3. 
Чистота компонентов среды  . . . . . . . . . . . . 612

29.4. 
Субстраты и контейнеры . . . . . . . . . . . . . 613

29.5. 
Микробиологическая контаминация  . . 614

29.5.1. 
Контаминация, ограниченная одним исследователем  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 614

29.5.2. 
Широко распространенная контаминация  616

Оглавление 
15

29.5.3. 
Системы подачи воздуха и ламинарные 
боксы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 618

29.5.4. 
Специфическая контаминация  . . . . . . . . . . 618

29.6. 
Химическое загрязнение . . . . . . . . . . . . . . 619

29.6.1. 
Стекло . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 619

29.6.2. 
Пипетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 619

29.6.3. 
Система очистки воды . . . . . . . . . . . . . . . . . 620

29.6.4. 
Криоконсерванты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 620

29.6.5. 
Порошки и аэрозоли  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 620

29.7. 
Первичная культура  . . . . . . . . . . . . . . . . . 620

29.7.1. 
Недостаточное количество взятых клеток 
в первичной культуре . . . . . . . . . . . . . . . . . . 620

29.7.2. 
Неправильная селекция клеток . . . . . . . . . . 622

29.7.3. 
Контаминация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 622

29.8. 
Дифференцировка  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 622

29.9. 
Питание культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 623

29.9.1. 
Простые монослойные культуры  . . . . . . . . 623

29.9.2. 
Клонирование клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 623

29.10. 
Субкультура  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 624

29.10.1. Недостаточное количество взятых клеток 
или медленный рост  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 624

29.10.2. Неравномерное развитие культуры  . . . . . . 624
29.11. 
Клонирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 625

29.11.1. Слишком мало колоний в чашке . . . . . . . . . 625
29.11.2. Слишком много колоний в чашке . . . . . . . . 626
29.11.3. Неравномерное распределение . . . . . . . . . . 627
29.12. 
Перекрестная контаминация и неверная 
идентификация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 627

29.13. 
Криоконсервация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 628

29.13.1. Плохое восстановление . . . . . . . . . . . . . . . . 628

29.13.2. Измененный внешний вид после криоконсервации  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 629

29.13.3. Потеря ростовой культуры  . . . . . . . . . . . . . 629
29.14. 
Подсчет клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 630

29.14.1. Гемоцитометр . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 630
29.14.2. Электронный счетчик с измерением сопротивления в капилляре . . . . . . . . . . . . . . . . . . 630

Глава 30
ЗАКЛЮЧЕНИЕ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 631

Приложение I
РАСЧЕТЫ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ РЕАКТИВОВ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 632

Приложение II
ИСТОЧНИКИ ОБОРУДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛОВ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 640

Приложение III
КОМПАНИИ-ПОСТАВЩИКИ И ДРУГИЕ РЕСУРСЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 664

Приложение IV
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ [по Schaeff er, 1990]  677

Приложение V
КОНТАМИНИРОВАННЫЕ ИЛИ НЕПРАВИЛЬНО ИДЕНТИФИЦИРОВАННЫЕ 
КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ  . . . . . . . . . . . . . . . 684

Приложение VI
ОСНОВНАЯ ЛИТЕРАТУРА  . . . . . . . . . . . 707

Список литературы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 709
Предметный указатель  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 758

Список иллюстраций

Рис. 1.1. 
Рост количества публикаций по культуре 
 ткани 30

Рис. 1.2. 
Области применения культуры ткани 34

Рис. 1.3. 
Типы клеточных культур 39

Рис. 2.1. 
Клеточная адгезия 42

Рис. 2.2. 
Межклеточные контакты 43

Рис. 2.3. 
Рост клеток А549 на Matrigel  44

Рис. 2.4. 
Клеточный цикл 45

Рис. 2.5. 
Дифференцировка и пролиферация 47

Рис. 2.6. 
Дифференцировка из стволовых клеток 48

Рис. 2.7. 
Коммитирование и реверсивность 50

Рис. 2.8. 
Клеточное взаимодействие и передача сигнала 51

Рис. 2.9. 
Развитие клеточной линии 53

Рис. 2.10. 
Количество хромосом в клетках конечной и постоянной клеточных линий 55

Рис. 3.1. 
Небольшая лаборатория для работы с культурой 
ткани 56

Рис. 3.2. 
Лаборатория средних размеров для работы 
с культурой ткани 57

Рис. 3.3. 
Лаборатория для работы с культурой ткани 
с прилежащими препаративными комнатами 58

Рис. 3.4. 
Большая лаборатория для работы с культурой 
ткани 59

Рис. 3.5. 
Баланс воздушного давления 60

Рис. 3.6. 
Термальная комната 64

Рис. 3.7. 
Раковина для мойки и моечная машина для пипеток  67

Рис. 3.8. 
Хранилище для жидкого азота и морозильное 
оборудование 68

Рис. 4.1. 
Ламинарный шкаф 73

Рис. 4.2. 
Пипетирующее устройство 75

Рис. 4.3. 
Пипетторы 76

Рис. 4.4. 
Градуированный бутылочный дозатор 77

Рис. 4.5. 
Шприцевые дозаторы 77

Рис. 4.6. 
Автоматические дозаторы 77

Рис. 4.7. 
Заполняющее и считывающее устройства для 
планшетов 78

Рис. 4.8. 
Устройство для переноса 78

Рис. 4.9. 
Аспирация среды 79

Рис. 4.10. 
Инвертированный микроскоп 80

Рис. 4.11. 
Культуральные камеры 81

Рис. 4.12. 
CO2-инкубатор 82

Рис. 4.13. 
Устройство СО2-инкубатора 82

Рис. 4.14. 
Моечная машина для стекла 84

Рис. 4.15. 
Очиститель воды 85

Рис. 4.16. 
Настольный автоклав 87

Рис. 4.17. 
Напольный автоклав 87

Рис. 4.18. 
Пробирки 88

Рис. 5.1. 
Возможность заражения 92

Рис. 5.2. 
Рабочая зона лаборатории культуры ткани 93

Рис. 5.3. 
Воздушные потоки в ламинарном шкафу 94

Рис. 5.4. 
Расположение оборудования в рабочей зоне ламинарного шкафа 95

Рис. 5.5. 
Планировка рабочей зоны в ламинарном шкафу 
с горизонтальным воздушным потоком 96

Рис. 5.6. 
Планировка рабочей зоны на открытом столе  97

Рис. 5.7. 
Способ удерживания груши и крышки от флакона в руке 98

Рис. 5.8. 
Стакан для отходов 100

Рис. 5.9. 
Введение пипетки в пипетирующее устройство 101

Рис. 5.10. 
Наклоняющиеся флаконы 101

Рис. 5.11. 
Чашки Петри в коробке 103

Рис. 5.12. 
Заполнение флакона газом 104

Рис. 6.1. 
Переполненный цилиндр для использованных 
пипеток  108

Рис. 6.2. 
Безопасное введение пипетки в пипетирующее 
устройство 110

Рис. 6.3. 
Хомут для баллона 111

Рис. 6.4. 
Колба для спиртовой стерилизации инструментов 112

Рис. 6.5. 
Ламинарный шкаф биологической безопасности 114

Рис. 7.1. 
Морфология фидерных слоев 127

Рис. 7.2. 
Количество клеток и площадь поверхности 128

Рис. 7.3. 
Многолуночные планшеты 128

Рис. 7.4. 
Чашки Петри 129

Рис. 7.5. 
Пластиковые флаконы 129

Рис. 7.6. 
Многопластинчатый флакон  129

Рис. 7.7. 
Флаконы с перемешиванием  131

Рис. 7.8.  
Вентилируемые чашки Петри и флаконы 132

Рис. 7.9. 
Пузырьки и флаконы с закручивающимися 
крышками 132

Рис. 7.10. 
Случайный рост 133

Рис. 7.11. 
Культивирование на полых волокнах  133

Рис. 8.1. 
Буферное действие HEPES и бикарбоната 138

Рис. 8.2. 
Осмометр фирмы Löser 139

Рис. 10.1. 
Действие влажности на температуру в автоклаве 167

Рис. 10.2. 
Мытье 
и 
стерилизация 
лабораторного 
стекла 170

Рис. 10.3. 
Стерилизованные бутыли с крышками 172

Рис. 10.4. 
Сифонное моющее устройство для пипеток 173

Рис. 10.5. 
Мытье и стерилизация пипеток  174

Рис. 10.6. 
Полуавтоматическое устройство для затыкания 
пипеток ватными пробками (Bellco) 174

Рис. 10.7. 
Стерилизационный шкаф 175

Список иллюстраций 
17

Рис. 10.8. 
Упаковка закручивающихся крышек для стерилизации 176

Рис. 10.9. 
Очистка воды 176

Рис. 10.10. Стерилизация фильтрацией 186
Рис. 10.11. Одноразовые стерилизационные фильтры  187
Рис. 10.12. Фильтрация при помощи перистальтического 
насоса 188

Рис. 10.13. Крупномасштабный 
фильтрующий 
комплект 189

Рис. 10.14. Варианты стерилизации фильтрацией 191
Рис. 10.15. Фильтры многократного использования 192
Рис. 10.16. Предварительная фильтрация 195
Рис. 11.1. 
Общий вес и выход клеток мышиного эмбриона 200

Рис. 11.2. 
Мышиные эмбрионы 200

Рис. 11.3. 
Препарирование мыши 202

Рис. 11.4. 
Извлечение куриного эмбриона из яйца 205

Рис. 11.5. 
Варианты первичной культуры 207

Рис. 11.6. 
Культура первичного эксплантата  209

Рис. 11.7. 
Дезагрегация в теплом трипсине 210

Рис. 11.8. 
Клеточное сито  211

Рис. 11.9. 
Дезагрегация в холодном трипсине 212

Рис. 11.10. Теплая и холодная трипсинизация  214
Рис. 11.11. Препарирование куриного эмбриона 216
Рис. 11.12. Дезагрегация ткани с помощью коллагеназы  218

Рис. 11.13. Механическая дезагрегация 219
Рис. 12.1. 
Поврежденные клетки  230

Рис. 12.2. 
Кривая роста и поддержание культуры 234

Рис. 12.3. 
Субкультивирование монослоя  236

Рис. 12.4. 
Серийное субкультивирование 238

Рис. 12.5. 
Перемешиваемая культура 240

Рис. 12.6. 
Клетки HL-60, растущие в суспензии 240

Рис. 12.7. 
Параллельные культуры и антибиотики  242

Рис. 13.1. 
Выход клональных клеток 244

Рис. 13.2. 
Клонирование с помощью разведения  246

Рис. 13.3.  Клонирование в планшетах для микротитрации 247

Рис. 13.4. 
Действие глюкокортикоидов на клонирование 248

Рис. 13.5. 
Фидерные слои 250

Рис. 13.6. 
Клонирование в суспензии 253

Рис. 13.7. 
Клонирование 
в 
метилцеллюлозе 
(Methocel) 254

Рис. 13.8. 
Кольца для клонирования 255

Рис. 13.9. 
Выделение монослойных клонов  256

Рис. 13.10. Выделение суспензионных клонов 258
Рис. 13.11. Суспензия клонов меланомы, фибробластов 
и глии 262

Рис. 13.12. Избыточный рост в смешанной культуре 262
Рис. 14.1. 
Разделение клеток по их плотности  264

Рис. 14.2. 
Устройство для создания градиента 265

Рис. 14.3. 
Градиент, полученный с помощью центрифугирования  265

Рис. 14.4. 
Центрифужный элютриаторный ротор (Beckman 
Coulter) 267

Рис. 14.5. 
Магнитный сортинг 268

Рис. 14.6. 
Магнитный сортинг клеток (MACS® Technology) 269

Рис. 14.7. 
Флуоресцентно-активируемый сортер клеток 
(FACS)  271

Рис. 14.8. 
Проточная цитометрия  271

Рис. 15.1. 
Куполообразные структуры  276

Рис. 15.2. 
Примеры морфологии клеток в культуре 278

Рис. 15.3. 
Культуральные сосуды для цитологии 287

Рис. 15.4. 
Цитоцентрифуга 287

Рис. 15.5. 
Цитологический фильтр 288

Рис. 15.6. 
Приготовление препарата хромосом 291

Рис. 15.7. 
Окрашивание хромосом 292

Рис. 15.8. 
Подготовка кариотипа 294

Рис. 15.9. 
ДНК-фингерпринтинг 295

Рис. 15.10. Секвенирование ДНК 297
Рис. 15.11. Изучение профиля ДНК 299
Рис. 15.12. Изоферментный электрофорез 300
Рис. 15.13. Прибор для иммуноанализа Agilent 305
Рис. 16.1. 
Регуляция дифференцировки 311

Рис. 16.2. 
Реципрокное 
паракринное 
взаимодействие 312

Рис. 17.1. 
Клональные вариации 320

Рис. 17.2. 
Хромосомные аберрации 320

Рис. 17.3. 
Фокусы трансформации 321

Рис. 17.4. 
Совокупное количество времени удвоения 
популяции (PD) иммортализованных клеток 
hTERT 326

Рис. 17.5. 
Ограничение клеточной пролиферации в зависимости от плотности 330

Рис. 17.6. 
Исследование клеток сердца цыпленка 333

Рис. 17.7. 
Инвазия в фильтрующей ячейке 334

Рис. 17.8. 
Исследование ангиогенеза in vitro 336

Рис. 17.9. 
Активатор плазминогена (РА) 336

Рис. 18.1. 
Типы контаминации 344

Рис. 18.2. 
Детекция микоплазм с помощью PCR 348

Рис. 19.1. 
Кривая замораживания 357

Рис. 19.2. 
Ампулы на стержне с изоляцией для медленного 
охлаждения 357

Рис. 19.3. 
Пробка для узкогорлого морозильника 358

Рис. 19.4. 
Охлаждающее устройство Nunc Cooler 358

Рис. 19.5. 
Программируемый морозильник 358

Рис. 19.6. 
Морозильники с жидким азотом  360

Рис. 19.7. 
Конструкция азотного морозильника 361

Рис. 19.8. 
Замораживание клеток 363

Рис. 19.9. 
Размораживание клеток 366

Рис. 19.10. Витрификация 368
Рис. 19.11. Помещение клеток в банк 369
Рис. 19.12. Серийное возобновление культуры 371
Рис. 19.13. Контейнер для транспортировки клеток 372
Рис. 20.1. 
Использование стекла гемоцитометра 375

Рис. 20.2. 
Электронный счетчик клеток CASY 378

Рис. 20.3. 
Схема работы счетчика клеток CASY 378

Рис. 20.4. 
Аналоговая распечатка результатов подсчета 
клеток на электронном счетчике CASY 379

Рис. 20.5. 
Электронный счетчик клеток Beckman Coulter 
Vi-CELL 380

Рис. 20.6. 
Флоуцитометр Accuri C6 381

Рис. 20.7. 
Данные, полученные при помощи проточного 
цитометра Guava 383

Рис. 20.8. 
Кривая роста 389

Рис. 20.9. 
Внешний вид многолуночных планшетов 390

Рис. 20.10. Интерпретация кривой роста 391
Рис. 20.11. Анализ изображения клеточных культур в процессе роста 393

Рис. 20.12. Кривая роста, построенная с помощью Incucyte 394

Рис. 20.13. Плотность насыщения 396
Рис. 20.14. Разведение клеток для клонирования 398
Рис. 20.15. Линейность эффективности посева 399
Рис. 20.16. Автоматический счетчик колоний 400
Рис. 20.17. Индекс мечения 401

Список иллюстраций

Рис. 20.18. Сканирование препаратов или чашек 402
Рис. 20.19. Фракции роста 402
Рис. 21.1. 
Клоногенные исследования прикрепленных 
 клеток 407

Рис. 21.2. 
Кривая выживания 408

Рис. 21.3. 
Интерпретация кривых выживания  408

Рис. 21.4. 
Влияние условий культивирования на долю выживших клеток  409

Рис. 21.5. 
Микротитрационное исследование  411

Рис. 21.6. 
Кривая процентного ингибирования 412

Рис. 21.7. 
Продолжительность исследования 412

Рис. 21.8. 
Кривая времени падения IC50 414

Рис. 21.9. 
Корреляция между микротитрационным и клоногенным методами исследования выживания 415

Рис. 21.10. Органотипическое исследование  419
Рис. 22.1. 
Выделение органоидных структур из ткани молочной железы 430

Рис. 22.2. 
Клетки HepaRG 437

Рис. 22.3. 
Клетки сосудистого эндотелия  457

Рис. 22.4. 
Иссечение обонятельной луковицы. 465

Рис. 22.5. 
Культура меланоцитов  468

Рис. 23.1. 
Эмбриональные стволовые клетки мыши  473

Рис. 23.2. 
Эмбриональные стволовые клетки человека     478

Рис. 23.3. 
Вытянутые кончики стеклянных пастеровских 
пипеток  479

Рис. 23.4. 
MSC, выделенные из костного мозга 488

Рис. 23.5. 
Колонии iPS-клеток 492

Рис. 24.1. 
Конфлюэнтные фидерные слои 503

Рис. 24.2. 
Селективные фидерные слои   504

Рис. 24.3. 
Фракционирование продуктов ферментативного расщепления ткани рака молочной железы 508

Рис. 24.4. 
Клеточные линии карциномы желудка 510

Рис. 24.5. 
Клеточные линии рака поджелудочной железы 512

Рис. 24.6. 
Две культуры клеток из анапластической астроцитомы человека 514

Рис. 25.1. 
Действие клеточной плотности на экспрессию 
GFAP в клетках C6 517

Рис. 25.2. 
Гистотипическая и органотипическая культуры 518

Рис. 25.3. 
Органная культура 519

Рис. 25.4. 
Разделение клеток в сфероидах 523

Рис. 25.5. 
Вращающаяся система камер Heraeus Miniperm 525

Рис. 25.6. 
Вращательная система культуры клеток Synthecon Rotatory Cell Culture System  525

Рис. 25.7. 
Вкладыши в фильтрационную лунку 527

Рис. 25.8. 
Вкладыши Transwells 527

Рис. 25.9. 
Каркасы и матрицы 530

Рис. 25.10. ЯМР конструкта хряща 531
Рис. 26.1. 
Большой флакон для перемешивания 533

Рис. 26.2. 
Перемешиваемая 
культура 
большого 
объема 533

Рис. 26.3. 
Биостат 535

Рис. 26.4. 
Контролируемый биореактор 536

Рис. 26.5. 
Биореакторы для крупного производства 537

Рис. 26.6. 
Волновой биореактор 537

Рис. 26.7. 
Культуральный аэратор BelloCell 538

Рис. 26.8.  Перфузия на полых волокнах  538
Рис. 26.9. 
Многопланшетный флакон Corning HyperFlask  539

Рис. 26.10. Многоповерхностные культиваторы 540
Рис. 26.11. Заполнение системы Nunc Cell Factory 541
Рис. 26.12. Система для культуры клеток Corning CellCube 542

Рис. 26.13. Бутыли для роллерных культур на стеллажах 542

Рис. 26.14. Схема работы роллерной культуры 543
Рис. 26.15. Барабанный роллерный аппарат 543
Рис. 26.16. Микроносители Cytopore 544
Рис. 26.17. Реакторы с неподвижным слоем 546
Рис. 26.18. Биореактор Celligen® 310 547
Рис. 26.19. Системы контроля биореактора 548
Рис. 26.20. ЯМР-анализ клеток 548
Рис. 26.21. Роботизированное культивирование клеток  549
Рис. 27.1. 
Микроавторадиография 553

Рис. 27.2. 
Микрорадиоавтографы 555

Рис. 27.3. 
Гибридизация соматических клеток 562

Рис. 27.4.  Производство гибридом 563
Рис. 28.1. 
Схема 12-луночного планшета 594

Рис. 28.2. 
Варианты упражнения по замораживанию 598

Рис. 29.1. 
Источники контаминации 615

Список цветных вклеек

1. Первичная культура клетки человека
2. Первичная культура, эксплантат, холодная трипсинизация и коллагеназа
3. Первичная культура эмбриона цыпленка, зачаточные органы
4. Фазы ростового цикла
5. Субкультивирование методом трипсинизации
6. Клонирование клеток
7. Клонирование клеток. Морфологическое разнообразие
8. Конечные клеточные линии и канюлирование пупочного 
канатика человека
9. Постоянные клеточные линии из опухолей человека
10. Постоянные клеточные линии из нормальных тканей 
животных
11. Иммунное окрашивание
12. Морфологическая дифференцировка эпителиальных клеток
13. Дифференцировка клеток Friend и глиальных клеток человека
14. Свойства трансформированных клеток
15. Свойства трансформированных клеток

16. Примеры контаминации
17. Жизнеспособность и цитотоксичность
18. Сфероиды, инкапсуляция и микроносители
19. Органотипическая культура на фильтрующих вкладышах 
в лунки
20. Органотипическая культура кожи. (С разрешения HansJürgen Stark.)
21. Токсичность в органотипической модели in vitro
22. Приготовление среды, культуральные системы и флаконы для криоконсервации
23. Магнитно-активированный клеточный сортинг
24. Автоматизированные культуры и анализ
25. Эмбриональные стволовые клетки
26. Ювенильные и зрелые стволовые клетки
27. Дифференцированные клетки человека в первичной 
культуре (1). Культуры после первого или второго субклонирования. Фазовый контраст, объектив ×10. (С разрешения Cell Applications, Inc.)
28. Дифференцированные клетки человека в первичной 
культуре (2). Культуры после первого или второго субклонирования. Фазовый контраст, объектив ×10. (С разрешения Cell Applications, Inc.)

Список протоколов

5.1. 
Асептический метод работы в вертикальном ламинарном 
потоке 100

5.2. 
Работа на открытой поверхности 102

5.3. 
Работа с планшетами и чашками 103

7.1. 
Приготовление ECM 126

8.1. 
Приготовление стандартных буферных растворов 135

10.1. 
Подготовка и стерилизация изделий из стекла 169

10.2. 
Подготовка и стерилизация стеклянных пипеток 173

10.3. 
Подготовка и стерилизация завинчивающихся крышек 175

10.4. 
Стерилизация комплекта фильтров 178

10.5. 
Приготовление и стерилизация сверхчистой воды 
(UPW) 179

10.6. 
Приготовление и стерилизация D-PBSA 181

10.7. 
Приготовление среды из концентрата с кратностью 
1× 182

10.8. 
Приготовление среды из концентрата с кратностью 
10× 182

10.9. 
Приготовление среды из порошка 184

10.10. Приготовление специализированной среды 185
10.11. Стерилизация с использованием фильтрующих насадок 
на шприцы 186

10.12. Стерилизация с использованием фильтрующей вакуумной насадки на колбу 188

10.13. Стерилизация с использованием малого встроенного 
фильтра 189

10.14. Стерилизационная фильтрация с использованием большого прямоточного фильтра 190

10.15. Сбор и стерилизация сывороток 192
10.16. Диализ сывороток 194
11.1. 
Выделение мышиного эмбриона 201

11.2. 
Выделение куриного эмбриона 204

11.3. 
Передача и получение биопсийного материала человека 206

11.4. 
Первичные эксплантаты 206

11.5. 
Дезагрегация ткани теплым трипсином 209

11.6. 
Дезагрегация ткани в холодном трипсине 212

11.7. 
Рудиментарные органы куриного эмбриона 213

11.8. 
Дезагрегация ткани с помощью коллагеназы 215

11.9. 
Механическая дезагрегация ткани путем просеивания 220

11.10. Обогащение доли жизнеспособных клеток 220
12.1. 
Питание монослойной культуры во флаконах 232

12.2. 
Питание монослойной культуры в чашках и планшетах  233

12.3. 
Субкультивирование клеток, образующих монослой 236

12.4. 
Суспензионное субкультивирование 240

13.1. 
Клонирование с разведением 245

13.2. 
Приготовление кондиционированной среды 249

13.3. 
Приготовление фидерных слоев 250

13.4. 
Клонирование в агаре 251

13.5. 
Клонирование в Methocel 252

13.6. 
Выделение клонов с использованием колец для клонирования 255

13.7. 
Выделение клеточных колоний путем облучения 257

13.8. 
Выделение суспензионных клонов 257

13.9. 
Метотрексат-резистентность и DHFR-амплифика ция 259

14.1. 
Разделение клеток центрифугированием в градиенте 
плотности 263

14.2. 
Магнитно-активированный 
клеточный 
сортинг 
(MACS) 269

15.1. 
Использование инвертированного микроскопа 284

15.2. 
Окрашивание по Гимзе 285

15.3. 
Окрашивание кристаллвиолетом 286

15.4. 
Подготовка суспензионной культуры клеток для цитологических исследований методом цитоцентрифугирования 287

15.5. 
Фильтрационная цитология 288

15.6. 
Цифровая фотография на микроскопе 289

15.7. 
Приготовление хромосомного препарата 290

15.8. 
Анализ STR-профиля ДНК клеточных линий 296

15.9. 
Изоферментный анализ 300

15.10. Непрямая иммунофлуоресценция 304
17.1. 
Иммортализация фибробластов 324

17.2. 
Иммортализация мезенхимальных стволовых клеток человека с помощью теломеразы 327

17.3. 
Ограничение клеточной пролиферации плотностью суспензии 330

17.4. 
Исследование ангиогенеза in vitro 335

18.1. 
Обработка инкубаторов 341

18.2. 
Выявление микоплазм методом флуоресценции 345

18.3. 
Использование PCR для обнаружения микоплазм 346

18.4. 
Устранение микробной контаминации 350

18.5. 
Устранение микоплазменной контаминации 351

19.1. 
Замораживание клеток 362

19.2. 
Размораживание клеток 364

19.3. 
Криоконсервация hES-клеток путем витрификации 367

19.4. 
Размораживание hES-клеток, криоконсервированных 
путем витрификации 368

20.1. 
Подсчет клеток при помощи гемоцитометра 374

20.2. 
Электронный подсчет клеток на основе электрического 
сопротивления 378

20.3. 
Оценка содержания ДНК с использованием красителя 
Hoechst 33258 382

20.4. 
Оценка содержания белка методом Брэдфорда 382

20.5. 
Оценка уровня синтеза ДНК методом включения [3Н]тимидиновой метки 384

20.6. 
Синтез белка 385

Список протоколов 
21

20.7. 
Кривая роста монослоя во флаконах 391

20.8. 
Кривая роста монослоя в многолуночном планшете 391

20.9. 
Кривая роста суспензионной культуры 394

20.10. Определение эффективности посева на чашки Петри 397

20.11. Индекс мечения [3Н]-ти ми ди ном 400
20.12. Определение фракции пролиферирующих клеток 401
21.1. 
Оценка жизнеспособности методом отторжения красителя 405

21.2. 
Оценка жизнеспособности методом поглощения красителя 405

21.3. 
Клоногенный анализ прикрепленных клеток 406

21.4. 
Оценка цитотоксичности при помощи МТТ-теста 411

21.5. 
Обмен сестринских хроматид 416

22.1. 
Эпидермальные кератиноциты 424

22.2. 
Эпителиальные клетки роговицы 427

22.3. 
Получение эпителиальных клеток молочной железы из 
тканей, отобранных при маммопластике 429

22.4. 
Цервикальный эпителий 431

22.5. 
Выделение и культивирование клеток крипт толстого 
кишечника 433

22.6 А. Выделение гепатоцитов крысы 435
22.6 Б. Очистка гепатоцитов человека HepaRG 437
22.7. 
Эпителий поджелудочной железы 438

22.8. 
Эпителий почки 440

22.9. 
Бронхиальный и трахеальный эпителий 441

22.10. Кератиноциты ротовой полости 442
22.11. Эпителий простаты 444
22.12. Первичная культура адипоцитов 446
22.13. Выделение и культивирование гладкомышечных клеток 447

22.14. Культура миобластов взрослой скелетной мышцы 448
22.15. Культура отдельного мышечного волокна скелетной 
мышцы 450

22.16. Хондроциты на альгинатных бусинах 451
22.17. Остеобласты 454
22.18. Выделение и культивирование клеток сосудистого эндотелия 455

22.19. Выделение и культивирование тучных клеток мозжечка 459

22.20. Первичная культура астроцитов человека 461
22.21. Обонятельные клетки 463

22.22. Культура меланоцитов 466
23.1. 
Получение и первичное культивирование эмбриональных 
стволовых клеток мыши 471

23.2. 
Размножение эмбриональных стволовых клеточных линий мыши 474

23.3. 
Получение эмбриональных стволовых клеток человека 476

23.4. 
Пересадка hES-клеток 477

23.5. 
Культуры клеток эмбриона данио-рерио 479

23.6. 
Культура амниоцитов 482

23.7. 
Получение MSC из костного мозга человека 487

23.8. 
Перепрограммирование человеческих дермальных фибробластов для генерации плюрипотентных стволовых 
клеток 489

23.9. 
Долгоживущие гематопоэтические клеточные культуры 
из костного мозга мыши 491

23.10. Исследование инициирующих долгоживущую культуру 
человеческих клеток (LTC-IC) 493

23.11. Исследование гематопоэтических колониеобразующих 
клеток 496

24.1. 
Замораживание образцов биопсии 500

24.2. 
Рост на конфлюэнтных фидерных слоях 503

24.3. 
Культивирование клеток опухоли молочной железы 508

24.4. 
Культура колоректальных опухолей 510

24.5. 
Определение постоянных клеточных линий лейкемии 
и лимфомы 515

25.1. 
Органная культура 520

25.2. 
3D-культуры в сфероидах  523

25.3. 
Фильтрационные вкладыши для лунок 526

25.4. 
Нейрональные агрегаты 528

26.1. 
Перемешивание 4-литровой партии суспензионной культуры 533

26.2. 
Система Nunc Cell Factory 539

26.3. 
Культура в роллерных бутылях 542

26.4. 
Микроносители 544

27.1. 
Подготовка препарата лимфоцитов 551

27.2. 
РНА-стимуляция лимфоцитов 552

27.3. 
Микроавторадиография 554

27.4. 
Видеосъемка в режиме замедленного времени 557

27.5. 
Культивирование клеток насекомых 560

27.6. 
Клеточная гибридизация 561

27.7. 
Продукция моноклональных антител 564