Флуоресцентная IN SITU гибридизация в практике научных и клинических цитогенетических исследований (для студентов биологических и медицинских факультетов университетов)

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ IN SITU  
ГИБРИДИЗАЦИЯ В ПРАКТИКЕ  
НАУЧНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ  
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 

(для студентов биологических  
и медицинских факультетов университетов)

Учебно-методическое пособие

Санкт-Петербург 
Издательство РГПУ им. А. И. Герцена 
2021

РоССИйСкИй  ГоСУдАРСтвенный  
ПедАГоГИчеСкИй  УнИвеРСИтет  им.  А. И. ГеРценА

 
© А. Ф. Сайфитдинова, И. Л. Пуппо, составители, 2021
© Издательство РГПУ им. А. И. Герцена, 2021
© С. В. Лебединский, оформление обложки, 2021
ISBN  978-5-8064-2984-2

ББК 28.04я73
Ф 69

Ф 69     Флуоресцентная in situ гибридизация в практике научных 
и клинических цитогенетических исследований (для студентов 
биологических и медицинских факультетов университетов). — 
Санкт-Петербург : Изд-во РГПУ им. А. И. Герцена, 2021. — 60 с.
ISBN  978-5-8064-2984-2
Учебно-методическое пособие содержит описание методов физической локализации последовательностей ДНК на хромосомах на основе гибридизации нуклеиновых кислот in situ для решения фундаментальных и прикладных задач. Дается описание принципа метода FISH и история его создания. Представленная 
информация изложена в соответствии с требованиями государственного образовательного стандарта и основана на последних достижениях современной науки,  
а также на собственном опыте авторов в развитии и применении FISH. Пособие 
содержит подробные протоколы с описанием методических особенностей для 
практического применения в различных научных и клинических цитогенетических 
исследованиях, вопросы и задания для контроля освоения материала. 
Пособие предназначено для студентов биологических и медицинских факультетов университетов, а также медицинских и педагогических институтов, аспирантов и специалистов, использующих гибридизацию in situ в научных исследованиях и диагностике.
ББК 28.04я73

Р е ц е н з е н т ы: 
канд. биол. наук О. Г. Чиряева (Федеральное государственное бюджетное научное 
учреждение «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии  
и репродуктологии им. Д. О. Отта») 
канд. биол. наук А. М. Злотина (Федеральное государственное бюджетное 
учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени  
В. А. Алмазова» Министерства здравоохранения Российской Федерации)

С о с т а в и т е л и: 
канд. биол. наук А. Ф. Сайфитдинова 
канд. биол. наук И. Л. Пуппо

Печатается по решению кафедры анатомии и физиологии  
человека и животных РГПУ им. А. И. Герцена

Утверждено в качестве учебно-методического пособия на заседании  
учебно-методического совета ФГБУ НМИЦ им В. А. Алмазова

ОГЛАВЛЕНИЕ

Гл а в а  1 
ПРИНЦИП ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ IN SITU ГИБРИДИЗАЦИИ . . .  
5
Вопросы для самостоятельного контроля . . . . . . . . . . . . . . . .  20

Гл а в а  2 
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА FISH В ПРАКТИКЕ НАУЧНЫХ  
И КЛИНИЧЕСКИХ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ  21
2.1. Методики приготовления препаратов для in situ  
гибридизации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  22
2.1.1. Методика приготовления препаратов метафазных 
хромосом и интерфазных ядер из лимфоцитов 
периферической и пуповинной крови человека . . . . . . . .  22
2.1.2. Методика приготовления препаратов метафазных 
хромосом и интерфазных ядер из клеток  
культивированных фибробластов человека. . . . . . . . . . . .  24
2.2. Протоколы приготовления и мечения зондов . . . . . . . . . . . .  26
2.2.1. Протокол 1. Мечение ДНК-зондов методом никтрансляции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  26
2.2.2. Протокол 2. Оптимизация размеров меченых  
фрагментов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  27
2.2.3. Протокол 3. Олигомечение ДНК со случайными 
праймерами . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  28
2.2.4. Протокол 4. Мечение зондов методом ПЦР. . . . . . . . . .  29
2.2.5. Протокол 5. Очистка ПЦР продукта. . . . . . . . . . . . . . . .  30
2.2.6. Протокол 6. Получение меченых РНК зондов. . . . . . . .  31
2.2.7. Протокол 7. Оценка эффективности мечения зонда . . .  32
2.3. Метафазная и интерфазная in situ ДНК гибридизация . . . . .  33
2.4. Несколько туров in situ ДНК гибридизации на одном  
препарате . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  40
2.5. Интерпретация полученных результатов после FISH  
по протоколу ДНК гибридизации . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  40

2.6. Детекция РНК на цитологических препаратах с помощью  
FISH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  43
2.6.1. Детекция транскриптов на кусочках ткани или целых 
эмбрионах (whole mount FISH). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  43
2.6.2. Детекция транскриптов на криосрезах . . . . . . . . . . . . .  46
2.6.3. Детекция транскриптов в культуре клеток . . . . . . . . . .  47
2.6.4. Контрольные эксперименты при постановке РНК FISH  48
Вопросы для самостоятельного контроля . . . . . . . . . . . . . . . .  49
2.7. Приложения к главе 2  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  49

Гл а в а  3 
ПРАВИЛА ЗАПИСИ РЕЗУЛЬТАТА FISH ИССЛЕДОВАНИЯ . . . .  51
Задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  54
Ответы на задания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  56

Словарь терминов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  57

Список литературы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  59

Гл а в а  1 
 
ПРИНЦИП ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ  
IN SITU ГИБРИДИЗАЦИИ 

Разработанный Дж. Голлом и М.-Л. Пардью в 1969 г. на основе 
свойства нуклеиновых кислот комплементарно спариваться, метод 
гибридизации in situ позволяет точно определить локализацию практически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно 
в клетке или клеточном ядре, на метафазных хромосомах, растянутых 
хроматиновых фибриллах и микроматрицах благодаря использованию 
высокочувствительной флуоресцентной микроскопии. Особую востребованность методы гибридизации in situ приобрели в последнее 
время в связи с развитием персонализированной таргетной биомедицины. В последние 30 лет технология флуоресцентной in situ 
гибридизации (FISH) интенсивно развивалась и преобразовалась в 
целый комплекс методов, позволяющих получать информацию не 
только о физической локализации нуклеиновых кислот, но и об организации генома и кариотипа. Различают FISH на растянутых 
фибриллах, на метафазных хромосомах, на распластанных интерфазных ядрах и на фиксированных препаратах клеток, сохраняющих 
трехмерную организацию (3D-FISH). В зависимости от особенностей 
исследования и решаемых им задач выделяют следующие разновидности: одновременную многоцветную FISH с использованием различных зондов, многоцветную FISH с зондами к отдельным хромосомным сегментам (M-FISH), многоцветный бэндинг хромосом 
(MCB-FISH), хромосомный пэйнтинг (Zoo-FISH), межвидовое цветное сегментирование хромосом (Rx-FISH), спектральное кариотипирование (SKY), супрессорную FISH в присутствии избыточного 
количества конкурентной ДНК (CISS), сравнительную геномную 
гибридизацию (CGH). Несмотря на различия отдельных протоколов, 
все они включают этапы денатурации меченого зонда и нуклеиновых 
кислот на препарате с последующей их одновременной ренатура цией 
двойной спирали (рис. 1). 
В качестве зонда, в любой разновидности гибридизации in situ, 
используются фрагменты нуклеиновых кислот, в состав которых 
включены репортерные молекулы. Прямое мечение осуществляется 

включением предшественников нуклеиновых кислот, непосредственно конъюгированных с красителем. Обычно для этого используют 
органические флуорохромы на основе химически модифицированных 
родаминов или цианинов, т. к. они обладают хорошими спектральными характеристиками и стабильностью в водных растворах. Для одновременной многоцветной FISH зонды метят флуорохромами, спектры 
которых не перекрываются. В некоторых случаях, краситель вводят в 
состав зонда методами твердотельного химического синтеза, однако 
наиболее распространены методы биохимического синтеза на основе 
различных полимеразных реакций. Для непрямого мечения используются предшественники, несущие химические модификации, не препятствующие биохимическому синтезу нуклеиновых кислот, такие 
как биотин, дигоксигенин, динитрофенол, эстрадиол, а также этинил. 
Используют дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, связанные ковалентно с репортерной молекулой углеводородным линкером для облегчения включения такого предшественника в синтезируемый зонд. 
На препаратах такие репортерные молекулы (биотин, дигоксигенин, 
динитрофенол, эстрадиол) детектируют веществами, имеющими к ним 
высокое сродство, например различными вариантами авидина для 
детекции биотина или специфичными антителами. Для визуализации 
используют хромогенные или флуоресцентные красители. Этинилированные предшественники выявляют проведением на препарате так 
называемой клик-реакции, которая происходит при комнатной температуре в водной среде в присутствии медного катализатора между 
этинилом в составе зонда и азидной группой, функционализирующей 
краситель. 
Состав и размеры зондов варьируют в зависимости от целей эксперимента и особенностей метода. Последовательность, комплементар
Рис. 1. Схема гибридизации нуклеиновых кислот in situ с использованием 
меченого зонда (репортерная молекула обозначена звездочкой)