Физиолого-микробиологические методы исследования (Модуль 4)

Физиолого
микробиологические 
методы исследования

Модуль 4

Учебное пособие

Москва

ИНФРА-М

2021

УДК 579
ББК 28.4

Ф50

Учебно-методический совет по биологии Федерального УМО «Биологические 

науки» считает целесообразным издать электронное учебное пособие коллектива 

авторов под ред. Ф.Ф. Литвина «Физиолого-микробиологические методы исследования.
Модуль 4» и рекомендует использовать в учебном процессе в качестве учебного пособия 
для обучающихся образовательных организаций высшего образования по направлениям 
подготовки 06.03.01 и 06.04.01 «Биология», 06.06.01 «Биологические науки» и смежным 
направлениям и специальностям, а также программам дополнительного образования

А в т о р ы: 
А.А. Катаев, А.А. Кособрюхов, В.Б. Бородин, И.Ф. Пунтус, Т.И. Балахнина

Р е ц е н з е н т ы:
В.Д. Креславский, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник 

группы экологии и физиологии фототрофных организмов Института фундаментальных 
проблем биологии Пущинского научного центра биологических исследований Российской 
академии наук;

А.Н. Решетилов, доктор химических наук, профессор, ведущий научный 

сотрудник, заведующий лабораторией биосенсоров Института биохимии и физиологии 
микроорганизмов имени Г.К. Скрябина Пущинского научного центра биологических 
исследований Российской академии наук

Ф50 Физиолого-микробиологические методы исследования. Модуль 4 : 

учебное пособие / А.А. Катаев, А.А. Кособрюхов, В.Б. Бородин [и др.] ; 
под ред. Ф.Ф. Литвина. — Москва : ИНФРА-М, 2021. — 120 с.

ISBN 978-5-16-109854-7 (online)

Учебное пособие связывает
ряд методов, используемых в современных 

биологических исследованиях. Представлены теоретические основы и детальное 
применение на практике некоторых методов физиологического и микробиологического 
направлений. Рассматриваются исследования, в которых применяются микроэлектродные 
техники, метод полярографии, способы оценки стресса растений и некоторые 
микробиологические 
приемы, 
часто 
встречающиеся 
в 
лабораторной 
практике. 

Объединение такого типа методов в одной книге поможет восполнить у студентов 
недостаток навыков лабораторных работ в этих областях и позволит приобрести 
компетенции в сфере современных биологических исследований.

Для биологов, химиков, студентов, аспирантов и слушателей программ 

дополнительного образования.

УДК 579
ББК 28.4

ISBN 978-5-16-109854-7 (online)
© Коллектив авторов, 2021

ФЗ № 
436-ФЗ

Издание не подлежит маркировке 
в соответствии с п. 1 ч. 2 ст. 1

Оглавление 
1. 
МИКРОЭЛЕКТРОДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В 

КЛЕТКЕ.............................................................................................................................................6 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА ................................................................................6 

Ионные каналы ...........................................................................................................................6 

Типы ионных каналов ................................................................................................................7 

Структура ионных каналов........................................................................................................8 

Проводимость и проницаемость .............................................................................................11 

Внутриклеточная микроэлектродная регистрация................................................................11 

Генерация потенциалов нервными клетками.........................................................................12 

Значение ионных каналов........................................................................................................13 

Плазмалемма гигантских клеток харовых водорослей как модель электровозбудимой 
мембраны...................................................................................................................................14 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ..........................................................................................................19 

Регистрация переходных токов плазмалеммы методом фиксации напряжения на 
мембране....................................................................................................................................19 

Упражнение 1. Измерение потенциала покоя и потенциала действия на междоузлиях 
харовых водорослей Chara corallina ......................................................................................24 

Упражнение 2. Дополнительные измерения..........................................................................25 

ЛИТЕРАТУРА..............................................................................................................................26 

2. 
ИНФРАКРАСНЫЙ АНАЛИЗ 𝑪𝑶𝟐 ГАЗООБМЕНА РАСТЕНИЙ ...............................27 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА..................................................................................27 

Анализ газов в инфракрасном диапазоне спектра.................................................................27 

Методы измерения СО2 в камерах..........................................................................................29 

Устройство прибора .................................................................................................................31 

Анализ измерений газообмена ................................................................................................37 

Ответная реакция скорости фотосинтеза на внутреннюю концентрацию СО2..................38 

Ответная реакция на свет.........................................................................................................39 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ..........................................................................................................41 

Упражнение 1. Ознакомление с устройством и работой инфракрасного газоанализатора 
(ИКГ)..........................................................................................................................................41 

Упражнение 2. Измерение скорости газообмена листьев травянистых и древесных 
растений.....................................................................................................................................42 

Упражнение 3. Анализ световых и углекислотных кривых СО2 газообмена .....................42 

ЛИТЕРАТУРА ..........................................................................................................................46 

3. 
ПОЛЯРОГРАФИЯ. (Определение скорости обмена кислорода при дыхании и 

фотосинтезе)....................................................................................................................................47 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА..................................................................................47 

Полярография............................................................................................................................49 

O2-амперометрия.......................................................................................................................54 

O2-электроды Кларка................................................................................................................56 

Время ответа O2-электродов Кларка.......................................................................................63 

Подготовка O2-электродов Кларка к работе ..........................................................................64 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ..........................................................................................................69 

Упражнение 1. Определение зависимости газообмена O2 у оксигенных фотосинтетиков 
от силы света при низком и высоком содержании СO2 в среде...........................................69 

Общие замечания......................................................................................................................71 

ЛИТЕРАТУРА..............................................................................................................................74 

4. 
ИССЛЕДОВАНИЕ ЧИСЛЕННОСТИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ...............75 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА..................................................................................75 

Молочнокислые бактерии........................................................................................................75 

Различия лактобактерий по типу брожения...........................................................................76 

Фунгицидные вещества молочнокислых бактерий...............................................................81 

Бактериоцины молочнокислых бактерий...............................................................................82 

Промышленное значение.........................................................................................................83 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ..........................................................................................................89 

Упражнение  1. Исследование численности жизнеспособных клеток молочнокислых 
бактерий в пищевых продуктах ..............................................................................................89 

Упражнение 2.  Определение численности жизнеспособных клеток микроорганизмов 
методом стандартных серийных разведений.........................................................................93 

ЛИТЕРАТУРА:.............................................................................................................................95 

5. 
ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ..................................96 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА..................................................................................96 

ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС У РАСТЕНИЙ ......................................................................96 

Реакции окислительного повреждения липидов ...................................................................99 

Малоновый диальдегид как интегральный показатель процессов свободнорадикального 
окисления.................................................................................................................................100 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ........................................................................................................101 

Упражнение 1. Исследование интенсивности процессов окислительной деструкции в 
корнях и листьях растений по содержанию продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой 
кислотой (ТБКРп) ...................................................................................................................101 

ЛИТЕРАТУРА............................................................................................................................104 

6. 
МИКРОИНЪЕКЦИЯ (Введение генетического материала в клетку).......................105 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА................................................................................105 

Проведение микроинъекций веществ в клетку....................................................................109 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ........................................................................................................113 

Упражнение 1. Изготовление микропипетки и микродержателя клетки..........................113 

Упражнение 2 Калибровка микроинъектора .......................................................................114 

Упражнение 3. Изготовление микрокамер для микроинъекций........................................114 

Упражнение 4. Микроинъекция в клетку растворов...........................................................115 

Упражнение 5. Определение идентичности инъецируемого раствора (на примере 
раствора альбумина)...............................................................................................................115 

Упражнение 6. Проведение микроинъекции в ооциты земноводных (или рыб) .............115 

ПРИЛОЖЕНИЕ ......................................................................................................................117 

ЛИТЕРАТУРА............................................................................................................................120 

1. МИКРОЭЛЕКТРОДНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭЛЕКТРИЧЕСКИХ 

ПРОЦЕССОВ В КЛЕТКЕ

Автор к.б.н. А.А. Катаев, ИБК РАН 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА 

Ионный транспорт через мембраны является фундаментальным процессом, 

определяющим жизнедеятельность клеток.

Установлена важная роль ионного транспорта через мембраны в самых различных 

клеточных процессах: в генерации и проведении возбуждения, в секреции, сокращении, 
клеточном цикле и дифференцировке, в иммунных реакциях, нервно-мышечной передаче и в 
других процессах.

Одно из необходимых условий нормального функционирования клетки –
это 

постоянство физико-химических факторов ее внутренней среды. Основную роль в 
поддержании такого постоянства играет внешняя плазматическая мембрана клетки. Она 
регулирует потоки различных веществ как в клетку, так и в ее наружную среду. Вещества 
проникают в клетку не через всю поверхность мембраны, а только через определенные 
места, которые занимают всего лишь около 01% всей площади плазматической мембраны. 
Остальная часть мембраны непроницаема для водорастворимых веществ и создает преграду 
для перемешивания внутриклеточной и внешней среды. В результате происходит 
неравномерное распределение различных веществ между клеткой и средой. В случае 
заряженных частиц – ионов – такое неравномерное распределение приводит к появлению 
разности потенциалов между внутренней и наружной сторонами мембраны клетки. Ряд 
клеток «научились» управлять своим потенциалом. Преобразовывать постоянную разность 
потенциалов в переменный электрический сигнал. Нервные клетки таким путем передают 
сигналы ко всем остальным клеткам организма, координируя тем самым их работу. 
Мышечные клетки, изменяя трансмембранный потенциал, регулируют сокращения мышц.

Исследование электрических процессов, происходящих на клеточной мембране помогает 

понять, как устроена мембрана, как связаны мембранные процессы с различными сторонами 
жизнедеятельности клетки.

Ионные каналы 

Электрические сигналы, обеспечивающие функционирование клеток, опосредованы 

потоком ионов через водопроницаемые поры клеточной мембраны. Эти поры, образованные 
трансмембранными белками, называются ионными каналами. К настоящему времени 
разработаны высокочувствительные методы, позволяющие зарегистрировать и измерить 
ионные токи, протекающие через ионные каналы.

Ионные каналы – это порообразующие белки (одиночные либо целые комплексы), 

поддерживающие разность потенциалов, которая существует между внешней и внутренней 
сторонами клеточной мембраны всех живых клеток. Относятся к транспортным белкам. С их 
помощью ионы перемещаются согласно их электрохимическим градиентам сквозь мембрану. 
Такие комплексы представляют собой набор идентичных или гомологичных белков, плотно 

упакованных в липидном бислое мембраны вокруг водной поры. Каналы расположены в 
плазмалемме и некоторых внутренних мембранах клетки. 

Через ионные каналы проходят ионы Na+ (натрия), K+ (калия), Cl− (хлора) и Ca++

(кальция). Из-за открывания и закрывания ионных каналов меняется концентрация ионов по 
разные стороны мембраны и происходит сдвиг мембранного потенциала.

Канальные белки состоят из субъединиц, образующих структуру со сложной 

пространственной конфигурацией, в которой кроме поры обычно имеются молекулярные 
системы открытия, закрытия, избирательности, инактивации, рецепции и регуляции. Ионные 
каналы могут иметь несколько участков (сайтов) для связывания с управляющими 
веществами.

Типы ионных каналов 

Классификация ионных каналов проводится по различным параметрам, и поэтому 

единой унифицированной классификации для них пока не существует. 

Ионные каналы можно классифицировать по селективности
в зависимости от 

проходящих через них ионов: натриевые, калиевые, кальциевые, хлорные, протонные 
(водородные).

Согласно функциональной классификации ионные каналы группируются по способам 

управления их состоянием на следующие виды:

1. Неуправляемые (независимые).

2. Потенциал-управляемые (потенциал-чувствительные, потенциал-зависимые, voltage
gated).

3. Лиганд-управляемые 
(хемо-управляемые, 
хемочувствительные, 
хемозависимые, 

лиганд-зависимые, рецептор-активируемые).

4. Опосредованно-управляемые 
(вторично-управляемые, 
ион-активируемые, 
ион
зависимые, мессенджер-управляемые, управляемые метаботропными рецепторами).

5. Совместно-управляемые (NMDA-рецепторно-канальный комплекс). Они открываются 

одновременно как лигандами, так и определённым электрическим потенциалом 
мембраны. Можно сказать, что у них двойное управление. Пример: NMDA –
рецепторно-канальный 
комплекс, 
имеющий 
сложную 
систему 
управления, 

включающую в себя 8 рецепторных участков-сайтов, с которыми могут связываться 
различные лиганды.

6. Стимул-управляемые (механочувствительные, механосенситивные, активируемые 

растяжением (stretch) липидного бислоя, протон-активируемые, температурночувствительные).

7. Актин-управляемые (актин-регулируемые, actin-regulated, actin-gated channels).

Управляемая проницаемость — это способность открываться или закрываться при 

определённых управляющих воздействиях на канал.

Инактивация — это способность ионного канала через некоторое время после своего 

открытия автоматически понижать свою проницаемость даже в том случае, когда открывший 
их активирующий фактор продолжает действовать.

Блокировка — это способность ионного канала под действием веществ-блокаторов 

фиксировать какое-то одно своё состояние и не реагировать на обычные управляющие 

воздействия. Блокировку вызывают вещества-блокаторы, которые могут называться 
антагонистами, блокаторами или литиками.

Пластичность — это способность ионного канала изменять свои свойства, свои 

характеристики. Наиболее распространённый механизм, обеспечивающий пластичность, —
это фосфорилирование аминокислот канальных белков с внутренней стороны мембраны 
ферментами – протеинкиназами.

Некоторые ионные каналы избирательно проницаемы только для катионов, тогда как 

другие проводят только анионы. Катионные каналы могут быть высоко избирательными по 
отношению к одному иону, например, натрию. Ионные каналы совершают переходы между 
открытым и закрытым состоянием и имеют, как правило, характерное время открытого 
состояния. Их вклад в ионный ток через клеточную мембрану определяется относительным 
количеством времени, которое они находятся в открытом состоянии. 

Открытие канала регулируется различными механизмами. Некоторые из этих 

механизмов физические, такие как растяжение мембраны или изменения мембранного 
потенциала. Другие механизмы – химические, включающие связывание активных молекул 
(лигандов) с активным центром, который располагается либо с внеклеточной, либо с 
внутриклеточной стороны канала. 

Важным свойством каналов, в дополнение к кинетике открытия и закрытия, является 

способность открытого канала проводить ионный ток. Один из способов, которым ионы 
могут проникать через открытый канал, является простая диффузия. Другой способ —
взаимодействие ионов с внутриканальными центрами связывания и перескакивание внутри 
водной поры от одного центра к другому. В любом случае движение иона через канал 
является пассивным и определяется градиентом концентрации и градиентом электрического 
потенциала на мембране. 

Количество тока, проходящего через открытый канал по электрическому градиенту, 

зависит от проницаемости канала для данного типа ионов. Величина тока также зависит от 
концентрации ионов в устьях канала. Эти два фактора: проницаемость и концентрация, –
определяют проводимость канала.

Структура ионных каналов 

Как же выглядит молекула ионного канала, и как она функционирует? В последние годы 

осуществлен значительный прогресс в понимании структуры ионных каналов. В получении 
этой информации были использованы два экспериментальных достижения. Во-первых, были 
изолированы клоны ДНК, кодирующие структуру ионных каналов, что позволило получить 
информацию об аминокислотной последовательности этих белков. Техника, используемая 
при этом, давала также возможность менять основания в молекуле ДНК (сайт-направленный 
мутагенез) и заменять таким образом в выбранном участке белка одну аминокислоту другой.

Вторым достижением была разработка техники, посредством которой клоны ДНК были 

использованы для экспрессии ионных каналов в чужеродных клетках, таких как ооциты 
Xenopus. Этот прием позволил оценить функциональные свойства клонированных ионных 
каналов электрофизиологическими методами. Комбинация двух методов позволяла 
манипулировать специфическими участками молекулы ионного канала, чтобы определить 
значение этих участков для его функционирования. Применение этих методов позволило 

выяснить, что в ряде случаев замена даже одной аминокислоты меняет ионную 
избирательность канала.

Трансмембранный ионный канал имеет центральную водную пору, сообщающуюся как с 

внеклеточным, так и с внутриклеточным пространством. С обеих сторон канала пора 
расширяется, образуя устья. Узкая внутримембранная часть ионного канала формирует 
ворота, которые могут открываться и закрываться, регулируя прохождение ионов. Размер 
белка ионного канала варьирует в значительной степени в зависимости от типа канала. 
Некоторые ионные каналы имеют дополнительные структуры и связанные с ними новые 
свойства. На Рис. 1. представлен калиевый канал.

А
Б
В

Рис 1. Реконструкция К+-канала. А – молекулярная структура, Б – продольный разрез канала, С –

показаны 4 субъединицы строения канала.

Свойства ионных каналов. Клеточная мембрана клетки.

Клеточные мембраны состоят из жидкой фазы липидов и встроенных в липиды белковых 

молекул. Как показано на Рис. 2, молекулы липидов организованы в двухслойную мембрану 
(бислой) толщиной около 6 нм. Полярные гидрофильные головки липидов обращены к 
поверхностям мембраны, а гидрофобные хвосты вытянуты к середине бислоя. Липиды плохо 
пропускают воду и практически непроницаемы для ионов. Белковые молекулы частично 
погружены в слой липидов либо с внеклеточной, либо с цитоплазматической стороны. 
Некоторые белки целиком пронизывают мембрану. Именно пронизывающие мембрану 
(трансмембранные) белки образуют ионные каналы. Основные ионы, участвующие в 
генерации электрических сигналов, такие как: калий, натрий, кальций или хлор, – движутся 
через ионные каналы пассивно благодаря градиенту концентраций и электрическому 
потенциалу мембраны. 

Другие трансмембранные белки служат в качестве насосов и переносчиков, 

обеспечивающих транспорт веществ через клеточную мембрану против электрохимических 
градиентов. Транспортные механизмы поддерживают ионный состав цитоплазмы, удаляя 
или возвращая те ионы, которые прошли клеточную мембрану по их электрохимическим 
градиентам. Они также выполняют важную функцию переноса через клеточные мембраны 
субстратов метаболических реакций, таких как глюкоза и аминокислоты.

Для ионных каналов функционально важными являются переходы между открытым и 

закрытым состояниями. Эти переходы совершаются практически моментально. С другой 
стороны, при системном изучении поведения любого ионного канала мы обнаружим, что 
время открытого состояния варьирует случайным образом. Иногда канал открыт только одну 

миллисекунду или даже меньше, хотя в следующий раз он может быть открыт на гораздо 
более продолжительное время. Тем не менее, каждый канал имеет характерное среднее 
время открытого состояния, и все вариации происходят вокруг этого среднего показателя.

Рис. 2. Фрагмент клеточной мембраны.

Некоторые ионные каналы открываются достаточно часто даже в покое. Иными словами, 

вероятность нахождения таких каналов в открытом состоянии в неактивированной клетке 
относительно высока. Большинство таких ионных каналов проницаемо для калия или хлора. 
Они важны для генерации мембранного потенциала покоя. Остальные ионные каналы при 
этом закрыты, то есть вероятность нахождения их в открытом состоянии очень низка. 
Активация этих каналов адекватным стимулом резко увеличивает вероятность открытия. 
Этот же стимул может деактивировать ионные каналы, бывшие активными в покое. Важно 
помнить, что активация или деактивация канала означает возрастание или снижение 
вероятности открытия канала, но не увеличение или уменьшение времени открытого 
состояния (т) канала. Помимо активации и деактивации, ионный ток через каналы 
регулируется двумя другими факторами. Первый фактор заключается в том, что ионный 
канал переходит в новое конформационное состояние, в котором обычный активирующий 
стимул не способен вызвать открытие канала. Для ионных каналов, активируемых 
деполяризацией, такое состояние называется инактивацией. Для каналов, отвечающих на 
химические стимулы, это состояние известно, как десенситизация. Второй механизм — блок 
открытого канала. Такое случается, когда, например, крупная молекула (такая как токсин) 
связывается с ионным каналом и физически закупоривает пору. Другим примером может 
служить блокирование некоторых катионных каналов ионами магния. В этом случае ионы 
магния сами не проникают через ионный канал, но связываются с каналом в области его 
устья и тем самым мешают проникновению других катионов.