Молекулярно-генетические методы в исследовании растений

Екатеринбург

Издательство Уральского университета

2017

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

УРАЛЬСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ ПЕРВОГО ПРЕЗИДЕНТА РОССИИ Б. Н. ЕЛЬЦИНА

Н. А. Кутлунина, А. А. Ермошин

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ

МЕТОДЫ

В ИССЛЕДОВАНИИ РАСТЕНИЙ

Учебно-методическое пособие

Рекомендовано методическим советом УрФУ

для студентов, обучающихся по программам бакалавриата

по направлениям подготовки

06.03.01 «Биология», 05.03.06 «Экология и природопользование»

ББК 575.088(07)
        К95

В учебно-методическом пособии рассмотрены современные подходы

к молекулярно-генетическим исследованиям растений. Подробно показаны
методы анализа изоферментов и нуклеиновых кислот. В пособие включены
лабораторные работы для больших и малых спецпрактикумов.

Рекомендуется студентам для самостоятельной работы и выполнения

лабораторных работ при изучении дисциплин «Физические методы в биологии», «Филогения и филогеография» и др.

Кутлунина, Н. А.

Молекулярно-генетические методы в исследовании рас
тений : учеб.-метод. пособие / Н. А. Кутлунина, А. А. Ермошин ; М-во образования и науки Рос. Федерации, Урал. федер. ун-т. – Екатеринбург : Изд-во Урал. ун-та, 2017. – 142 с.

ISBN 978-5-7996-2142-1

К95

ISBN 978-5-7996-2142-1

Р е ц е н з е н т ы:

лаборатория филогенетики и биохронологии

Института экологии растений и животных УрО РАН

(заведующий лабораторией доктор биологических наук А. В. Бородин);

А. Х. Баймиев, доктор биологических наук,

заведующий лабораторией молекулярной биологии

и нанобиотехнологии;

Б. Р. Кулуев, доктор биологических наук, старший научный сотрудник

(Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН)

ББК 575.088(07)

© Уральский федеральный университет, 2017

На обложке:

камера для горизонтального электрофореза и источник тока фирмы Bio-Rad;

электрофореграмма ПЦР-продуктов в агарозном геле

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие ............................................................................................................ 6

1. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ ............................................................................... 8

1.1. Принцип метода электрофореза белков.

Электрофоретическая подвижность ....................................................... 8

1. 2. Классификация электрофоретических методов ................................. 11
1.3. Особенности электрофореза в полиакриламидном геле ................. 14
1.4. Нативный и SDS-ПААГ-электрофорез ................................................. 16
1.5. Диск-электрофорез ................................................................................... 17
1.6. Аллозимный анализ .................................................................................. 17
Лабораторная работа 1
Электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях .................. 22
Лабораторная работа 2
Проявление электрофореграмм с помощью красителя кумасси .......... 25
Лабораторная работа 3
Определение молекулярной массы белка в геле ....................................... 26
Лабораторная работа 4
Нативный электрофорез. Выявление
изоферментных спектров пероксидазы ....................................................... 27
Лабораторная работа 5
Выявление изоферментных спектров супероксиддисмутазы ................ 29
Лабораторная работа 6
Изоферментный анализ генетического полиморфизма
в популяции растений ...................................................................................... 30

2. ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ............................................................................................ 35

2.1. Растительный материал для выделения ДНК ....................................... 35
2.2. Особенности выделения ДНК из растительных объектов ................ 35
Лабораторная работа 7
Метод солевой экстракции ДНК с фенольной депротеинизацией ........ 40
Лабораторная работа 8
Выделение суммарной ДНК из растений по Devey et al.
с небольшими модификациями .................................................................... 42

Лабораторная работа 9
Выделение геномной ДНК (с мочевиной) .................................................. 43
Лабораторная работа 10
Быстрый метод выделение ДНК из растительных тканей ........................ 45
Лабораторная работа 11
Выделение ДНК растений с использованием СТАВ ................................. 46
Лабораторная работа 12
Дополнительная очистка ДНК ....................................................................... 48

3. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ ПРЕПАРАТОВ ДНК И РНК ............................ 50

Лабораторная работа 13
Спектрофотометрическое определение концентрации ДНК .................. 51
Лабораторная работа 14
Определение концентрации нуклеиновых кислот микрометодом ........ 53

4. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ ..................................................... 56

4.1. Суть метода ПЦР ....................................................................................... 56
4.2. Модификации метода ПЦР ...................................................................... 69
4.3. Преимущества ПЦР перед другими методами ................................... 77
4.4. Практическое применение  и перспективы развития метода ПЦР   78
Лабораторная работа 15
Проведение ПЦР-амплификации ДНК с ISSR-праймерами ................... 79
Лабораторная работа 16
Проведение ПЦР-амплификации ДНК с ITS-праймерами ..................... 81
Лабораторная работа 17
Определение наличия ГМО в продуктах питания ..................................... 82

5. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ........................................... 84

Лабораторная работа 18
Электрофорез в 6 % полиакриламидном денатурирующем геле
и процедура окраски полиакриламидных гелей нитратом серебра ...... 88
Лабораторная работа 19
Электрофорез в 1 % агарозном геле и ТАЕ-буфере ................................. 90
Лабораторная работа 20
Выделение ДНК из агарозного геля  и ее очистка ..................................... 91

6. СЕКВЕНИРОВАНИЕ ......................................................................................... 94

6.1. Секвенирование ДНК по Максаму и Гилберту:

метод химической деградации ............................................................... 94

6.2. Секвенирование ДНК по Сэнгеру: «плюс-минус» метод ................ 96
6.3. Секвенирование ДНК по Сэнгеру: метод «терминаторов» ............. 97
6.4. Автоматическое секвенирование ДНК ............................................... 101
6.5. Методы секвенирования нового поколения ...................................... 101
Лабораторная работа 21
Подготовка образцов к сиквенсной реакции.
Метод прямого переосаждения ДНК в мягких условиях ....................... 105

7. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ ................. 108

7.1. Особенности растительного генома ................................................... 108
7.2. Молекулярные маркеры ........................................................................ 109
7.3. RAPD-анализ ............................................................................................. 113
7.4. ISSR-маркирование ................................................................................. 114
7.5. SSR-маркеры ............................................................................................. 116
7.6. AFLP-метод ................................................................................................ 118
7.7. SNP .............................................................................................................. 120

Список библиографических ссылок .............................................................. 122

Глоссарий ............................................................................................................. 126

Учебное оборудование ..................................................................................... 138

ПРЕДИСЛОВИЕ

Биология – самая быстро развивающаяся наука второй поло
вины ХХ и ХХI в. Крупные открытия в биологии (выявление структуры ДНК, полимеразная цепная реакция, создание ДНК-чипов, секвенирование), а также значительно возросшие технические возможности позволили сформироваться науке молекулярной биологии
и целой группе методов, известных как молекулярные или молекулярно-генетические методы. В настоящее время эти методы активно применяются не только в биологии, но и в других областях:
медицине, криминалистике, археологии.

Современную биологию невозможно представить без молеку
лярно-генетических методов. Первыми были методы, основанные
на полиморфизме белков. Изоферментный анализ позволяет выявлять уровень полиморфизма популяций, их генетическую структуру, определять уровень генетической закрытости или, наоборот,
открытости популяций и многое другое. В настоящее время эти методы продолжают использоваться, но большинство исследователей
и лабораторий переходят на анализ полиморфизма нуклеиновых
кислот. Отчасти это связано с тем, что белки можно выделять только из живого материала или из замороженного при температуре
–70–80 оС, тогда как ДНК можно выделять и из живого, и из высушенного материала. Кроме того, методы ДНК-анализа позволяют изучать как ядерный, так и пластидный и митохондриальный геномы. В связи с этим молекулярно-генетические методы, основанные
на полимеразной цепной реакции и секвенировании ДНК, активно используются в таких областях исследования растений, как:

– генетический полиморфизм природных популяций;
– анализ чистоты сортов;
– выявление гибридов;
– выявление филогенетических связей видов, родов и таксо
нов более высокого уровня;

– анализ транскрипционной активности генов.

При изучении обязательных курсов на биологическом факуль
тете студенты знакомятся с современными методами анализа, в том
числе молекулярно-генетическими. Выпускники, владеющие этими
методами, востребованы в лабораториях и исследовательских центрах города, области и региона. В последние годы опубликовано
большое количество монографий и пособий, охватывающих широкий круг вопросов молекулярной биологии. В то же время каждый
научный центр имеет свою специфику, пользуется своими наработками и методиками. Поэтому цель данного учебно-методического
пособия – систематизировать методики, которые используются
при исследовании растений. Важной особенностью пособия является наличие теоретических разделов, которые способствуют пониманию практического материала и служат опорой при самостоятельной работе студентов.

При написании пособия использовались монография В. Е. Па
дутова с соавт. (2007), статьи Е. К. Хлесткиной (2011, 2013) и Н. А. Рябушкиной с соавт. (2012), а также учебно-методические пособия
И. В. Стручковой и Е. А. Кольясовой (2012), В. А. Великова (2013),
«Основы полимеразной цепной реакции» (2012) и др.

Учебно-методическое пособие предназначено для студентов
бакалавров и магистрантов, изучающих молекулярно-генетические
курсы и выполняющих квалификационные работы по соответствующей тематике, а также для аспирантов и научных сотрудников.

1.  ЭЛЕКТРОФОРЕЗ  БЕЛКОВ

Метод электрофореза, предложенный еще в начале ХХ в., сей
час широко используют в биологии и медицине для разделения белков в исследовательских и клинических целях. С помощью электрофореза можно разделить на отдельные компоненты белковую
смесь, что позволяет установить молекулярную массу белка или его
субъединиц, подтвердить чистоту выделенного белка.

Электрофорезом называют движение заряженных частиц

в растворе под действием электрического поля.

Электрофоретический метод в биохимии – это способ про
странственного разделения молекул, имеющих разный заряд и размеры, путем помещения их в электрическое поле.

Результатом проведения электрофореза является электрофо
реграмма – картина, полученная после разделения сложной смеси
с помощью электрофореза и специфического проявления. Электрофореграммы белков-ферментов (зимограммы) позволяют изучать
изменения активности и изоферментного спектра белков под действием внешних и внутренних факторов как у растений, так и у других организмов.

1.1. Принцип метода электрофореза белков.

Электрофоретическая подвижность

В растворе белки находятся в виде заряженных частиц. Заряд

на поверхности белков возникает в результате диссоциации группировок, находящихся в боковых радикалах аминокислот (карбоксильных, амино-, имидазольных и других групп), а также при связывании ионов. Так как степень диссоциации группировок зависит
от рН раствора, то величина и знак суммарного заряда белковой
молекулы зависят от рН среды, а также от ионной силы (интенсивности электрического поля, создаваемого ионами в растворе).

Для расчета ионной силы следует найти произведение концент
рации каждого иона на квадрат его заряда, сложить все полученные величины и итоговую сумму разделить пополам. Если в растворе присутствуют два или более электролитов, то вычисляется общая
суммарная ионная сила раствора. Для каждого белка существует
такое значение рН среды (обозначаемое как рI – изоэлектрическая точка), при котором положительные и отрицательные заряды
ионизированных групп скомпенсированы, поэтому заряд всей белковой молекулы равен нулю. В буфере с рН, равным рI изучаемого
белка, отсутствие заряда на белковой молекуле делает невозможным
ее движение в электрическом поле. Из-за разницы в аминокислотном составе разные белки имеют разные значения рI. При рН  pI
молекулы белка приобретают заряд и под действием электрического поля перемещаются к противоположно заряженному электроду –
катоду (–) или аноду (+). Например, кислые белки, богатые моноаминодикарбоновыми аминокислотами (асп, глу), в слабощелочном
буфере приобретут отрицательный суммарный заряд из-за диссоциации СООН-групп до СОО– и H+ и будут двигаться к аноду.

Для электрофоретического разделения оптимально такое зна
чение рН рабочего буфера, которое обусловливает максимальное
различие зарядов разных белков, составляющих исходную смесь,
а не их максимальный заряд. Обычно электрофорез проводят
в среде (буфере) со значением рН, на 3–4 единицы отличающимся от среднего значения рI для белков данного типа. Это позволяет
добиться хорошей электрофоретической подвижности и вместе
с тем сохранить ощутимые различия молекул по заряду. Предпочтительно использовать буфер известной и постоянной ионной силы
на основе однозарядных ионов. От рабочего буфера также требуется существенная емкость, так как локальная концентрация белка
в образующихся при разделении смеси зонах скопления молекул
может оказаться значительной. Поэтому используют буферы с концентрацией не менее 0,1–0,2 М.

При проведении электрофореза электрическое поле создают

с помощью источника питания – стабилизированного выпрямителя, способного давать регулируемое напряжение до 500–1000 В

при силе тока в несколько десятков миллиампер (мА). Напряжение на участке электрической цепи равно разности потенциалов
на концах этого участка, если на этом участке нет источника сторонних сил, разделяющих разноименные заряды. При электрофорезе
участок электрической цепи – это буфер. Электрофорез проводят
в однородном электрическом поле, т. е. поле, напряженность (E)
которого во всех точках одинакова. Электрический ток пропускают
через проводник – буферный раствор, налитый в канал из изолирующего материала (например, стекла) или пропитывающий какую-либо поддерживающую среду-носитель (например, бумагу
или гель). Сопротивление (R) буферного раствора задается двумя факторами: концентрацией в нем свободных ионов и их электрофоретической подвижностью. Электрофоретической подвижностью (u)
данной молекулы называют скорость движения заряженной молекулы (см/ч) в электрическом поле с напряженностью 1 В/см. Единицей электрофоретической подвижности является см2/ч В.

Именно различия в электрофоретической подвижности бел
ков, содержащихся в анализируемой смеси, позволяют разделить
эти белки в пространстве (в разных зонах электрофореграммы).
Скорость (V) движения белков к тому или иному электроду снижается из-за их трения об окружающую среду. Сила трения (или, иначе, сила сопротивления окружающей среды) прямо пропорциональна скорости движения белковых молекул. Коэффициент трения
белковой молекулы, обозначенный как f, зависит от размера, формы, степени гидратированности этой молекулы и от свойств самой
среды. При электрофорезе работа силы трения заряженных компонентов разделяемой смеси о среду приводит к нагреву геля. Кроме
того, образование тепла вызывается прохождением электрического
тока. В итоге происходит значительное возрастание температуры,
которое ухудшает результаты электрофоретического разделения,
так как изменяет вязкость и проводимость среды, увеличивает скорость диффузии молекул, способствует испарению летучих компонентов, приводит к денатурации белков. Поэтому при проведении
электрофореза следует обеспечить охлаждение системы.