Спектральные методы исследования биологических макромолекул (Модуль 3)

Спектральные методы 

исследования 
биологических 
макромолекул

Модуль 3

Учебное пособие

Москва

ИНФРА-М

2021

УДК 577.2
ББК 28.070

С71

Учебно-методический совет по биологии Федерального УМО «Биологические 

науки» считает целесообразным издать электронное учебное пособие коллектива 

авторов под ред. Ф.Ф. Литвина «Спектральные методы исследования биологических 

объектов. Модуль 3» и рекомендует использовать в учебном процессе в качестве учебного 

пособия для обучающихся образовательных организаций высшего образования 

по направлениям подготовки 06.03.01 и 06.04.01 «Биология», 06.06.01 «Биологические 

науки» и смежным направлениям и специальностям, а также программам 

дополнительного образования

А в т о р ы: 
Л.Я. 
Сатина, 
Р.А. 
Хатыпов, 
Л.А 
Коппель, 
В.П. 
Кутышенко, 

М.А. Тимченко, И.И. Проскуряков, И.Б. Кленина

Р е ц е н з е н т ы:
В.И. Брусков, доктор химических наук, профессор, главный научный 

сотрудник 
Института
теоретической 
и 
экспериментальной 
биофизики 

Российской академии наук;

Л.Г. Васильева, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник

Института фундаментальных проблем биологии Российской академии наук

С71
Спектральные методы исследования биологических макромолекул. 
Модуль 3 : учебное пособие / Л.Я. Сатина, Р.А. Хатыпов, Л.А 
Коппель [и др.] ; под ред. Ф.Ф. Литвина. — Москва : ИНФРА-М, 
2021. — 114 с.

ISBN 978-5-16-109853-0 (online)

Учебное пособие связывает ряд спектральных методов, используемых в 

современных 
биологических 
исследованиях. 
Представлены 
теоретические 

основы методов, подробно показано применение их на практике. Полученные 
навыки спектральных исследований позволяют их применять в современных 
методиках, использующихся в биохимии, молекулярной биологии, физической 
химии и других смежных областях. Учебное пособие предназначено для 
широкого круга биологов, химиков, студентов, аспирантов и слушателей 
программ дополнительного образования.

УДК 577.2
ББК 28.070

ISBN 978-5-16-109853-0 (online)
© Коллектив авторов, 2021

ФЗ № 
436-ФЗ

Издание не подлежит маркировке 
в соответствии с п. 1 ч. 2 ст. 1

Оглавление 
1. 
ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПОГЛОЩЕНИЯ СВЕТА ................................................................................................. 6 

СВЕТ. Природа света ................................................................................................................................................ 6 

Измерение излучения .............................................................................................................................................. 7 

Электронная структура молекул и энергетические уровни .................................................................................. 8 

Взаимодействие света с веществом ..................................................................................................................... 10 

Спектр поглощения света ...................................................................................................................................... 11 

Связь структуры молекулы и её способности к поглощению света ................................................................... 12 

Законы поглощения света ..................................................................................................................................... 13 

2. 
ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕКТРОВ ПОГЛОЩЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ В УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ 

ОБЛАСТИ .......................................................................................................................................................................... 18 

Теоретические основы поглощения света необходимо прочесть на стр. 6 данного учебного пособия ........ 18 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ................................................................................................................................................ 18 

Устройство спектрофотометра СФ-26 ................................................................................................................... 18 

Работа на приборе ................................................................................................................................................. 20 

Упражнение 1. Измерение спектров поглощения аминокислот в свободном состоянии .............................. 21 

Упражнение 2. Спектры поглощения нуклеиновых кислот ................................................................................ 24 

Упражнение 3. Спектрофотометрическое изучение реакций окисления-восстановления с участием 
пиридиннуклеотидов ............................................................................................................................................. 27 

Упражнение 4. Энзиматический метод количественного определения восстановленных 
пиридиннуклеотидов ............................................................................................................................................. 27 

Упражнение 5. Количественное спектрофотометрическое определение SH-групп в белках. 
Спектрофотометрическое титрование п-меркурибеноатом .............................................................................. 28 

ЛИТЕРАТУРА ................................................................................................................................................................ 29 

3. 
АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ 30 

Теоретические основы поглощения света необходимо прочесть на стр. 6 данного учебного пособия ........ 30 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ................................................................................................................................................ 30 

Спектрофотометры ................................................................................................................................................ 30 

Ход работы .............................................................................................................................................................. 31 

Упражнение 1. Измерение спектров контрольного объекта ............................................................................. 32 

Упражнение 2. Спектры поглощения и идентификация растительных пигментов .......................................... 33 

Упражнение 3. Определение концентрации хлорофиллов а и в в растительных образцах ........................... 34 

Упражнение 4. Зависимость поглощения от концентрации вещества. ............................................................. 35 

ПРИЛОЖЕНИЯ ......................................................................................................................................................... 39 

ЛИТЕРАТУРА ................................................................................................................................................................ 41 

4. 
ФОТОКОЛОРИМЕТРИЯ. КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ ЗАГРЯЗНЕНИЙ В ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ ......... 42 

Теоретические основы поглощения света необходимо прочесть на стр. 6 данного учебного пособия ........ 42 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА .......................................................................................................................... 42 

Колориметрические методы измерения концентрации веществ ..................................................................... 42 

Круговорот азота в биосфере ................................................................................................................................ 43 

Влияние деятельности человека на круговорот азота ........................................................................................ 44 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ................................................................................................................................................ 48 

Упражнение 1. Измерения концентрации нитратных и аммонийных форм азота. Определение аммония 48 

Упражнение 2. Определение нитритных ионов .................................................................................................. 49 

ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................................................................................ 50 

5. 
ЛЮМИНЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ. ИССЛЕДОВАНИЕ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ      

ОБЪЕКТОВ ....................... ……………………………………………………………………………………………………………………………………………52 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА .......................................................................................................................... 52 

Основы метода флуоресцентной спектроскопии ................................................................................................ 52 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ................................................................................................................................................ 56 

УСТАНОВКА И ПРИНЦИП ЕЕ ДЕЙСТВИЯ ................................................................................................................ 56 

Упражнение 1. Измерение спектров флуоресценции и идентификация пигментов. Качественный анализ их 
состояния ................................................................................................................................................................ 59 

Упражнение 2. Определение концентрации вещества по флуоресценции ..................................................... 61 

Упражнение 3. Исследование индукционных эффектов флуоресценции у фотосинтезирующих    
организмов ............................................................................................................................................................. 62 

Упражнение 4. Измерение спектров флуоресценции рибофлавина ................................................................. 62 

Упражнение 5. Анализ нуклеиновых кислот по флуоресценции с акридиновым оранжевым ....................... 63 

Упражнение 6. Флуоресцентные зонды как индикатор заряда ......................................................................... 64 

ПРИЛОЖЕНИЯ ............................................................................................................................................................. 65 

ЛИТЕРАТУРА ................................................................................................................................................................ 66 

6. 
СПЕКТРОСКОПИЯ ЭЛЕКТРОННОГО ПАРАМАГНИТНОГО РЕЗОНАНСА ............................................................... 67 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА .......................................................................................................................... 67 

Молекулярный парамагнетизм. Физические основы ......................................................................................... 67 

Техника ЭПР ............................................................................................................................................................ 69 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ................................................................................................................................................ 75 

Выполнение экспериментальной задачи............................................................................................................. 75 

Оформление результатов ...................................................................................................................................... 77 

ЛИТЕРАТУРА ................................................................................................................................................................ 78 

7. 
ЯМР-СПЕКТРОСКОПИЯ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ .............................................................................................. 79 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА .......................................................................................................................... 79 

ЯМР-спектроскопия высокого разрешения ......................................................................................................... 79 

Глава 1 ..................................................................................................................................................................... 80 

Основы ядерного магнитного резонанса ............................................................................................................. 80 

Классическое описание условий магнитного резонанса .................................................................................... 80 

Квантовомеханическое описание ядерного магнитного резонанса ................................................................. 84 

Заселенность спиновых состояний ....................................................................................................................... 85 

Спин-решеточная релаксация ............................................................................................................................... 88 

Основной фактор спин-решеточной релаксации ................................................................................................ 89 

Глава 2 ..................................................................................................................................................................... 89 

Уравнения Блоха .................................................................................................................................................... 90 

Вращающаяся система координат ........................................................................................................................ 90 

Спектральный анализ и преобразование Фурье ................................................................................................. 91 

Импульс ................................................................................................................................................................... 92 

Векторы и уровни энергии .................................................................................................................................... 94 

Реальные спектры ЯМР высокого разрешения. .................................................................................................. 95 

Система команд, применяемая в простых ЯМР-экспериментах ....................................................................... 98 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ .............................................................................................................................................. 110 

Устройство ЯМР-спектрометра Bruker 600 AVANCE III (Bruker BioSpin, Райнштеттен, Германия) ................. 110 

Выполнение экспериментальной задачи. Определение структуры неизвестного органического соединения 
методом одномерной спектроскопии ЯМР 1H. ................................................................................................. 112 

ЛИТЕРАТУРА .............................................................................................................................................................. 114 

 

1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПОГЛОЩЕНИЯ СВЕТА

Авторы: к.б.н. Л.А. Коппель, Л.Я. Сатина, кафедра биохимии Биологического

факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Изучение веществ по их спектрам поглощения считают в настоящее время одним из 

наиболее распространенных методов исследования. Применение этого метода в биологии в 
значительной степени облегчает наблюдение за ходом превращений химических соединений 
непосредственно в клетках и тканях, не нарушая их целостности.

Спектрофотометрия находит широкое применение в современной биологии и медицине 

для качественного и количественного анализа биологических объектов. Этот физикохимический метод основан на способности вещества поглощать свет в ультрафиолетовом 
(200-400 нм), видимом (400-760 нм) и инфракрасном (>760 нм) диапазонах.

Световой поток, распространяющийся в какой-либо среде, может отражаться, 

рассеиваться, преломляться при переходе из одной среды в другую, поглощаться веществом, 
лио проходить без изменений сквозь среду. Поглощение света биологическими молекулами 
приводит к разнообразным физиологически значимым процессам, таким, как фотосинтез, 
фотопериодизм, зрительное восприятие, фотоповреждение Состав и степень поглощения 
действующего света зависят от химической структуры и окружения молекул, поэтому 
характеристики спектров поглощения позволяют судить о строении светопоглощающих 
частей молекул (хромофоров), качественно и количественно идентифицировать вещества, 
исследовать биохимические и физиологические процессы, определять физико-химические 
свойства среды, окружающей молекулы. 

Широкое распространение спектральные методы в биологии получили из-за неоспоримых 

преимуществ: высокая чувствительность, точность и быстродействие, возможность нативного 
исследования биологических объектов без их повреждения, дистанционное изучение 
объектов. Современные приборы позволяют не только характеризовать состав вещества, но и 
наблюдать за ходом превращений химических соединений непосредственно в клетках, тканях 
in vivo, изучать действие строго дозированного света, проводить исследования в полевых 
условиях – непосредственно в месте обитания организма. Абсорбционная спектроскопия –
один из наиболее распространенных методов исследований в биологии.

СВЕТ. Природа света 

В конце XVII века возникли два различных взгляда на физическую природу и процесс 

распространения света. Исаак Ньютон высказал гипотезу, что светящиеся тела испускают 
мельчайшие световые частицы – «корпускулы», летящие с очень большой скоростью, а цвет 
луча зависит от величины корпускул. Одновременно голландский ученый Гюйгенс предложил 
«волновую теорию» света, по которой светящиеся тела вызывают упругие колебания в эфире, 
заполняющем мировое пространство. По этой теории всякая светящаяся точка является 
центром, от которого распространяются во все стороны световые волны.

К середине XIX века – после обнаружения тесной связи межу оптическими и 

электромагнитными явлениями – стало ясно, что свет представляет собой электромагнитную 
волну, в которой колебания электрического и магнитных полей перпендикулярны друг другу 

и к направлению распространения волны. В 1865 году Максвелл доказал, что 
электромагнитные волны распространяются в пространстве с предельной и постоянной 
скоростью – 299 792 458 м/сек. 

Наряду с волновыми свойствами электромагнитного излучения были открыты его 

корпускулярные свойства: в 1900 году Макс Планк выдвинул гипотезу о квантах излучения, а 
в 1905 году Эйнштейн показал, что свет не только испускается, но и распространяется в 
пространстве и поглощается веществом отдельными порциями – квантами, или фотонами. 

Развитие спектроскопии на основе представления о квантовой природе света связано с 

работами Нильса Бора – в 1913 году он сформулировал два основных квантовых постулата о 
существовании стационарных состояний атомных систем и о переходах с излучением между 
ними.

Электромагнитное излучение обладает широким диапазоном частот (или длин волн в 

вакууме 
v
c


) – от 10-14 м до 106 м – и может распространяться в форме гамма- и 

рентгеновских лучей, ультрафиолетового, видимого, инфракрасного излучения, СВЧ волн и 
радиоволн. Соответственно, современные приборы могут регистрировать фотоны с энергиями 
от одной миллионной электронвольта (радиоволны) до 300 млрд электронвольт (верхний 
предел чувствительности обзорного гамма-телескопа на борту космической обсерватории 
Fermi). 

Собственно, видимый свет лежит в узком диапазоне 380-740 нм, свободно проходит через 

атмосферу Земли и соответствует спектральной чувствительности человеческого глаза при 
дневном освещении. Этот диапазон практически совпадает с границами фотосинтетически 
активной радиации (ФАР) - солнечной радиации в пределах 400-700 нм, доходящей до 
биоценозов и используемой растениями для фотосинтеза. 

ФАР имеет исключительное значение для жизни растений, её энергия составляет около 

40% энергии всей солнечной радиации, достигающей поверхности Земли. Интегральная ФАР 
– количество фотосинтетически активной радиации, которую растение получает в течение 
дня. Фотосинтетический фотонный поток (photosynthetic photon flux density, PPFD) –
суммарное число фотонов, излучаемых в секунду в диапазоне длин волн от 400 до 700 нм 
(мкмоль/с).   

Измерение излучения 

Корпускулярно-волновой дуализм свойств света: такие явления, как интерференция, 

дифракция и поляризация света, подтверждают волновую природу света. С другой стороны, 
явления фотоэффекта и давления света, излучение черного тела служат доказательством 
квантовых, или корпускулярных представлений о свете.  

Двойственная природа света позволяет описывать его как волну и как частицу (фотон). В 

зависимости от длины волны свет проявляет больше либо свойства волны, либо свойства 
частицы. Как любую волну, электромагнитную волну можно описать по ряду параметров:

– начальная фаза и амплитуда А
– длина волны (расстояние, которое она проходит за один период) - λ, нм 
– частота (число колебаний в единицу времени) ν, 1 с-1 = 1 Гц
– период (время, за которое совершается одно колебание) - Т.

Квант света как частица характеризуется энергией Е и импульсом p. Двойственная 

природа света находит отражение в соотношении Планка-Эйнштейна:

c
hv

c
E
p
hc
hv
E







где Е – энергия кванта света определенной длины волны; h – постоянная Планка (6,626∙10
34 Дж ∙ с); с – скорость света; ν – частота колебаний вектора; λ – длина световой волны. 

Энергия квантов света, запускающих фотобиологические процессы, достаточно велика: в 

видимой области порядка 215∙103 Дж/моль (для 555 нм), что в несколько раз превышает 
энергию макроэргической связи АТФ (30∙103 Дж/моль). Коротковолновая ультрафиолетовая 
область соответствует ещё большим величинам энергии, которые достаточны для разрыва 
ковалентных связей в органических молекулах.

В фотобиологических экспериментах удобно использовать количество энергии не одного 

фотона, а моля фотонов. Количество фотонов, равное одному молю, получило название 
эйнштейн, таким образом, энергия одного эйнштейна зависит от длины волны и равна: 



моль
Дж
hv
N
E
/



где N – число Авогадро, равное 6,022∙1023 моль-1.
Энергия фотонов, проходящих через некоторую поверхность за единицу времени − поток 

излучения Ф, Ватт (Вт):

t

hv
N
Ф




Поток излучения, падающий на единицу площади, перпендикулярной к направлению 

распространения света – интенсивность света I (Вт/м2):

S
t

hv
N
S
Ф
I






Доза излучения равна произведению интенсивности освещения на длительность 

освещения (Дж/моль∙м2):

It
Д 

Электронная структура молекул и энергетические уровни 

В каждом атоме электрон обладает тремя квантовыми числами, − главным, орбитальным 

и магнитным. Совокупность трёх чисел называют орбиталью. Два электрона не могут 
находиться в одном квантовом состоянии, значит, орбиталь может быть свободна или 
заполнена. На каждой орбитали электрон имеет определённую энергию взаимодействия с 
ядром, следовательно, орбиталям соответствуют электронные энергетические уровни. Кроме 
энергетических уровней электронов в атоме есть колебательные уровни, обусловленные 
разными типами колебаний молекулы (например, растягивание и изменение углов 
ковалентных связей). Также есть вращательная энергия, соответствующая вращению всей 
молекулы или её частей; она мала и не даёт заметного вклада в поглощение фотона, поэтому 
не рассматривается в абсорбционной спектроскопии. Таким образом, полная энергия 

молекулы является суммой энергии электронов на энергетических уровнях (Ее), 
колебательной (Ек) и вращательной (Ев) энергии: 

Ев
Ек
Ее
Е




Уровни энергии образуют дискретную последовательность (Рис. 1). 
Самый нижний электронный уровень называют основным (невозбуждённым) состоянием, 

все другие описывают возбуждённые состояния электрона. Изменение энергетического 
состояния электрона при испускании или поглощении кванта называют переходом и 
отображают вертикальными стрелками.

Рис. 1. Энергетические уровни молекулы и электронные переходы между ними (диаграмма 

Яблонского).

So – основное состояние, 𝑆1

∗ , 𝑆2

∗
– возбуждённые синглетные состояния. Около каждого 

электронного энергетического уровня показаны направления спинов электронов в основном и 
возбуждённых состояниях.

Участие атомов, составляющих сложные органические молекулы, в колебательном и 

вращательном движении приводит к появлению, наряду с указанными электронными 
уровнями, множества подуровней. В соответствии с этим при поглощении света сложными 
молекулами 
возбуждаются 
многие 
электронно-колебательные 
переходы. 
Вместе 
с 

поглощением молекулой квантов с частотой ν0 (чисто электронный переход 0–0) будут 
поглощаться кванты с близкими значениями частот (0–1', 0–2' и т.д.), и поглощение 
распределится в некотором диапазоне частот около v0. Поэтому в отличие от линейчатых 
спектров атомов для сложных молекул обычно характерны широкополосные спектры.

Согласно первому квантовому постулату Нильса Бора, атомная система является 

устойчивой лишь в определенных (стационарных) состояниях, соответствующих некоторой 

последовательности значений энергии Е системы. Любое изменение этой энергии связано со 
скачкообразным переходом системы из одного стационарного состояния в другое. В 
соответствии с законом сохранения энергии переходы атомной системы из одного состояния 
в другое связаны с получением или отдачей энергии системы. Это могут быть как переходы с 
излучением (оптические переходы), так и переходы без излучения (безызлучательные). 

Второй постулат Бора гласит, что при переходе атомной системы из стационарного 

состояния с энергией Е1 в стационарное состояние с энергией Е2 электромагнитное излучение 
поглощается или испускается порциями – квантами излучения: 

𝐸1 − 𝐸2 = ℎ𝜈

Таким образом, каждому возможному переходу между дискретными уровнями энергии 

соответствует определенная спектральная линия монохроматического излучения с 
определенной частотой ν.

 Взаимодействие света с веществом 

В зависимости от структуры вещества с наибольшей вероятностью поглощаются кванты 

света определённой длины волны. Энергия кванта должна соответствовать разнице между 
энергиями двух дискретных состояний – возбуждённого и основного: 

hv
Е
Е
Е




1
2

Энергия фотона прямо пропорциональна его частоте и обратно пропорциональна длине 

волны, так что чем меньший энергетический интервал нужно преодолеть системе при 
переходе между электронными уровнями, тем меньшей частоты (более длинноволновый) 
фотон нужно ей поглотить. Для большинства биологических молекул длины волн, 
соответствующие переходам между основным и возбуждённым состоянием, лежат в 
ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Возможны также низкие по энергии переходы 
между колебательными уровнями молекулы – они происходят при поглощении излучения в 
инфракрасной области.

При поглощении фотон взаимодействует с электронным облаком атома или молекулы. 

Молекула переходит из основного состояния в возбуждённое, что связано с переходом 
электрона на незаполненную орбиталь с большей энергией, либо с отрывом его от атома:




S
hv
S

Возбуждённая молекула S* не отличается от обычной S по химическому составу, но имеет 

избыточное количество энергии. В процессе фотосинтеза энергия поглощённого света с 
электроном передается по цепи сопряженных молекул вплоть до акцептора электрона. 
Поглощение кванта света хромофором фоторегуляторных молекул (фитохром растений, 
родопсин животных), приводит к структурному изменению хромофора – изомеризации, за 
счет полученной энергии изменяется конформация белковой части молекулы, которая 
становится при этом физиологически активной и запускает биологический процесс.

Время существования возбуждённой молекулы очень мало – около 10−8 сек. За этот 

период большинство одновременно возбуждённых молекул возвращаются в исходное 
состояние. При переходе на нижний энергетический уровень электроны испускают энергию в 
виде фотона. Это явление флуоресценции может быть выражено как 

f
hv
S
S


