Культура животных клеток

КУЛЬТУРА  
ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК

ПРАКТИЧЕСКОЕ РУКОВОДСТВО

СULTURE 
OF ANIMAL 
CELLS

A  MANUAL OF BASIC TECHNIQUE 
AND SPECIALIZED APPLICATIONS

R. Jan Freshney

Cancer Research UK Centre or Oncology and Applied Pharmacology 
Division of Cancer Sciences and Molecular PharmacologyUniversity of Glasgow
Willey-Liss

Sixth Edition

КУЛЬТУРА
ЖИВОТНЫХ
КЛЕТОК

 

ПРАКТИЧЕСКОЕ  РУКОВОДСТВО

5-е издание, электронное

Р. Я. Фрешни

Перевод 6-го английского издания

Москва
Лаборатория знаний
2022

УДК 57.08
ББК 28.03
Ф87

П е р е в о д ч и к и:
д-р биол. наук Ю. Н. Хомяков,
канд. мед. наук Т. И. Хомякова
Фрешни Р. Я.
Ф87
Культура животных клеток : практическое руководство /
Р. Я. Фрешни
;
пер.
6-го
англ.
изд. — 5-е
изд.,
электрон. —
М. : Лаборатория знаний, 2022. — 791 с. — Систем. требования:
Adobe Reader XI ; экран 10". — Загл. с титул. экрана. — Текст :
электронный.
ISBN 978-5-00101-974-9
Учебное издание, написанное ведущим специалистом в данной области,
содержит наиболее полное описание теоретических основ и практических
приемов работы с культурами животных клеток, а также необходимого
оборудования, включая лабораторный дизайн. В достаточном объеме освещены вопросы техники безопасности. Подробно обсуждаются методика
подготовки сред, приемы работы с первичной культурой и клеточными
линиями. Описано специальное оборудование, в том числе для манипуляций
с культурами животных клеток. Книга прекрасно иллюстрирована и удобна
для использования как руководство в лаборатории.
Для студентов-биологов, биотехнологов, медиков, а также исследователей, специалистов биофармацевтических центров и сотрудников диагностических лабораторий.
УДК 57.08
ББК 28.03

Приведенные в книге показания к применению, противопоказания и дозировки препаратов настоятельно рекомендуется сверять с информацией их производителей и соотносить с клиническими процедурами.
Авторы, редакторы и издатель не несут никакой юридической ответственности за любые содержащиеся в тексте
и иллюстрациях ошибки или упущения.

В соответствии со ст. 1299 и 1301 ГК РФ при устранении ограничений, установленных техническими
средствами защиты авторских прав, правообладатель вправе требовать от нарушителя возмещения убытков
или выплаты компенсации

ISBN 978-5-00101-974-9

©
Copyright
2010 by John Wiley & Sons. Inc. All rights reserved.
Все права защищены. Авторизованный перевод издания
на английском языке, опубликованного John Wiley & Sons
Limited. Ответственность за точность перевода полностью
возложена на издательство Лаборатория знаний и не является
ответственностью John Wiley & Sons Limited. Никакая часть
данной книги не может быть воспроизведена в любой форме
без письменного разрешения первоначального правообладателя,
John Wiley & Sons Limited.

© Перевод на русский язык, оформление, Лаборатория знаний,
2015

Оглавление

Список иллюстраций . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Список цветных вклеек . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Список протоколов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Список таблиц . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Предисловие и благодарности  . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Список сокращений  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

Глава 1
ВВЕДЕНИЕ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

1.1. 
Исторические сведения . . . . . . . . . . . . . . . 30

1.2. 
Преимущества культуры ткани  . . . . . . . 35

1.2.1. 
Контроль окружающей среды . . . . . . . . . . . 35

1.2.2. 
Характеристика и однородность образцов  36

1.2.3. 
Экономичность, эффективность и автоматизация процесса  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

1.2.4. 
Моделирование in vitro условий in vivo . . . 36

1.3. 
Ограничения . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

1.3.1. 
Наличие специальных навыков  . . . . . . . . . 36

1.3.2. 
Затраты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

1.3.3. 
Дифференцировка и селекция  . . . . . . . . . . 37

1.3.4. 
Происхождение клеток  . . . . . . . . . . . . . . . . 37

1.3.5. 
Нестабильность  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

1.4. 
Основные отличия культуры in vitro  . . . 38

1.5. 
Типы культуры ткани . . . . . . . . . . . . . . . . 38

Глава 2
БИОЛОГИЯ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.1. 
Влияние окружающей среды на культуру 
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.2. 
Клеточная адгезия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

2.2.1. 
Молекулы клеточной адгезии . . . . . . . . . . . 41

2.2.2. 
Межклеточные контакты . . . . . . . . . . . . . . . 42

2.2.3. 
Внеклеточный матрикс  . . . . . . . . . . . . . . . . 43

2.2.4. 
Цитоскелет  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.2.5. 
Клеточная подвижность  . . . . . . . . . . . . . . . 44

2.3. 
Клеточная пролиферация . . . . . . . . . . . . . 45

2.3.1. 
Клеточный цикл . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

2.3.2. 
Контроль клеточной пролиферации . . . . . . 46

2.4. 
Дифференцировка  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

2.4.1. 
Поддержание дифференцировки  . . . . . . . . 47

2.4.2. 
Дедифференцировка  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

2.5. 
Передача клеточных сигналов  . . . . . . . . 50

2.6. 
Энергетический метаболизм  . . . . . . . . . . 51

2.7. 
Происхождение культивируемых клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

2.7.1. 
Получение первичной культуры . . . . . . . . . 52

2.7.2. 
Эволюция клеточных линий . . . . . . . . . . . . 53

2.7.3. 
Старение  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

2.7.4. 
Трансформация и развитие постоянных 
клеточных линий  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

Глава 3
СТРУКТУРА, ПЛАНИРОВКА И ОБОРУДОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОМЕЩЕНИЙ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  56

3.1. 
Планировка, меблировка и оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

3.1.1. 
Требования к помещениям  . . . . . . . . . . . . . 57

3.1.2. 
Обслуживание  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

3.1.3. 
Вентиляция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.2. 
Планировка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

3.2.1. 
Помещение для стерильных манипуляций  61

3.2.2. 
Ламинарное оборудование  . . . . . . . . . . . . . 62

3.2.3. 
Служебный лабораторный стол  . . . . . . . . . 62

3.2.4. 
Карантин и изоляция . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

3.2.5. 
Инкубация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

3.2.6. 
Зона подготовительных работ . . . . . . . . . . . 66

3.2.7. 
Хранение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

Глава 4
ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ . . . . 70

4.1. 
Потребности 
лаборатории 
культуры 
ткани . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.2. 
Асептическая зона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.2.1. 
Ламинарные шкафы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

4.2.2. 
Сервисные тележки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

4.2.3. 
Стерильные манипуляции с жидкостями — 
пипетирование и дозирование  . . . . . . . . . . 75

4.2.4. 
Инвертированный микроскоп . . . . . . . . . . . 79

4.2.5. 
CCD-камера и монитор  . . . . . . . . . . . . . . . . 79

4.2.6. 
Препаровальная лупа . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

4.2.7. 
Центрифуга . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

4.2.8. 
Подсчет клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

4.3. 
Инкубация и культура  . . . . . . . . . . . . . . . 80

4.3.1. 
Инкубатор . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

4.3.2. 
Влажный СО2-инкубатор  . . . . . . . . . . . . . . 81

4.3.3. 
Регистратор температуры  . . . . . . . . . . . . . . 83

4.3.4. 
Роллерные штативы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

4.3.5. 
Магнитная мешалка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

4.3.6. 
Культуральные сосуды . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

4.4. 
Препаративные работы и стерилизация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

4.4.1. 
Мытье посуды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

4.4.2. 
Приготовление сред и реактивов  . . . . . . . . 84

4.4.3. 
Стерилизация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

4.5. 
Хранение  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

4.5.1. 
Расходные материалы  . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

Оглавление

4.5.2. 
Холодильники и морозильники  . . . . . . . . . 88

4.5.3. 
Контейнеры для криоконсервации . . . . . . . 88

4.5.4. 
Мультилокусный 
ДНК-фингерпринтинг 
с управляемым процессом замораживания  89

4.6. 
Дополнительное лабораторное оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

4.6.1. 
Компьютеры и cети  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

4.6.2. 
Прямой микроскоп . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

4.6.3. 
Низкотемпературный морозильник  . . . . . . 89

4.6.4. 
Конфокальный микроскоп  . . . . . . . . . . . . . 90

4.6.5. 
PCR-термоциклер (ДНК-амплификатор) . . 90

4.7. 
Специальное оборудование  . . . . . . . . . . . 90

4.7.1. 
Установка для микроинъекций . . . . . . . . . . 90

4.7.2. 
Счетчик колоний  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

4.7.3. 
Центрифужный элютриатор  . . . . . . . . . . . . 90

4.7.4. 
Проточный цитометр . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

Глава 5
МЕТОДЫ АСЕПТИКИ  . . . . . . . . . . . . . . . 91

5.1. 
Цели асептики  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

5.1.1. 
Риск контаминации  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

5.1.2. 
Поддержание стерильности  . . . . . . . . . . . . 91

5.2. 
Элементы асептического окружения . . . 91

5.2.1. 
Ламинарный поток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

5.2.2. 
Стерильная зона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

5.2.3. 
Рабочая поверхность  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

5.2.4. 
Личная гигиена . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

5.2.5. 
Реагенты и среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

5.2.6. 
Культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

5.3. 
Стерильные манипуляции . . . . . . . . . . . . 97

5.3.1. 
Протирание поверхностей . . . . . . . . . . . . . . 97

5.3.2. 
Закрывание емкостей . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

5.3.3. 
Работа с горелкой . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

5.3.4. 
Манипуляции с бутылями и колбами . . . . . 97

5.3.5. 
Пипетирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

5.3.6. 
Переливание . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

5.4. 
Стандартная процедура  . . . . . . . . . . . . . . 99
Протокол 5.1.  Асептический метод работы в вертикальном ламинарном потоке . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

Протокол 5.2.  Работа на открытой поверхности  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

Протокол 5.3.  Работа 
с 
планшетами 
и чашками  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

5.5. 
Приборы и оборудование  . . . . . . . . . . . . . 104

5.5.1. 
Инкубаторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104

5.5.2. 
Коробки для влажного инкубатора . . . . . . . 104

5.5.3. 
Культивирование в атмосфере СО2 . . . . . . . . . 104

Глава 6
БЕЗОПАСНОСТЬ, БИОЭТИКА И ВАЛИДАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

6.1. 
Лабораторная безопасность . . . . . . . . . . . 105

6.2. 
Оценка риска  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

6.3. 
Стандартные рабочие процедуры . . . . . . 107

6.4. 
Контроль безопасности . . . . . . . . . . . . . . . 107

6.5. 
Общая безопасность  . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

6.5.1. 
Оператор . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

6.5.2. 
Оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

6.5.3. 
Стеклянные и острые предметы . . . . . . . . . 108

6.5.4. 
Химическая токсичность . . . . . . . . . . . . . . . 110

6.5.5. 
Газы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

6.5.6. 
Жидкий азот  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

6.5.7. 
Ожоги  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

6.6. 
Пожар . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

6.7. 
Ионизирующее излучение  . . . . . . . . . . . . 112

6.7.1. 
Попадание в организм . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

6.7.2. 
Утилизация радиоактивных отходов  . . . . . 112

6.7.3. 
Излучение от меченых реагентов . . . . . . . . 112

6.7.4. 
Излучение от высокоэнергетических источников  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

6.8. 
Биологическая опасность . . . . . . . . . . . . . 113

6.8.1. 
Уровни биологической защиты  . . . . . . . . . 113

6.8.2. 
Ламинарные 
шкафы 
микробиологической защиты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

6.8.3. 
Человеческий биопсийный материал . . . . . 116

6.8.4. 
Манипуляции с генетическим материалом  119

6.8.5. 
Уничтожение биологически опасных отходов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

6.8.6. 
Дезинфекция окуриванием . . . . . . . . . . . . . 120

6.9. 
Биоэтика  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

6.9.1. 
Ткани животных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

6.9.2. 
Ткани человека . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

6.10. 
Обеспечение качества . . . . . . . . . . . . . . . . 121

6.10.1. 
Процедуры  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

6.10.2. 
Контроль качества  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

6.11. 
Валидация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

6.11.1. 
Подтверждение аутентичности . . . . . . . . . . 122

6.11.2. 
Происхождение  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

6.11.3. 
Контаминация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123

Глава 7
ПОСУДА И СУБСТРАТЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК . . . . . . . . . . . . . . . 124

7.1. 
Субстрат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

7.1.1. 
Прикрепление и рост клеток . . . . . . . . . . . . 124

7.1.2. 
Общепринятые материалы для субстрата  . 124

7.1.3. 
Альтернативные субстраты . . . . . . . . . . . . . 124

7.2. 
Обработка поверхности  . . . . . . . . . . . . . . 125

7.2.1. 
Покрытие матриксом . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
Протокол 7.1.  Приготовление ECM  . . . . . 126

7.2.2. 
Фидерные слои . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126

7.2.3. 
Неадгезивные субстраты . . . . . . . . . . . . . . . 126

7.3. 
Выбор культуральных сосудов  . . . . . . . . 127

7.3.1. 
Клеточный выход . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127

7.3.2. 
Суспензионная культура  . . . . . . . . . . . . . . . 129

7.3.3. 
Вентиляция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

7.3.4. 
Отбор и анализ проб  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

7.3.5. 
Неравномерный рост . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132

7.3.6. 
Расходы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

7.4. 
Специализированные системы . . . . . . . . 133

7.4.1. 
Проницаемые подложки  . . . . . . . . . . . . . . . 133

7.4.2. 
Трехмерные матриксы . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

Глава 8
СРЕДЫ И ДОБАВКИ  . . . . . . . . . . . . . . . . 135

8.1. 
Составление сред  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

8.2. 
Физико-химические свойства  . . . . . . . . . 135

8.2.1. 
Значение pH  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

Оглавление 
7

Протокол 8.1.  Приготовление стандартных буферных растворов  . . . . . . . . . . . 135

8.2.2. 
CO2 и бикарбонат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 136

8.2.3. 
Буферная система . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137

8.2.4. 
Кислород . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138

8.2.5. 
Осмотическое давление . . . . . . . . . . . . . . . . 138

8.2.6. 
Температура  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

8.2.7. 
Вязкость  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

8.2.8. 
Поверхностное натяжение и пенообразование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

8.3. 
Сбалансированные солевые растворы  . 142

8.4. 
Полная среда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142

8.4.1. 
Аминокислоты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

8.4.2. 
Витамины  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

8.4.3. 
Соли . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

8.4.4. 
Глюкоза . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

8.4.5. 
Органические добавки . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

8.4.6. 
Гормоны и факторы роста . . . . . . . . . . . . . . 144

8.4.7. 
Антибиотики . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

8.5. 
Сыворотка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

8.5.1. 
Белки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

8.5.2. 
Факторы роста  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

8.5.3. 
Гормоны  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146

8.5.4. 
Питательные вещества и метаболиты  . . . . 146

8.5.5. 
Липиды  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146

8.5.6. 
Неорганические вещества . . . . . . . . . . . . . . 146

8.5.7. 
Ингибиторы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146

8.6. 
Выбор среды и сыворотки  . . . . . . . . . . . . 146

8.6.1. 
Резервирование партии сыворотки  . . . . . . 147

8.6.2. 
Тестирование сыворотки . . . . . . . . . . . . . . . 148

8.6.3. 
Термическая инактивация . . . . . . . . . . . . . . 149

8.7. 
Другие добавки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

8.7.1. 
Гидролизаты аминокислот  . . . . . . . . . . . . . 149

8.7.2. 
Эмбриональный экстракт  . . . . . . . . . . . . . . 149

8.7.3. 
Кондиционированная среда  . . . . . . . . . . . . 149

Глава 9
БЕССЫВОРОТОЧНЫЕ СРЕДЫ . . . . . . . 150

9.1. 
Недостатки сыворотки  . . . . . . . . . . . . . . . 150

9.2. 
Преимущества бессывороточных сред  . 154

9.2.1. 
Определение стандартной среды  . . . . . . . . 154

9.2.2. 
Селективные среды  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154

9.2.3. 
Регуляция пролиферации и дифференцировки  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154

9.3. 
Недостатки бессывороточных сред  . . . . 156

9.4. 
Замена сыворотки  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156

9.4.1. 
Коммерчески доступные бессывороточные среды  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156

9.4.2. 
Заменители сыворотки  . . . . . . . . . . . . . . . . 156

9.4.3. 
Бессывороточная субкультура  . . . . . . . . . . 157

9.4.4. 
Гормоны  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157

9.4.5. 
Факторы роста  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

9.4.6. 
Питательные вещества сыворотки . . . . . . . 158

9.4.7. 
Белки и полиамины  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

9.4.8. 
Вязкость  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 158

9.5. 
Выбор бессывороточной среды . . . . . . . . 158

9.5.1. 
Специфичность клеток или продукта  . . . . 158

9.5.2. 
Адаптация клеток к бессывороточной 
среде  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165

9.6. 
Разработка бессывороточной среды . . . . 165

9.7. 
Приготовление бессывороточной среды  165

9.8. 
Среда, не содержащая животных белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166

9.9. 
Заключение  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 166

Глава 10
ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЕ РАБОТЫ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

10.1. 
Приготовление реактивов и материалов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

10.2. 
Стерилизация оборудования и жидкостей  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

10.3. 
Оборудование  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168

10.3.1. 
Стеклянная посуда . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
Протокол 10.1.  Подготовка и стерилизация изделий из стекла  . . . . . . . . . . . . . . 169

10.3.2. 
Стеклянные пипетки  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
Протокол 10.2.  Подготовка и стерилизация стеклянных пипеток . . . . . . . . . . . . 173

10.3.3. 
Завинчивающиеся крышки . . . . . . . . . . . . . 175
Протокол 10.3.  Подготовка и стерилизация завинчивающихся крышек . . . . . . . . 175

10.3.4. 
Выбор детергента . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176

10.3.5. 
Прочее оборудование . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177

10.3.6. 
Стерилизационные фильтры многократного использования  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177
Протокол 10.4.  Стерилизация комплекта 
фильтров . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178

10.4. 
Реагенты и среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178

10.4.1. 
Вода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178
Протокол 10.5.  Приготовление и стерилизация сверхчистой воды (UPW)  . . . . . . 179

10.4.2. 
Техническое обслуживание водоочистительной установки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180

10.4.3. 
Сбалансированный солевой раствор (BSS)  180
Протокол 10.6.  Приготовление и стерилизация D-PBSA  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181

10.4.4. 
Приготовление и стерилизация среды . . . . 181
Протокол 10.7.  Приготовление 
среды 
из концентрата с кратностью 1×  . . . 182

Протокол 10.8.  Приготовление 
среды 
из концентрата с кратностью 10×  . . 182

10.4.5. 
Порошкообразные среды . . . . . . . . . . . . . . . 184
Протокол 10.9.  Приготовление 
среды 
из порошка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 184

10.4.6. 
Специализированная среда . . . . . . . . . . . . . 184
Протокол 10.10.  Приготовление специализированной среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185

10.5. 
Стерилизация среды  . . . . . . . . . . . . . . . . . 185

10.5.1. 
Автоклавируемые среды  . . . . . . . . . . . . . . . 185

10.5.2. 
Стерилизация методом фильтрации . . . . . . 185
Протокол 10.11.  Стерилизация 
с 
использованием фильтрующих насадок 
на шприцы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 186

Протокол 10.12.  Стерилизация с использованием фильтрующей вакуумной насадки на колбу . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188

Оглавление

Протокол 10.13.  Стерилизация с использованием малого встроенного фильтра  . 189

Протокол 10.14.  Стерилизационная фильтрация с использованием большого прямоточного фильтра . . . . . . . . . . . . . . . . 190

10.5.3. 
Сыворотка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
Протокол 10.15.  Сбор и стерилизация сывороток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192

Протокол 10.16.  Диализ сывороток  . . . . . 194

10.5.4. 
Приготовление и стерилизация других реагентов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

10.6. 
Контроль, проверка качества и хранение 
сред  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

10.6.1. 
Контроль качества  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

10.6.2. 
Проверка стерильности . . . . . . . . . . . . . . . . 196

10.6.3. 
Проверка культуральных свойств . . . . . . . . 197

10.6.4. 
Хранение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 198

Глава 11
ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА . . . . . . . . . . . . . 199

11.1. 
Инициация первичной культуры клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199

11.1.1. 
Ферменты, используемые для дезагрегации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199

11.1.2. 
Общие характеристики дезагрегации  . . . . 199

11.2. 
Выделение образцов ткани . . . . . . . . . . . . 200

11.2.1. 
Мышиный эмбрион  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201
Протокол 11.1.  Выделение мышиного эмбриона . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201

11.2.2. 
Куриный эмбрион . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204
Протокол 11.2.  Выделение куриного эмбриона  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 204

11.2.3. 
Биопсийный материал человека . . . . . . . . . 204
Протокол 11.3.  Передача и получение биопсийного материала человека . . . . . . . 206

11.3. 
Типы первичной культуры  . . . . . . . . . . . 206

11.3.1. 
Первичный эксплантат  . . . . . . . . . . . . . . . . 206
Протокол 11.4.  Первичные эксплантаты . 206

11.3.2. 
Ферментативная дезагрегация  . . . . . . . . . . 208

11.3.3. 
Теплый трипсин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Протокол 11.5.  Дезагрегация ткани теплым трипсином . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209

11.3.4. 
Трипсинизация с преинкубацией на холоде  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212
Протокол 11.6.  Дезагрегация ткани в холодном трипсине  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212

11.3.5. 
Рудиментарные органы куриного эмбриона  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213
Протокол 11.7.  Рудиментарные 
органы 
куриного эмбриона  . . . . . . . . . . . . . . . . . 213

11.3.6. 
Дезагрегация с использованием других 
ферментов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215

11.3.7. 
Коллагеназа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215
Протокол 11.8.  Дезагрегация ткани с помощью коллагеназы  . . . . . . . . . . . . . . . . 215

11.3.8. 
Механическая дезагрегация  . . . . . . . . . . . . 219
Протокол 11.9.  Механическая дезагрегация ткани путем просеивания  . . . . . . . 220

11.3.9. 
Разделение жизнеспособных и нежизнеспособных клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220
Протокол 11.10.  Обогащение доли жизнеспособных клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220

11.3.10. Первичная культура, краткие выводы  . . . . 222
11.3.11. 
Первичная документация  . . . . . . . . . . . . . . 222

Глава 12
СУБКУЛЬТУРА И КЛЕТОЧНЫЕ  
ЛИНИИ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223

12.1. 
Субкультивирование . . . . . . . . . . . . . . . . . 223

12.1.1. 
Перекрестная контаминация и неправильная 
идентификация   . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223

12.1.2. 
Микоплазменная контаминация . . . . . . . . . 227

12.1.3. 
Терминология . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228

12.1.4. 
Маркировка клеточной культуры . . . . . . . . 228

12.1.5. 
Возраст культуры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 229

12.2. 
Выбор клеточной линии . . . . . . . . . . . . . . 229

12.3. 
Обычный порядок поддержания культуры  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230

12.3.1. 
Значение клеточной морфологии . . . . . . . . 230

12.3.2. 
Замена среды  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231

12.3.3. 
Стандартный протокол замены среды  . . . . 232
Протокол 12.1.  Питание 
монослойной 
культуры во флаконах  . . . . . . . . . . . . . . 232

Протокол 12.2.  Питание 
монослойной 
культуры в чашках и планшетах  . . . . . 233

12.4. 
Субкультивирование . . . . . . . . . . . . . . . . . 233

12.4.1. 
Критерии субкультивирования . . . . . . . . . . 234

12.4.2. 
Стандартный протокол субкультивирования 
клеток, образующих монослой  . . . . . . . . . . 236
Протокол 12.3.  Субкультивирование клеток, образующих монослой . . . . . . . . . . 236

12.4.3. 
Цикл роста и индекс разведения  . . . . . . . . 238

12.4.4. 
Концентрация клеток в субкультуре  . . . . . 239

12.4.5. 
Размножение в суспензии  . . . . . . . . . . . . . . 239

12.4.6. 
Субкультивирование клеток, растущих в суспензии  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240
Протокол 12.4.  Суспензионное субкультивирование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240

12.4.7. 
Стандартизация условий культивирования  241

12.4.8. 
Использование антибиотиков . . . . . . . . . . . 242

12.4.9. 
Ведение документации  . . . . . . . . . . . . . . . . 242

Глава 13
КЛОНИРОВАНИЕ И СЕЛЕКЦИЯ  . . . . . 244

13.1. 
Клонирование клеток  . . . . . . . . . . . . . . . . 244
Протокол 13.1.  Клонирование с разведением  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245

13.2. 
Стимуляция эффективности посева  . . . 247

13.2.1. 
Условия, которые улучшают клональный рост  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 248

13.2.2. 
Кондиционированные среды . . . . . . . . . . . . 249
Протокол 13.2.  Приготовление кондиционированной среды . . . . . . . . . . . . . . . . . . 249

13.2.3. 
Фидерные слои . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250
Протокол 13.3.  Приготовление фидерных 
слоев . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 250

13.3. 
Суспензионное клонирование  . . . . . . . . . 251

Оглавление 
9

Протокол 13.4.  Клонирование в агаре . . . . 251
Протокол 13.5.  Клонирование в Methocel . 252

13.4. 
Выделение клонов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 255
Протокол 13.6.  Выделение клонов с использованием колец для клонирования . . . . . 255

Протокол 13.7.  Выделение клеточных колоний путем облучения  . . . . . . . . . . . . . 257

13.4.1. 
Другие методы выделения монослойных клонов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257

13.4.2. 
Суспензионные клоны . . . . . . . . . . . . . . . . . 257
Протокол 13.8.  Выделение 
суспензионных клонов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257

13.5. 
Получение репликативных колоний  . . . 258

13.6. 
Селективные ингибиторы  . . . . . . . . . . . . 259

13.7. 
Выделение генетических вариантов  . . . 259
Протокол 13.9.  Метотрексат-резистентность и DHFR-амплификация . . . . . . . . 259

13.8. 
Взаимодействие с субстратом  . . . . . . . . . 261

13.8.1. 
Селективная адгезия  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261

13.8.2. 
Селективное открепление . . . . . . . . . . . . . . 261

13.8.3. 
Природа субстрата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261

13.8.4. 
Селективные фидерные слои  . . . . . . . . . . . 261

13.8.5. 
Селекция на полужидкой среде  . . . . . . . . . 261

Глава 14
РАЗДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК  . . . . . . . . . . . . . . 263

14.1. 
Плотность клеток и изопикническая седиментация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 263
Протокол 14.1.  Разделение клеток центрифугированием в градиенте плотности  263

14.2. 
Размер клеток и скорость седиментации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266

14.2.1. 
Гравитационная седиментация . . . . . . . . . . 266

14.2.2. 
Элютриация центрифугированием . . . . . . . 266

14.3. 
Методы, основанные на применении антител . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 266

14.3.1. 
Иммунный пэннинг . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 267

14.3.2. 
Магнитный сортинг . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 268
Протокол 14.2.  Магнитно-активированный 
клеточный сортинг (MACS)  . . . . . . . . . 269

14.4. 
Флуоресцентно-активируемый клеточный сортинг  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 270

14.5. 
Другие методы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 272

14.6. 
Подходы для начинающих к освоению 
клеточного сортинга  . . . . . . . . . . . . . . . . . 273

Глава 15
ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК  . . . . . . . . 274

15.1. 
Необходимость характеристики  . . . . . . . 274

15.2. 
Аутентификация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 274

15.3. 
Ведение документации и происхождение 
клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 275

15.4. 
Параметры характеристики  . . . . . . . . . . 275

15.4.1. 
Видовая идентификация  . . . . . . . . . . . . . . . 275

15.4.2. 
Происхождение тканевых маркеров . . . . . . 276

15.4.3. 
Уникальные маркеры . . . . . . . . . . . . . . . . . . 277

15.4.4. 
Трансформация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278

15.5. 
Морфология клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 278

15.5.1. 
Микроскопия  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284

Протокол 15.1.  Использование инвертированного микроскопа  . . . . . . . . . . . . . . . . 284

15.5.2. 
Окрашивание  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285
Протокол 15.2.  Окрашивание по Гимзе . . . 285
Протокол 15.3.  Окрашивание кристаллвиолетом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  286

15.5.3. 
Культуральные сосуды для цитологии: монослойные культуры  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286

15.5.4. 
Приготовление суспензионной культуры для 
цитологии  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 286
Протокол 15.4.  Подготовка суспензионной 
культуры клеток для цитологических 
исследований методом цитоцентрифугирования  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 287

Протокол 15.5.  Фильтрационная цитология  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288

15.5.5. 
Микрофотография  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 288
Протокол 15.6.  Цифровая 
фотография 
на микроскопе . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 289

15.6. 
Конфокальная микроскопия . . . . . . . . . . 289

15.7. 
Хромосомный состав . . . . . . . . . . . . . . . . . 290
Протокол 15.7.  Приготовление хромосомного препарата . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 290

15.7.1. 
Дифференциальное окрашивание хромосом . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292

15.7.2. 
Хромосомный анализ  . . . . . . . . . . . . . . . . . 293

15.8. 
Анализ ДНК  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293

15.8.1. 
Гибридизация ДНК  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293

15.8.2. 
Фингерпринтинг ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . 293

15.8.3. 
Анализ профиля ДНК  . . . . . . . . . . . . . . . . . 294
Протокол 15.8.  Анализ STR-профиля ДНК 
клеточных линий  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 296

15.9. 
Рнк и экспрессия белка . . . . . . . . . . . . . . . 298

15.10. 
Активность ферментов . . . . . . . . . . . . . . . 298

15.10.1. Изоферменты  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 298
15.10.2. Изоферментный электрофорез с набором для 
определения аутентичности Authentikit . . . 300
Протокол 15.9.  Изоферментный анализ . . 300

15.11. 
Антигенные маркеры  . . . . . . . . . . . . . . . . 303

15.11.1. Иммунное окрашивание  . . . . . . . . . . . . . . . 304

Протокол 15.10.  Непрямая иммунофлуоресценция  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 304

15.11.2. Иммунный анализ  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 305
15.12. 
Дифференцировка  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 306

Глава 16
ДИФФЕРЕНЦИРОВКА . . . . . . . . . . . . . . . 307

16.1. 
Экспрессия фенотипа in vivo  . . . . . . . . . . 307

16.1.1. 
Дедифференцировка  . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307

16.1.2. 
Линейная селекция  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 307

16.2. 
Стадии дифференцировки  . . . . . . . . . . . . 307

16.3. 
Пролиферация и дифференцировка . . . . 308

16.4. 
Коммитирование и линии дифференцировки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 308

16.5. 
Пластичность стволовых клеток  . . . . . . 309

16.6. 
Маркеры дифференцировки  . . . . . . . . . . 310

16.7. 
Индукция дифференцировки . . . . . . . . . . 311

16.7.1. 
Межклеточные взаимодействия . . . . . . . . . 311

Оглавление

16.7.2. 
Системные факторы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 313

16.7.3. 
Взаимодействия клетки с матриксом . . . . . 315

16.7.4. 
Полярность и форма клетки  . . . . . . . . . . . . 316

16.7.5. 
Давление кислорода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 316

16.8. 
Дифференцировка и злокачественность  317

16.9. 
Практические аспекты . . . . . . . . . . . . . . . 317

Глава 17
ТРАНСФОРМАЦИЯ И ИММОРТАЛИЗАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318

17.1. 
Роль в характеристике клеточных линий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318

17.2. 
Что такое трансформация?  . . . . . . . . . . . 318

17.3. 
Генетическая нестабильность и гетерогенность  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 318

17.3.1. 
Генетическая нестабильность . . . . . . . . . . . 318

17.3.2. 
Хромосомные аберрации . . . . . . . . . . . . . . . 320

17.4. 
Иммортализация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 321

17.4.1. 
Контроль физиологического старения . . . . 322

17.4.2. 
Иммортализация с использованием вирусных генов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322

17.4.3. 
Иммортализация человеческих фибробластов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323
Протокол 17.1.  Иммортализация фибробластов  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 324

17.4.4. 
Теломеразоиндуцированная иммортализация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 326
Протокол 17.2.  Иммортализация мезенхимальных стволовых клеток человека 
с помощью теломеразы . . . . . . . . . . . . . 327

17.4.5. 
Иммортализация лимфоцитов  . . . . . . . . . . 329

17.4.6. 
Трансгенные мыши  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329

17.5. 
Аберрантный контроль роста  . . . . . . . . . 329

17.5.1. 
Независимость от прикрепления к субстрату . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 329

17.5.2. 
Контактное ингибирование . . . . . . . . . . . . . 330
Протокол 17.3.  Ограничение 
клеточной 
пролиферации плотностью суспензии . 330

17.5.3. 
Зависимость от сыворотки  . . . . . . . . . . . . . 331

17.5.4. 
Онкогены . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332

17.6. 
Туморогенность  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332

17.6.1. 
Малигнизация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332

17.6.2. 
Опухолевая трансплантация . . . . . . . . . . . . 333

17.6.3. 
Инвазивность  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333

17.6.4. 
Ангиогенез  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 334
Протокол 17.4.  Исследование ангиогенеза 
in vitro  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 335

17.6.5. 
Активатор плазминогена . . . . . . . . . . . . . . . 337

Глава 18
КОНТАМИНАЦИЯ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338

18.1. 
Источники контаминации  . . . . . . . . . . . . 338

18.1.1. 
Техника работы  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338

18.1.2. 
Окружающая среда  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338

18.1.3. 
Использование и обслуживание ламинарного шкафа  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 338

18.1.4. 
Инкубаторы с увлажнением  . . . . . . . . . . . . 341
Протокол 18.1.  Обработка инкубаторов . 341

18.1.5. 
Холодильные камеры . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342

18.1.6. 
Стерильные материалы . . . . . . . . . . . . . . . . 342

18.1.7. 
Доставленные клеточные линии и образцы биопсии  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342

18.1.8. 
Карантин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 342

18.2. 
Виды микробной контаминации  . . . . . . 342

18.3. 
Контроль контаминации  . . . . . . . . . . . . . 342

18.3.1. 
Визуально определяемая микробная контаминация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343

18.3.2. 
Микоплазмы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343

18.3.3. 
Флуоресцентное окрашивание микоплазм  345
Протокол 18.2.  Выявление микоплазм методом флуоресценции  . . . . . . . . . . . . . . 345

18.3.4. 
Использование PCR для обнаружения микоплазм  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 346
Протокол 18.3.  Использование PCR для обнаружения микоплазм  . . . . . . . . . . . . . . 346

18.3.5. 
Альтернативные методы детекции микоплазм  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 348

18.3.6. 
Сервисные службы по обнаружению микоплазм  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350

18.3.7. 
Вирусная контаминация  . . . . . . . . . . . . . . . 350

18.4. 
Уничтожение контаминированных культур . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350

18.5. 
Устранение контаминации . . . . . . . . . . . . 350

18.5.1. 
Бактерии, грибы и дрожжи  . . . . . . . . . . . . . 350
Протокол 18.4.  Устранение 
микробной 
контаминации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 350

18.5.2. 
Устранение микоплазм  . . . . . . . . . . . . . . . . 351
Протокол 18.5.  Устранение микоплазменной контаминации  . . . . . . . . . . . . . . . . . 351

18.5.3. 
Устранение вирусной контаминации . . . . . 352

18.5.4. 
Персистирующая контаминация  . . . . . . . . 352

18.6. 
Перекрестная контаминация  . . . . . . . . . 354

18.7. 
Заключение  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 354

Глава 19
КРИОКОНСЕРВАЦИЯ  . . . . . . . . . . . . . . . 355

19.1. 
Предпосылки метода замораживания . . 355

19.2. 
Подготовка к криоконсервации  . . . . . . . 355

19.2.1. 
Валидация . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356

19.2.2. 
Когда нужно замораживать . . . . . . . . . . . . . 356

19.3. 
Принципы криоконсервации  . . . . . . . . . 356

19.3.1. 
Теоретическое обоснование замораживания клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356

19.3.2. 
Концентрация клеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . 356

19.3.3. 
Среда для замораживания . . . . . . . . . . . . . . 356

19.3.4. 
Скорость охлаждения  . . . . . . . . . . . . . . . . . 357

19.3.5. 
Ампулы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359

19.3.6. 
Криоморозильники  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 359

19.3.7. 
Замораживание культивируемых клеток . . 362
Протокол 19.1.  Замораживание клеток . . 362

19.3.8. 
Протоколирование работы морозильника . 364

19.3.9. 
Размораживание хранившихся ампул  . . . . 364
Протокол 19.2.  Размораживание клеток . 364

19.3.10. Флаконы для замораживания  . . . . . . . . . . . 367
19.4. 
Витрификация  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 367

19.4.1. 
Криоконсервация эмбриональных стволовых клеток человека (hES)  . . . . . . . . . . . . . 367
Протокол 19.3.  Криоконсервация 
hESклеток путем витрификации . . . . . . . . 367