Основы иммуноанализа

Екатеринбург
Издательство Уральского университета
2021

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ  
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

УРАЛЬСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ  
ИМЕНИ ПЕРВОГО ПРЕЗИДЕНТА РОССИИ Б. Н. ЕЛЬЦИНА

Н. Е. Максимова, Н. Н. Мочульская, В. В. Емельянов

ОСНОВЫ  
ИММУНОАНАЛИЗА

Учебное пособие

Рекомендовано методическим советом
Уральского федерального университета в качестве учебного пособия
для студентов вуза, обучающихся по направлению подготовки
19.04.01 «Биотехнология»

УДК 
606:61(075.8)
ББК 
30.16я73-1

 
М17

ISBN 978-5-7996-3295-3 
© Уральский федеральный университет, 2021

М17
Максимова, Н. Е.
Основы иммуноанализа : учебное пособие / Н. Е. Максимова, Н. Н. Мочуль-
ская, В. В. Емельянов ; под общ. ред. Н. Н. Мочульской ; Министерство науки 
и высшего образования Российской Федерации, Уральский федеральный уни-
верситет. —  Екатеринбург : Изд-во Урал. ун-та, 2021. — 148 с. : ил. —  Библиогр.: 
с. 147. — 30 экз. —  ISBN 978-5-7996-3295-3. —  Текст : непосредственный.

ISBN 978-5-7996-3295-3

В учебном пособии рассмотрены современные иммунохимические методы анализа 
с использованием различных способов детекции. Изложены принципы, основные харак-
теристики, варианты практического применения, достоинства и ограничения каждого 
метода. Описаны строение, свой ства и методы получения основных типов иммуноре-
агентов, применяемых в иммуноанализе, —  антигенов, антител, комплемента, конъю-
гатов (меченых иммунореагентов). Уделено внимание основным физико- химическим 
закономерностям взаимодействия антигена с антителом.
Для магистрантов, обучающихся по направлению «Биотехнология» и осваиваю-
щих дисциплины «Основы иммуноанализа» и «Иммунохимические и молекулярно-
генетические методы анализа», а также бакалавров, обучающихся по направлениям 
«Биотехнология» и «Химическая технология» и осваивающих курс «Основы иммуно-
химии».

УДК 606:61(075.8)
ББК 30.16я73-1

Под общей редакцией Н. Н. Мочульской

Рецензенты:
лаборатория морфологии и биохимии
Института иммунологии и физиологии УрО РАН
(заведующий лабораторией доктор биологических наук, доцент И. Г. Данилова);
С. С. Дерябина, кандидат биологических наук,
заведующая лабораторией молекулярной диагностики
ГБУЗ СО «Клинико- диагностический центр “Охрана здоровья матери и ребенка”»

ОГЛАВЛЕНИЕ

От авторов 
5
Список принятых сокращений 
6
Введение 
7
1. Реагенты для иммунохимического анализа 
8
1.1. Антигены 
8
1.1.1. Свойства антигенов 
11
1.1.2. Антигены бактериальной клетки 
16
1.1.3. Антигены вирусов 
18
1.1.4. Антигены организма человека 
19
1.1.5. Антигенные диагностикумы 
23
1.2. Антитела 
25
1.2.1. Строение антител 
25
1.2.2. Изотипы, аллотипы и идиотипы 
30
1.2.3. Характеристика классов антител (изотипов) 
30
1.2.4. Методы получения антител 
35
1.2.4.1. Поликлональные антитела 
36
1.2.4.2. Моноклональные антитела 
38
1.3. Система комплемента 
42
1.3.1. Биологические функции системы комплемента 
43
1.3.2. Активация системы комплемента 
43
1.4. Конъюгаты —  меченые иммунореагенты 
46
2. Физико-химические основы взаимодействия антигена с антителом 
59
2.1. Закономерности взаимодействия Аг —  Ат 
59
2.2. Аффинность и авидность 
69
3. Методы иммунохимического анализа 
71
3.1. Методы без использования меток (меченых реагентов) 
71
3.1.1. Реакция преципитации 
71
3.1.1.1. Реакция кольцепреципитации 
73
3.1.1.2. Реакция преципитации в геле 
74
3.1.1.3. Реакция флоккуляции 
76
3.1.2. Реакция агглютинации 
77
3.1.3. Иммуноэлектрофорез 
89
3.1.3.1. Ракетный иммуноэлектрофорез 
92

3.1.3.2. Встречный иммуноэлектрофорез (электросинерез) 
94
3.1.3.3. Перекрестный (двумерный) иммуноэлектрофорез 
95
3.1.4. Реакция нейтрализации 
98
3.1.5. Реакции связывания комплемента 
100
3.1.5.1. Реакция радиального гемолиза 
104
3.1.5.2. Реакция иммунного прилипания 
105
3.2. Методы с использованием меток (меченых реагентов) 
106
3.2.1. Радиоиммунный анализ 
106
3.2.2. Флуоресцентный иммунный анализ 
111
3.2.3. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ 
114
3.2.4. Иммуноферментный анализ 
117
3.2.5. Иммуноблоттинг 
136
3.2.6. Иммунохроматографический анализ 
139
Библиографический список 
147

ОТ АВТОРОВ

В основу настоящего учебного пособия положен курс лекций «Иммуно-
химические и молекулярно-генетические методы анализа», который читается 
в Химико-технологическом институте УрФУ. Пособие предназначено для магис-
трантов, обучающихся по магистерским программам «Молекулярная биотех-
нология и биоинженерия», «Клеточные и генные технологии в косметологии, 
фармацевтике и медицине будущего», и студентов бакалавриата, обучающихся 
по направлению «Биотехнология».
Включение курса «Иммунохимические и молекулярно-генетические методы 
анализа» в учебные планы связано с широким использованием данных методов 
не только в медицине, но и в смежных областях науки, с разработкой новых 
научных направлений на стыке иммунологии и биотехнологии, иммунологии 
и экологии.
Курс ориентирован главным образом на магистрантов, обладающих хоро-
шей подготовкой по таким базовым дисциплинам, как микробиология, био-
химия, биотехнология, знакомых с основами иммунохимии и молекулярной 
биологии, а также с современными физико-химическими методами исследо-
вания, владеющих навыками работы на лабораторных приборах.
Состоит учебное пособие из трех глав. В первой главе описаны особенности 
строения основных типов иммунореагентов, применяемых в иммуноанализе: 
антигенов, антител, комплемента, конъюгатов (меченых иммунореагентов), 
охарактеризованы их свойства и методы получения. Вторая глава посвящена 
взаимодействию антигенов с антителами. В третьей главе, самой объемной, 
рассматриваются основные методы иммуноанализа.
Авторы настоящего учебного пособия ставят своей задачей помочь студен-
там свободно ориентироваться в разнообразии широкого спектра современных 
иммунохимических и молекулярно-генетических методов анализа, их аналити-
ческих и сравнительных характеристиках, сформировать навыки грамотного 
подбора оптимальных методических средств в зависимости от поставленных 
исследовательских или практических задач.
Представленные в пособии материалы структурированы по единому плану: 
сначала излагается принцип рассматриваемого метода, далее следует краткое опи-
сание постановки эксперимента, затем приводятся варианты его практического 
использования и, наконец, указываются достоинства и ограничения.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Аг —  антиген, антигены
Ат —  антитело, антитела
ГАТ —  гипоксантин —  аминоптерин —  тимидин
БСА —  бычий сывороточный альбумин
ИФА —  иммуноферментный анализ
ИХА —  иммунохроматографический анализ
мАт —  моноклональные антитела
пАт —  поликлональные антитела
ПХ —  пероксидаза хрена
ПЭГ —  полиэтиленгликоль
РИА —  радиоиммунный анализ
РСК —  реакция связывания комплемента
ЩФ —  щелочная фосфатаза
CD (Cluster of Differentiation) —  кластер дифференциации
Е (Enzyme) — фермент
MHC (Major Histocompatibility Complex) — главный комплекс гистосовместимости

ВВЕДЕНИЕ

Иммунохимические методы анализа, основанные на специфическом взаи-

модействии антигенов со специфическими антителами, прочно вошли в ана-
литическую практику. Такие методы обладают высокой чувствительностью, 
специфичностью, требуют минимального количества исследуемого материала, 
позволяют получить количественные, объективные результаты.
Иммуноанализ используют с диагностическими целями практически 
во всех областях медицины, а также в ветеринарии. Методы иммуноанализа 
с успехом применяют в молекулярной биологии, микробиологии, физиологии 
для изучения живых систем на всех уровнях. Биотехнологи при получении, вы-
делении и очистке биологически активных веществ из природных источников, 
создании генетически модифицированных организмов, контроле их качества 
и биобезопасности в настоящее время редко обходятся без иммунологических 
подходов и методов.
Методы иммуноанализа широко используют для решения широкого круга 
прикладных задач в микробиологической и пищевой промышленности, сельс-
ком хозяйстве, санитарной практике, судебно-медицинской экспертизе, для 
целей охраны окружающей среды.

1. РЕАГЕНТЫ  
ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

1.1. Антигены

А н т и г е н ы  — это биополимеры, способные вызывать иммунологичес-

кие реакции: синтез антител, реакции клеточного иммунитета, повышенную 
чувствительность, иммунологическую толерантность, иммунологическую 
память.
Как правило, антигенами являются высокомолекулярные вещества с харак-
терным химическим строением. Роль антигенов могут выполнять чужеродные 
простые белки, сложные белки (глико-, липо-, нуклеопротеины), полисахариды, 
синтетические полипептиды.
Антигенные свойства отдельных веществ могут проявляться тогда, когда 
они входят в состав сложных систем и смесей. Поэтому термин «антиген» при-
меняют к таким сложным системам, как микробные, растительные и животные 
клетки, тканевые экстракты, биологические жидкости. При этом имеются в виду 
отдельные содержащиеся в этих системах антигены.
Антигены могут быть инфекционными и неинфекционными, растворимы-
ми или клеточными (корпускулярными) субстанциями.
В зависимости от происхождения различают экзоантигены и эндоантигены.
Экзоантигены попадают в организм извне алиментарным, ингаляцион-
ным или парентеральным путем. К экзоантигенам относятся микроорганизмы, 
трансплантированные клетки и чужеродные частицы.
Эндоантигены образуются в самом организме и подразделяются на ауто-
антигены и неоантигены.
Аутоантигены —  это структурно не измененные молекулы, синтезируемые 
в организме в физиологических условиях. В норме аутоантигены не вызывают 
реакцию иммунной системы вследствие сформировавшейся иммунологической 
толерантности (невосприимчивости) либо их недоступности для контакта 
с факторами иммунитета —  это так называемые забарьерные антигены (напри-
мер, белки нервной ткани, хрусталика и сперматозоиды). При срыве толерант-
ности или нарушении целостности биологических барьеров (наиболее частая 
причина —  травма) компоненты иммунной системы начинают специфически 

реагировать на аутоантигены выработкой специфических факторов иммунитета 
(аутоантител, клонов аутореактивных лимфоцитов).
Неоантигены формируются в организме в результате патологических про-
цессов (ожоги, обморожения, вирусные и бактериальные внутриклеточные 
инфекции), мутаций, что приводит к появлению белковых молекул с при-
знаками чужеродности. К неоантигенам относят и новые тканевые антигены, 
возникающие при образовании злокачественных опухолей.
По генетическому отношению антигены делятся на аутоантигены, изоан-
тигены, аллоантигены и ксеноантигены.
Изоантигены (или индивидуальные антигены) —  это антигены, общие 
только для генетически идентичных организмов, например для однояйцевых 
близнецов, животных инбредных линий. Примером таких антигенов в попу-
ляции людей являются антигены гистосовместимости.
Аллоантигены (или групповые антигены) —  это антигены, общие для  
генетически не родственных, но относящихся к одному виду организмов. На ос-
новании аллоантигенов общую популяцию организмов можно подразделить 
на отдельные группы. Примером таких антигенов у людей являются антигены 
групп крови (системы АВ0 и др.).
Ксеноантигены (устаревшее —  гетерологичные антигены) —  это антигены 
тканей и клеток организмов разных видов. Например, лошадиная сыворотка 
является ксеногенным антигеном для человека. Как правило, ксеногенные ан-
тигены высокоиммуногенны.
По способности вызывать иммунный ответ выделяют антигены полно-
ценные (иммуногены) и неполноценные (гаптены).
Полноценные антигены индуцируют выработку специфических факторов 
иммунитета и взаимодействуют с ними. По химической природе полноценные 
антигены —  это белки (простые и сложные), полисахариды, липополисахариды, 
полипептиды.
Гаптены —  это субстанции, которые самостоятельно иммунный ответ 
не вызывают, но приобретают эту способность, будучи конъюгированными 
с высокомолекулярными белковыми носителями или в смеси с ними.
Гаптены подразделяются на простые и сложные.
Простые гаптены —  это низкомолекулярные соединения или простые 
химические вещества (динитрофенол, анилин, эфирные масла, никель, хром, 
бериллий и др.).
Сложными гаптенами могут быть липиды, нуклеиновые кислоты, олиго-
пептиды, стероиды, лекарственные препараты и др.
Попадая в организм индивида, гаптены соединяются с его структурными 
и функциональными белками, приобретают свойства полноценных антигенов 
и индуцируют иммунный ответ.

Антитела, образующиеся к гаптену, связанному с белком, в последующем 
могут взаимодействовать и со свободным гаптеном. Этот прием позволяет 
получать антитела практически к любому химическому веществу.
В молекуле полноценного антигена выделяют две функционально разные 
единицы: антигенную детерминанту (синоним —  эпитоп) и носитель.
А н т и г е н н о й  д е т е р м и н а н т о й  называется часть молекулы анти-
гена, оказывающая иммуногенное действие и способная взаимодействовать 
с активным центром антитела. В молекулах белков антигенная детерминанта 
образуется совокупностью аминокислотных остатков. Размер антигенной де-
терминанты белков может включать от 5–7 до 100 аминокислотных остатков.
Носителями в молекулах естественных антигенов чаще всего являются 
белки и полисахариды, а также липополисахариды и нуклеиновые кислоты. 
В искусственных антигенах роль носителей выполняют органические полимеры 
(синтетические полипептиды, полисахариды, полиэлектролиты и др.).
Количеством эпитопов в молекуле антигена определяется его валентность. 
Одна молекула антигена может иметь от нескольких единиц до нескольких сотен 
эпитопов разной специфичности. Так, яичный альбумин (М 42 000) имеет 5 эпи-
топов, то есть 5-валентен, а белок тиреоглобулин (М 680 000) —  40-валентен.
Разные эпитопы вызывают синтез антител разной специфичности. Если 
антиген двухвалентен, то к нему вырабатываются как минимум два вида антител, 
специфичных к двум эпитопам этого антигена. Если антигеном являются 
бактерия или вирус, то количество антител, вырабатывающихся к ним, равно 
суммарной валентности всех антигенных структур возбудителя. Так, ВИЧ содержит 
наружные антигены gp120, gp41, внутренние антигены р24, р17, р9, р7, 
р64 (обратная транскриптаза), р22 (протеаза), р31 (эндонуклеаза / интеграза), 
и ко всем этим антигенам вырабатываются антитела.
При попадании в организм антиген вступает во взаимодействие с иммунокомпетентными 
клетками: происходит распознавание антигена. В этом процессе 
ведущую роль играют лимфоциты. По своей способности реагировать 
с разными популяциями лимфоцитов и вызывать специфические иммунологические 
реакции антигены делятся на тимусзависимые и тимуснезависимые.
Тимусзависимые антигены —  это антигены, реакция на которые генетически 
контролируется комплексом гистосовместимости и осуществляется с обязательным 
участием Т-лимфоцитов-хелперов (Тх-клеток), а также макрофагов 
и В-лимфоцитов. Большинство природных антигенов относятся к тимусзави-
симым: трансплантационные, тканеспецифические антигены, сывороточные 
белки, бактериальные токсины, многие антигены вирусов, антигены чужеродных 
эритроцитов.
Тимуснезависимые антигены —  антигены, выработка антител к которым 
осуществляется В-клетками без участия Тх-клеток. К тимуснезависимым ан-

тигенам относятся некоторые микробные полисахариды и липополисахариды 
(пневмококковый полисахарид, полисахарид кишечной палочки). Эти антигены 
индуцируют синтез антител, в основном принадлежащих к классу иммуноглобулина 
М.
Для тимуснезависимых антигенов характерны наличие большого количества 
одинаковых эпитопов (антигенных детерминант) и большая молекулярная 
масса.
В процессе дифференциации на мембранах клеток системы иммунитета 
появляются макромолекулы, получившие название дифференцировочных 
антигенов, или CD-антигенов (от англ. clusters of differentiation —  кластеры 
дифференциации). В настоящее время известно более 200 CD-антигенов. Эти 
антигены выполняют функцию специфических маркеров, по которым можно 
определить направление развития, степень зрелости клеток, их популяцию 
и субпопуляцию, стадию дифференциации и активации.

1.1.1. Свойства антигенов
Основные свойства, характеризующие вещество как антиген, таковы: ан-
тигенность, специфичность, иммуногенность.
А н т и г е н н о с т ь  —  это способность антигена специфически взаимодействовать 
с факторами иммунитета (антителами, клонами эффекторных 
лимфоцитов). Любые вещества, являющиеся генетически чужеродными, распознаются 
иммунной системой, то есть обладают антигенностью. Полноценные 
антигены обладают и антигенностью, и иммуногенностью. Гаптены распознаются 
иммунной системой при связывании с В-клеточными рецепторами 
лимфо цитов, но дальнейшего развития иммунного ответа не происходит, так 
как данные субстанции не являются иммуногенами. Тем не менее гаптены 
способны взаимо действовать с готовыми антителами, выработанными против 
них, при иммунизации животного конъюгатом гаптен —  носитель (рис. 1.1).
С п е ц и ф и ч н о с т ь  —  это способность антигена взаимодействовать 
со строго определенными антителами или антигенными рецепторами лим-
фоцитов. Иммунологическая специфичность антигенов определяется не всей 
макромолекулой антигена в целом, а структурой антигенных детерминант 
(аминокислотным составом и последовательностью аминокислот, характе-
ром, положением, стереоизомерией химических группировок в детерминанте, 
вторичной и третичной структурой детерминанты). Иммунологической спе-
цифичностью обладают и гаптены, которые специфически взаимодействуют 
с готовыми антителами.
Замены одной-двух аминокислот в составе полипептидной цепи молекулы 
белка или концевых аминокислот часто достаточно для того, чтобы молекулы