Биохимия : практикум

Екатеринбург
Издательство Уральского университета
2017

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

УРАЛЬСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ 

ИМЕНИ ПЕРВОГО ПРЕЗИДЕНТА РОССИИ Б. Н. ЕЛЬЦИНА

БИОХИМИЯ

Практикум

Рекомендовано методическим советом УрФУ
в качестве учебно-методического пособия для студентов, 
обучающихся по программам бакалавриата и специалитета 
по направлениям подготовки 06.03.01 «Биология», 
05.03.06 «Экология и природопользование»,
30.05.01 «Медицинская биохимия», 
30.05.02 «Медицинская биофизика»

© Уральский федеральный университет, 2017

А в т о р ы:
Г. Г. Борисова, Н. В. Чукина, И. С. Киселева, М. Г. Малева

Р е ц е н з е н т ы:
кафедра ботаники, физиологии и экологии растений 
факультета биотехнологии и биологии 
Национального исследовательского Мордовского государственного 
университета (заведующий кафедрой доктор биологических наук, 
профессор А. С. Лукаткин);
С. И. Неуймин, кандидат биологических наук, доцент, 
заведующий кафедрой ботаники и фармакогнозии 
Уральского государственного медицинского университета

П о д  о б щ е й  р е д а к ц и е й
доктора географических наук, профессора Г. Г. Борисовой

УДК 577(07)
      Б638

Биохимия : практикум : [учеб.-метод. пособие] / [Г. Г. Борисова, 
Н. В. Чукина, И. С. Киселева, М. Г. Малева ; под общ. ред. Г. Г. Борисовой] ; М-во образования и науки Рос. Федерации, Урал. федер. 
ун-т. — Екатеринбург : Изд-во Урал. ун-та, 2017. — 116 с.

ISBN 978-5-7996-2057-8

Учебно-методическое пособие включает 14 лабораторных работ, цель которых — ознакомление студентов с классическими методами биохимического 
анализа, закрепление навыков работы с лабораторным оборудованием. Представлены описания лабораторных работ по типовой схеме, а также иллюстративный материал, таблицы, контрольные вопросы и задания для самопроверки, тестовые задания, библиографический список, словарь терминов.
Для студентов, обучающихся по направлениям «Биология», «Экология 
и природопользование», «Медицинская биохимия», «Медицинская биофизика».

Б638

УДК 577(07)

ISBN 978-5-7996-2057-8

Биохимия является одним из фундаментальных разделов современной биологии, изучающим химические основы функционирования живых систем, а именно: основные классы органических 
веществ живых организмов и пути их превращения. 
Задачи курса: формирование представлений об организации живых систем на молекулярном уровне и единстве их происхождения; 
ознакомление с процессами превращения веществ и энергии, протекающими в живых организмах, и их регуляцией; изучение роли 
и перспектив биохимии в решении практических задач физиологии, 
биотехнологии, сельского хозяйства и медицины; ознакомление 
с основными принципами и методами биохимических исследований.
Учебно-методическое пособие нацелено на повышение эффективности и результативности самостоятельной работы студентовбакалавров при изучении курса общей биохимии и обеспечение 
контроля за ходом самостоятельной работы.
Пособие состоит из двух основных разделов. В первом разделе 
представлен лабораторный практикум по биохимии. После описания каждой работы приведен перечень вопросов для самопроверки. 
Второй раздел включает контрольные задания для самостоятельной 
работы студентов по основным темам курса, в том числе тестовые 
задания. В конце пособия приведен перечень наиболее употребительных в современной биохимии терминов и даны их определения. 
Представлен список рекомендуемых библиографических источников, включая основную и дополнительную литературу. 

ÏÐÅÄÈÑËÎÂÈÅ

Лабораторный практикум по биохимии включает 14 работ, 
основанных на количественном или качественном анализе биологического материала. Цель практикума — ознакомление студентов 
с основными методами биохимического анализа, а также закрепление навыков работы с лабораторным оборудованием.

Правила техники безопасности 
при работе в биохимической лаборатории

1. Работу в лаборатории необходимо выполнять в халатах.
2. При работе с химическими веществами нельзя пробовать их 
на вкус.
3. При приготовлении растворов кислот надо наливать кислоту 
в воду, а не наоборот.
4. Все опыты с концентрированными кислотами, щелочами, газообразными веществами, органическими растворителями следует 
производить в вытяжном шкафу.
5. При попадании на кожу кислоты с высокой концентрацией ее 
необходимо смыть водой и после этого обработать слабым раствором гидрокарбоната натрия.
6. При попадании на кожу щелочи с высокой концентрацией ее 
нужно смыть водой, а затем слабым раствором уксусной кислоты.
7. При сильных ожогах кожу необходимо смочить крепким раствором перманганата калия.
8. Пробирки с жидкостью при нагревании надо держать наклонно в сторону от себя и от соседа.

ËÀÁÎÐÀÒÎÐÍÛÉ ÏÐÀÊÒÈÊÓÌ

9. Нельзя набирать реактивы в пипетку ртом, следует пользоваться грушей.
10. Концентрированные кислоты и другие вредные и ядовитые 
вещества нужно выливать в специально отведенную для этого 
емкость.
11. Запрещается работать с огнеопасными веществами в одиночку и оставлять без присмотра включенные электроприборы.
12. Запрещается нагревать воду и растворы в закрытых сосудах.

Лабораторная работа 1

Разделение свободных аминокислот 
растительного материала 
методом хроматографии на бумаге

Метод хроматографии на бумаге используется для разделения 
смесей разнообразных органических веществ. Разделение веществ 
происходит вследствие различия в распределении их между двумя 
жидкими фазами, одна из которых подвижна. Неподвижная фаза — 
вода — удерживается твердым носителем (в данном случае бумагой), 
не вступая с ним во взаимодействие. Нанесенные на бумагу вещества переходят в подвижную фазу (органический растворитель) и, 
перемещаясь с различными скоростями по бумажным капиллярам, 
разделяются. Скорость передвижения влияет на показатель распределения (Rf), представляющий отношение величины смещения 
зоны вещества (х) к смещению фронта растворителя (хf) (рис. 1). 
Для однотипных веществ при постоянных условиях величина 
Rf является ориентиром, позволяющим их идентифицировать. Чем 
больше различие в величинах Rf разделяемых веществ, тем лучше 
их разделение.

Цель работы. Ознакомиться с хроматографическим методом 
разделения аминокислот, провести экстракцию растительного 
материала, разделить смесь аминокислот и осуществить их идентификацию.

Оборудование и реактивы 
1. Штативы с пробирками на 10 мл.
2. Пипетки и микропипетки.
3. Фарфоровые чашки (средние и маленькие).
4. Воронки средние и фильтры.
5. Цилиндры мерные.
6. Хроматографическая и фильтровальная бумага.
7. Стеклянные палочки, пинцеты и стеклянные трубки с ватой.
8. Хроматографические камеры.
9. Водяные бани.

Рис. 1. Определение Rf вещества:
1 — расположение вещества на хроматограмме

10. Электроплитки.
11. Весы торсионные.
12. Препаровальные иглы с кусочками резины.
13. Иголки швейные и нитки.
14. Сухой растительный материал для экстракции.
15. Смесь растворителей (н-бутанол : муравьиная кислота : вода).
16. Растворы аминокислот-свидетелей (арг, ала, гли, вал, лиз, лей).

Фронт 
растворителя

Линия старта

17. Растворы спирта этилового (70 %), НСl (1 %).
18. Раствор нингидрина (0,25 %) в смеси этиловый спирт : ацетон (1 : 1). 

1.1. Проведение экстракции растительного материала 
и подготовка хроматограммы к разделению аминокислот

Ход работы 
Для проведения экстракции 0,3 г растительного материала помещают в пробирку на 10 мл, заливают 5 мл 70 % этилового спирта 
и ставят на водяную баню, разогретую до 70–80 °С, на 5 мин. Полученную вытяжку фильтруют через бумажный фильтр в выпарительную чашку, при этом следует стремиться, чтобы частички материала 
на фильтр не попадали, поскольку далее этот материал аналогичным 
способом экстрагируют еще раз. При фильтровании после второй 
экстракции на фильтр можно перенести все содержимое пробирки. 
Выпарительную чашку помещают на кипящую водяную баню и выпаривают спирт досуха.
Лист хроматографической бумаги размером 24 × 31 см кладут 
на рабочее место, подложив снизу лист чистой бумаги. Отступив 
2 см от края узкой стороны, проводят простым карандашом линию 
старта. Затем линию старта размечают короткими штрихами: отступив 1,5 см от края, делают первую отметку, следующую — через 
2,5 см, затем — через 2 см и т. д., чередуя отрезки 2,5 и 2 см. Всего 
отрезков по 2,5 см должно быть пять.
На три отрезка длиной 2,5 см наносят растворы известных 
аминокислот, так называемых свидетелей, на каждый — по две 
аминокислоты: 1 — арг, ала; 2 — гли, вал; 3 — лиз, лей. Аминокислоты предварительно попарно растворяют в фарфоровой чашке, для 
чего берут по 3–6 мг каждой аминокислоты (несколько кристаллов 
на кончике стеклянной палочки) и приливают 1 мл 1 % НСl. Перемешивают до растворения.
На два отрезка линии старта наносят полученный экстракт. Сухой остаток в выпарительной чашке растворяют в 0,6 мл 1 % НСl, 
тщательно соскабливая его со стенок кусочком резинки, наколотым 
на препаровальную иглу.

Подготовив исследуемый раствор и растворы свидетелей, приступают к нанесению. Выше линии старта под хроматограмму подкладывают линейку или пипетку, добиваясь того, чтобы линия старта 
не касалась подложки. Для нанесения используют стандартные 
микропипетки на 0,1 или 0,2 мл. Все свидетели наносят по 0,01 мл, 
пробу — по 0,01 и 0,02 мл. Набирают в микропипетку необходимый 
раствор в нужном объеме и, приведя ее в соприкосновение с началом соответствующего участка в 2,5 см, аккуратно ведут до конца. 
Скорость движения пипетки должна быть такой, чтобы весь объем 
раствора распределился в интервале в 2,5 см в виде ровной полосы.
После подсыхания линии старта хроматограмму сшивают в форме цилиндра. Для этого необходимо, соединив края встык, сшить 
их в 3–4 местах. Не следует накладывать края друг на друга: в утолщении скорость движения растворителя увеличивается, и качество 
разделения на крайних участках ухудшается.
Для хроматографии используют камеру из двух цилиндрических сосудов. На дно нижнего сосуда наливают 25–30 мл смеси: 
н-бутанол : муравьиная кислота : вода в соотношении 70 : 15 : 15. При 
приготовлении растворителя все компоненты должны быть хорошо 
перемешаны. Хроматограмму ставят в растворитель и закрывают 
верхним цилиндром. Необходимо проследить, чтобы хроматограмма 
нигде не касалась стенок камеры. Время разделения 10–12 ч.
При достижении фронтом растворителя верхнего края хроматограммы ее вынимают, отмечают карандашом линию фронта растворителя и сушат в сушильном шкафу.

1.2. Проявление хроматограммы 
и идентификация аминокислот

Ход работы
Высушенную хроматограмму проявляют раствором нингидрина, 
равномерно смачивая данным раствором ее поверхность. Для этого 
используется стеклянная трубка с ватой. При проявлении нельзя 
класть хроматограмму на стол, она должна находиться на весу.
Нельзя браться за смоченную поверхность руками, поскольку при этом остаются отпечатки пальцев. Пропитанную 

хроматограмму помещают в сушильный шкаф на 15 мин. при 
температуре 70 °С.
Большинство аминокислот окрашиваются нингидрином в синефиолетовый цвет. Пролин и оксипролин образуют с нингидрином 
соединения желтого цвета; триптофан — коричневого; фенилаланин, 
тирозин и аспартат — синего, а гистидин и глицин — красно-серого 
цвета.
Идентификацию аминокислот проводят по совпадению на 
хроматограмме положения аминокислот пробы и аминокислотсвидетелей. Аминокислоты, располагающиеся на одном уровне, 
являются идентичными. В разделенных парах свидетелей ближайшими к старту будут арг, гли, лиз.
Определение аминокислот можно осуществлять и по значению Rf . 
Для этого измеряют с точностью до миллиметра расстояние от линии 
старта до линии фронта растворителя (в данной работе это, как правило, верхний край хроматограммы). С такой же точностью измеряют 
расстояние от старта до центра цветового пятна идентифицируемой 
аминокислоты. Отношение последнего расстояния к первому дает 
значение Rf  для данной аминокислоты в данном растворителе. 
Помимо идентификации аминокислот экстракта по свидетелям, 
необходимо определить в пробе несколько аминокислот, для которых свидетели не наносились, по Rf . Значения Rf  для растворителя, 
состоящего из н-бутилового спирта, муравьиной кислоты и воды 
(в соотношении 7 : 1,5 : 1,5), приведены в табл. 1.

Таблица 1

Аминокислота
Rf
Аминокислота
Rf
Аминокислота
Rf
Аланин
0,51
Лейцин
0,78
Саркозин
0,47
Аргинин
0,25
Лизин
0,22
Серин
0,37
Аспартат
0,38
Метионин
0,69
Тирозин
0,5
Валин
0,73
Норвалин
0,80
Треонин
0,44
Гистидин
0,16
Норлейцин
0,87
Триптофан
0,59
Глицин
0,41
Оксипролин
0,39
Фенилаланин
0,76
Глутамат
0,42
Орнитин
0,16
Цистеин
0,07
Изолейцин
0,82
Пролин
0,58
Цистин
0,07