Молекулярная спектроскопия: основы теории и практика

Допущено 

Учебно-методическим объединением 

по классическому университетскому образованию 
в качестве учебного пособия для студентов высших 
учебных заведений, обучающихся по направлению 

06.03.01 «Биология» и смежным специальностям

Москва
ИНФРА-М

2022

МОЛЕКУЛЯРНАЯ
СПЕКТРОСКОПИЯ

ОСНОВЫ ТЕОРИИ 

И ПРАКТИКА

УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ 

Под редакцией профессора Ф.Ф. Литвина

УДК 539.194(075.8)
ББК 22.344я73

 М75

Молекулярная спектроскопия: основы теории и практика : 

учебное пособие / под ред. проф. Ф.Ф. Литвина. — Москва : 
ИНФРА- М, 2022. — 263 с. — (Высшее образование: Бакалавриат). — DOI 10.12737/1445.

ISBN 978-5-16-005727-9 (print)
ISBN 978-5-16-100667-2 (online)

Книга представляет собой введение в теорию и практику спектроскопии 

в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной области. Изложение теоретических основ сопровождается детальным руководством по практическому использованию спектроскопии для количественного и качественного анализа 
веществ и реакций в простых и сложных системах. Уделяется внимание современным методам инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием 
(FTIR), межмолекулярному переносу энергии (FRET), линейному дихроизму 
сложных объектов.

Книга предназначена для широкого круга биологов, химиков, студентов 

и аспирантов естественнонаучных специальностей.

УДК 539.194(075.8)

ББК 22.344я73

М75

© Ф.Ф. Литвин, В.Т. Дубровский, 

Р.А. Хатыпов, К.В. Неверов, 
Т.Н. Калабухова, Г.В. Микулинская, 
Л.Я. Сатина, 2013

ISBN 978-5-16-005727-9 (print)
ISBN 978-5-16-100667-2 (online)

А в т о р ы:
Ф.Ф. Литвин, В.Т. Дубровский, Р.А. Хатыпов, К.В. Неверов, 
Т.Н. Калабухова, Г.В. Микулинская, Л.Я. Сатина

Р е ц е н з е н т ы:
Л.П. Овчинников, академик, директор Института белка РАН;
Н.Б. Гусев, доктор биол. наук, профессор, зав. кафедрой биохимии 
МГУ им. М.В. Ломоносова;
И.П. Ермаков, доктор биол. наук, профессор, зав. кафедрой 
физиологии растений МГУ им. М.В. Ломоносова

ФЗ 

№ 436-ФЗ

Издание не подлежит маркировке 
в соответствии с п. 1 ч. 4 ст. 11

ПРЕДИСЛОВИЕ

В книге излагаются основные принципы и методы современной
спектроскопии, применительно к общим интересам биологов разных
специальностей от молекулярной биологии, биохимии, биофизики,
физиологии, до экологии, ботаники и зоологии. В первую очередь
она адресована начинающим свой путь исследователям, в том числе
студентам бакалавриата и магистратуры и будущим специалистам,
осваивающим конкретные, новые для них экспериментальные методы, основанные на использовании спектроскопии. В соответствии с
требованиями фундаментальности университетского образования
представляется необходимым ознакомление их с основами теории
спектроскопии, без которых невозможна постановка задачи, выбор
оптимальных условий спектральных измерений и их интерпретация.
Поэтому в книгу включен общий теоретический раздел, а каждая
инструкция к задаче содержит теоретическое введение. Основой
книги служит многолетний опыт (1968-2011), накопленный кафедрой физико-химической биологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Практикуму по биологической спектроскопии, в семестре предшествуют лекционные курсы по молекулярной спектроскопии
(проф. Ф.Ф. Литвин). При организации и проведении летней практики студентов на базе Филиала МГУ в г. Пущино в Пущинском научном центре биологических исследований РАН также читаются лекции, предшествующие практикуму.
Трудности выбора задач для
студентов разных кафедр связан с ограничением временных рамок
практикума (2-3 недели). Практикум включает комплекс задач, каждая из которых представляет самостоятельную законченную работу,
связанную с освоением конкретного спектрального метода и включающую достаточно широкий набор заданий с элементами наученного эксперимента. Задача рассчитана на 2-3 полных учебных рабочих дня. Главное место уделено основным наиболее важным и
востребованным направлениям абсорбционной и флуоресцентной
спектроскопии. Особое внимание обращено на методики, связанные
со спецификой биологических объектов, сохранения их целостности
и возможности прижизненного спектроскопического изучения биологической структуры и функции. Вместе с тем помимо стандартных методов рассматриваются такие направления, как дифференциальная абсорбционная спектроскопия, измерение спектров при
низкой температуре, линейный дихроизм, в книгу включены и более
сложные современные методы, такие как инфракрасная спектроскопия с Фурье-преобразованием (FTIR), исследования межмолекулярного переноса энергии (FRET). 
При описании методов особое внимание обращается на приборную часть, выбор оптимальных условий измерения, повышения их

точности и чувствительности, возможные источники ошибок и т.д.
Во многом книга обращена к преподавателям и руководителю практикума, от которых зависит отбор задач и упражнений в соответствии с реальной возможностью их осуществления.
Практикум по спектроскопии на биологическом факультете
МГУ, на основе которого написана книга, имеет большую историю.
В его создание и развитие вложен труд большого неформального
коллектива преподавателей биологического факультета МГУ и сотрудников институтов Научного центра биологических исследований РАН города Пущино.
В разные годы участие в разработке и проведении задач практикума кроме авторов книги участвовали: д.б.н. С.П. Балашов, д.б.н.
О.Б. Беляева, д.б.н. В.А.Бойченко, к.ф.-м.н. А.О. Ганаго, А.Ф. Грипась, к.ф.-м.н. Б.А. Гришковский, проф. С.Ю. Егоров, к.б.н. Е.И.
Ефимцев, к.б.н. Н.В. Игнатов, проф. В.В. Климов, проф. А.А. Красновский, к.б.н. А.Н. Мелкозернов, д.б.н. Г.В. Семисотнов, д.б.н. В.А.
Синещеков, к.ф.-м.н. Е.Л. Терпугов, д.ф.-м.н. В.Н. Уверский, к.б.н.
А.Я. Шкуропатов, академик. В.А. Шувалов.
Развитие и нормальная работа практикума требует постоянного
контроля за состоянием его приборной базы, модификации и модернизации оборудования, его профилактики и ремонта. Эти проблемы,
особенно трудные в последнее время, не могли быть решены без
участия специалиста самой высокой квалификации, энтузиаста своего дела и мастера с большой буквы Аниса Миркасимовича Гариева.
Необходимо отметить важный вклад в развитие практикума его
руководителей, безвременно ушедших от нас наших товарищей
к.б.н. Н.В. Игнатова, к.б.н. В.В. Судницына, В.Н. Архипова.
Владимир Никифорович Архипов был замечательным человеком
с большой эрудицией и природным даром преподавателя, целиком
посвятившим себя работе со студентами многих поколений. Он был
руководителем практикума по спектроскопии в течение многих лет
и в каждой задаче проявился его неоценимый вклад.

Теоретическое введение
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО
ИЗЛУЧЕНИЯ С МОЛЕКУЛАМИ, ДИПОЛЬНОЕ
ПРИБЛИЖЕНИЕ

Электромагнитное излучение - это электромагнитные волны,
распространяющиеся со скоростью c (в вакууме) (см. рис.1)

Рис.1 Плоскополяризованная электромагнитная волна.

E - электрическая, B - магнитная компоненты, соотношение амплитуд

c
E
B
0
0 . Вектор Пойнтинга S указывает направление распространения

волны. Его усредненная по времени величина равна интенсивности излуче
ния I .
2
0
0
2
1
E
c
I
S
, где c -скорость света,
0
-электрическая посто
янная,
0
E  - амплитуда напряженности электрического поля волны.

Классическая теория взаимодействия электромагнитных волн с
электрическими зарядами создана Максвеллом. В молекулах положительные заряды ядер компенсируются отрицательными зарядами
электронов и поэтому они электрически нейтральны. Однако внутренняя структура молекулы обычно
характеризуется неравномерным распределением электрических зарядов разного знака. В первом
приближении она может рассматриваться как электрический диполь
с дипольным моментом
r
q , где q – величина зарядов одного

знака, а r – расстояние между центрами зарядов разного знака. Направление вектора - от центров отрицательных к центру положительных зарядов. Действие магнитного поля зависит не только от
величины зарядов, но и от скорости их движения . Если для электрического поля сила
E
q
Fэл
-  где E - напряженность, то
B
q
Fмагн
, поскольку
c
E
B
/
, отношение магнитной силы к

электрической
c
F
F
эл
магн

/
. Скорость движения зарядов в молеку
ле примерно на два порядка меньше скорости света. Поэтому влиянием магнитной компоненты можно пренебречь и рассматривать
поглощение излучения как взаимодействие электрической компоненты волны с электрическим диполем – дипольное приближение. В
дипольном приближении размер диполя должен быть многим меньше длины волны излучения с тем, чтобы напряженность поля
не
сильно различалась для разных частей хромофора молекулы. В рамках дипольного приближения отчетливо проявляются принципы,
лежащие в основе спектроскопии молекул. Для более точного и детального рассмотрения переходят к приближениям более высоких
порядков, рассматривая молекулу как квадруполь, октуполь и т.д.
Энергия диполя в постоянном электрическом поле
E
u
(это

соответствует работе
E
r
q , где qE  - сила, а r - расстояние). Можно
показать, что перенос энергии переменного электрического поля
волны к диполю пропорционален квадрату скалярного произведения
2
E
или
2
2
0
2
cos
E
, где - угол между векторами и

E .
Можно раздельно рассматривать вклад в энергию диполя электронной ex  и ядерной составляющей. Доказательство здесь не
приводится, но можно сослаться на аналогию с выражением для
энергии осциллятора, которая пропорциональна квадрату отклоне
ния от равновесия

2

2
kx
V .

При дипольном приближении принимается, что размер молекулы
(или ее хромофорной группы, ответственной за поглощение) много
меньше длины волны излучения. В этом случае можно считать, что
напряженность поля волны приблизительно одинакова в пределах
хромофора.
Дипольное приближение наиболее простая модель, позволяющая
анализировать принципы спектрального анализа, производить достаточно точные расчеты. Для более точного описания необходимо
учитывать более сложную структуру распределения электрических

зарядов в молекуле и перейти к квадрупольному (4 центра зарядов
по углам квадрата) и последующим, более точным приближениям,
которые стали доступными, благодаря развитию современной техники спектроскопии и вычислительной техники.
Для обсуждения природы поглощения необходимо остановиться
на некоторых свойствах и параметрах электромагнитного излучения
общих для волн различного типа (в частности, волн Де-Бройля). Наглядным примером могут служить волны, распространяющиеся по
водной поверхности. В простейшем случае – «мгновенная фотография» профиля волны,  (зависимость отклонения от нулевого уровня
как функция пространственной координаты x ), описывается гармонической функцией sin или cos . С другой стороны, в каждой точке с
координатой x  величина отклонения от нулевого уровня также пе
риодически изменяется во времени с некоторой частотой
T
1
в

пределах от
0
E
до
0
E
или от +А до –А, где А – амплитуда колебаний.
Таким образом, , (или E ) является функцией пространствен
ной координаты x  и времени t .
kx
A
x
cos
, где
2
k
,

t
A
t
cos
.

Рис.2. Напряженность электрического поля волны как функция пространственной координаты x  и времени t . T -период колебаний, - длина волны

Рис.3 Соотношение угловой зависимости и пространственной функции

(отклонение от положения равновесия):
2
x
,
kx
x
sin
2
sin
sin
,

k
k , где k - волновой вектор; знак минус ( k
) указывает на то, что

волна распространяется в сторону возрастания координаты x (вправо).

Совмещая две зависимости, можно записать уравнение волны,
как функцию двух переменных x и t :

x
T
t
A
2
cos
, или
kx
t
A
cos
,

Для электрической компоненты электромагнитной волны
kx
t
E
E
cos
0

где период колебаний
1
T
, - частота,
2
- круговая час
тота, модуль вектора
2
k
. Волновой вектор k указывает на
правление распространения волны. (Знак минус перед k  соответствует распространению волны в сторону возрастания координаты
x (вправо), а положительный знак (-) в сторону уменьшения x ). A
или
0
E - амплитуда, а выражение в скобках – фаза волны (присутствие в скобке члена
t
отражает фундаментальное свойство волнового движения, показывая, что пространственно форма гармонической
волны
kx
cos
не изменяется: при движении, волна лишь перемещается в пространстве.

Скорость распространения волны – фазовую скорость можно определить по скорости перемещения координаты точки x, соответствующей какому-либо максимуму или точке нулевого отклонения
или любой точки xопределенной фазы, т.е. из условия постоянства
фазы: const
x
k
t
.

Дифференцируя по t , получаем: фазовая скорость
k
dt
x
d
,

т.к.
2
,
2
k
 , фазовая скорость
.

Рис.4 Фазовая скорость. Профиль волны в различные моменты времени,

отличающиеся на
4
1  периода; T - период колебаний, - длина волны,

c - фазовая скорость. За время T в точке второго максимума E  изменяется
от
0
E
до
0
E
и обратно, а первый максимум проходит путь
x
.

Для электромагнитной волны в вакууме фазовая скорость

c
, где c  - скорость света в вакууме. Отсюда получается со
отношение основных параметров световой волны
c
,
c
.

Важное значение в теории и практике эксперимента имеет частота в

обратных сантиметрах
1
1
см
c
. Часто шкала спектральных

приборов калибруется не в длинах волн, а в обратных сантиметрах,
единицах, пропорциональных энергии квантов (см. ниже).
Таким образом, можно перечислить характеристики (параметры)
электрической компоненты распространяющейся электромагнитной
волны:

Амплитуда напряженности
0
E , частота
сек
1
или
1
1
см
,

длина волны
0
,
,
A
нм
см
, фазовая скорость в вакууме
c
, k

волновой вектор, указывающий направление распространения волны

2
k
.

Амплитуда световой волны определяет плотность ее энергии и ее
интенсивность. Плотность энергии u пропорциональна квадрату

амплитуды напряженности
0
E ,
2
0
0
2
1
E
u
, где
0
- электрическая

константа. Интенсивность светового потока (энергия на единицу
площади за единицу времени)
uc
I , где c - скорость света также
пропорциональна квадрату амплитуды напряженности (см. рис.1). 
Для линейно поляризованного излучения указывается ориентация
плоскости поляризации.

Интерференция волн, биения и волновой пакет

Гармоническая волна по определению бесконечная во времени и
пространстве – наиболее простая, но вместе с тем идеализированная
модель. Поэтому целесообразно обратиться к более сложным, но и
более близким к действительности моделям: цуг волн (на ограниченном отрезке), интерференция близких по характеристикам волн – 
биения и волновой пакет.
Биения. Две волны
1
и
2
, распространяющиеся вдоль оси x ,
имеют одинаковые амплитуды A , но несколько
отличаются по
длине волны (
1k и
k
k
1
) и по частоте (
1
и
1
). В результате
их интерференции (сложения), получается сложная волна с периодически изменяющейся амплитудой. Используя формулу для суммы
косинусов,

2
cos
2
cos
2
cos
cos
,