Молекулярно-биологические методы изучения биологических макромолекул (Модуль 1)

Молекулярно
биологические методы 

изучения 

биологических 
макромолекул

Модуль 1

Учебное пособие

Москва

ИНФРА-М

2021

УДК 577.2
ББК 28.070

М75

Учебно-методический совет по биологии Федерального УМО «Биологические науки» 

считает целесообразным издать электронное учебное пособие коллектива авторов под ред. 
Ф.Ф. Литвина «Молекулярно-биологические методы изучения биологических макромолекул. 

Модуль 1» и рекомендует использовать в учебном процессе в качестве учебного пособия 
для обучающихся образовательных организаций высшего образования по направлениям 

06.03.01 и 06.04.01 «Биология», 06.06.01 «Биологические науки» и смежным направлениям 

и специальностям, а также программам дополнительного образования

А в т о р ы: 
Л.Я. 
Сатина, 
О.С. 
Костарева, 
С.В. 
Чернышов, 
А.О. 
Михайлина, 

И.Ю. Позднякова-Филатова, О.А. Казанцева, А.В. Ефимов, Г.И. Гительзон

Р е ц е н з е н т ы:
С.В. Тищенко, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник 

Института белка Российской академии наук;

Т.В. 
Шевчук, 
доктор 
биологических 
наук, 
заведующий 
лабораторией 

биотехнологии 
растений 
Института 
биоорганической 
химии 
имени 
академиков 

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук

М75 Молекулярно-биологические 
методы 
изучения 
биологических 

макромолекул. Модуль 1 : учебное пособие / Л.Я. Сатина, 
О.С. Костарева, С.В. Чернышов [и др.] ; под ред. Ф.Ф. Литвина. —
Москва : ИНФРА-М, 2021. — 114   с.

ISBN 978-5-16-105757-5 (online)

Учебное пособие содержит важную информацию о ряде молекулярно
биологических методов, используемых в современных биологических исследованиях. 
Авторы 
объясняют 
теоретические 
основы 
методов 
и 
их 
применимость 

в экспериментальной лаборатории. Кроме того, подробно описаны лабораторнопрактические занятия для развития необходимых навыков овладения современными 
методами, используемыми в биохимии, молекулярной биологии, физической химии, 
спектроскопии, физиологии и микробиологии. Каждую главу написали опытные 
преподаватели и исследователи, а информация представлена в легко усваиваемой форме. 

Рассчитано на широкий круг читателей: студентов, аспирантов и слушателей 

программ дополнительного образования, изучающих биологию и химию.

УДК 577.2
ББК 28.070

ISBN 978-5-16-105757-5 (online)                                                 © Коллектив авторов, 2021

ФЗ № 
436-ФЗ

Издание не подлежит маркировке 
в соответствии с п. 1 ч. 2 ст. 1

1. 
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ............................................. 6 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА ............................................................................................................................ 6 

Принцип метода ....................................................................................................................................................... 6 

Методика проведения электрофореза нуклеиновых кислот в агарозных гелях ................................................ 7 

Анализ и характеристика нуклеиновых кислот, разделенных в агарозном геле ............................................... 8 

Возможности метода электрофореза в агарозных гелях...................................................................................... 9 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ................................................................................................................................................ 11 

Разделить с помощью электрофореза в агарозном геле фрагменты ДНК известного молекулярного веса 
или фрагменты ДНК, полученные самостоятельно действием на ДНК бактериофага или на плазмидную 
ДНК известной рестриктазы. ................................................................................................................................. 11 

Оценка полученных результатов .......................................................................................................................... 14 

ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................................................................................ 14 

2. 
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ................................................ 15 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА .......................................................................................................................... 15 

Общие сведения о плазмидах .............................................................................................................................. 15 

Выделение плазмидной ДНК ................................................................................................................................ 17 

Электрофорез в агарозном геле ........................................................................................................................... 18 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ................................................................................................................................................ 25 

Выделение плазмидной ДНК ................................................................................................................................ 25 

ПРИЛОЖЕНИЕ ......................................................................................................................................................... 26 

ЛИТЕРАТУРА ................................................................................................................................................................ 27 

3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КОМПЕТЕНТНЫХ “КАЛЬЦИЕВЫХ” КЛЕТОК E. COLI И ПРОЦЕДУРА ИХ 
ТРАНСФОРМАЦИИ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК ........................................................................................................... 28 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА .......................................................................................................................... 28 

Трансдукция ............................................................................................................................................................ 28 

Трансформация ...................................................................................................................................................... 28 

Историческая справка ............................................................................................................................................ 29 

Естественная трансформация ............................................................................................................................... 29 

Индуцированная трансформация ......................................................................................................................... 31 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ................................................................................................................................................ 35 

Порядок действий в практической части задачи ................................................................................................. 35 

Приготовление компетентных клеток E. coli ........................................................................................................ 36 

Проведение трансформации ................................................................................................................................ 36 

ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................................................................................ 38 

4.  ВЫДЕЛЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ БЕЛКОВ ИЗ БАКТЕРИАЛЬНЫХ 
КЛЕТОВ E. COLI .......................................................................................................................................................... 39 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА ................................................................................................................ 39 

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКА ........................................................................................................... 44 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ................................................................................................................................................ 49 

Выделение и очистка рекомбинантного флуоресцентного белка из бактериальных клеток Escherichia coli.
 ................................................................................................................................................................................. 49 

ЛИТЕРАТУРА ............................................................................................................................................................ 53 

5. 
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) ........................................................................................... 54 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА .......................................................................................................................... 54 

Коротко об основных принципах .......................................................................................................................... 54 

Более подробно о самой реакции ........................................................................................................................ 57 

Некоторые (но далеко не все) разновидности ПЦР. ........................................................................................... 60 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ................................................................................................................................................ 62 

Схема эксперимента .............................................................................................................................................. 63 

ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ МАТЕРИАЛЫ .............................................................................................................................. 65 

ССЫЛКИ НА ОНЛАЙН-ИНСТРУМЕНТЫ .................................................................................................................. 65 

6. РЕСТРИКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ДНК ................................................................................................................. 66 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА .......................................................................................................................... 66 

Происхождение ферментов рестрикции ............................................................................................................. 68 

Типы эндонуклеаз рестрикции ............................................................................................................................. 70 

Номенклатура эндонуклеаз рестрикции .............................................................................................................. 71 

Разнообразие ферментов рестрикции ................................................................................................................. 73 

Узнавание и расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции ........................................................................... 74 

Формирование двуцепочечных разрывов эндонуклеазами рестрикции II типа .............................................. 76 

Частота встречаемости сайтов рестрикции .......................................................................................................... 76 

Активность эндонуклеаз рестрикции и условия ее проявления ........................................................................ 77 

Применение эндонуклеаз рестрикции II типа ..................................................................................................... 79 

Реакция рестрикционного анализа ...................................................................................................................... 80 

Метод гель-электрофореза в агарозном геле как заключительный этап рестрикционного анализа ДНК .... 80 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ................................................................................................................................................ 84 

Рестрикционный анализ ДНК ................................................................................................................................ 84 

Схема эксперимента .............................................................................................................................................. 85 

ЛИТЕРАТУРА: ........................................................................................................................................................... 89 

7. СТЕРЕОХИМИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ (атомно-молекулярное моделирование) .. 90 

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА .......................................................................................................................... 90 

ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ СТЕРЕОХИМИИ .................................................................................................................. 91 

Стереохимические особенности атомов углерода, азота, кислорода .............................................................. 94 

Основные внутримолекулярные взаимодействия и конформационный анализ молекул .............................. 97 

Конформационные возможности полипептидной цепи и карта Рамачандрана ........................................... 100 

Некоторые закономерности внутри- и межмолекулярных взаимодействий ................................................. 102 

ПРОСТРАНСТВЕННЫЕ МОДЕЛИ МОЛЕКУЛ ............................................................................................................. 105 

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ .............................................................................................................................................. 112 

Порядок сборки моделей молекул из стандартных блоков ............................................................................ 112 

ЛИТЕРАТУРА .............................................................................................................................................................. 114 

 

1. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ 

НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Авторы к.б.н. О.С Костарева, Институт Белка РАН, Л.Я. Сатина, Биологический 

факультет МГУ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ МЕТОДА 

Среди 
различных 
методов 
электрофореза 
определенное 
место 
занимает 

электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот. Благодаря этому методу удается 
относительно просто, быстро и с хорошей разрешающей способностью проводить не только 
анализ сложной смеси нуклеиновых кислот, но и выделять эти компоненты. Существенной 
особенностью электрофоретического метода является также то, что этот метод позволяет 
оценить конформацию нуклеиновых кислот и определить их молекулярную массу.

Гель-электрофорез нуклеиновых кислот как метод разделения известен давно. В 1955 году 

Смитс использовал крахмальный гель, а в 1959 году Раймонд ввел полиакриамидный гель, 
который в 1965 году был применен Ричардсом для разделения нуклеиновых кислот. В то же 
время Цанев добился прекрасного разделения РНК на агаровых пластинках.

Электрофорез в агарозном геле использовали Хейуорт и Смит в 1972 году для отделения 

одноцепочечных фрагментов ДНК бактериофага от денатурированной ДНК бактериофага с 
последующим определением размеров разделенных фрагментов.

Принцип метода 

В основе метода электрофореза нуклеиновых кислот, как и в основе других 

электрофоретических методов, лежит способность молекул, несущих электрический заряд, 
двигаться при наложении внешнего электрического поля в направлении катода или анода в 
соответствии со своим суммарным зарядом.

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот используют эффект 

молекулярного сита, присущий целому ряду гелей, в частности, гелям агарозы. Агароза 
является главным компонентом агара, получаемого из некоторых видов водорослей, и 
представляет собой линейный полимер, состоящий из чередующихся остатков сахаров. При 
температурах 84 - 96С суспензия агарозы в воде или буфере переходит в прозрачную 
жидкость ("плавится"). При последующем снижении температуры до 36 - 42С растворы 
агарозы застывают, образуя гель. Гелеобразование идет путем связывания пучков нитей 
агарозы в пространственную сетку за счет образования водородных связей между ними. 
Образование сетки из нитей агарозы во всем объеме геля фактически представляет собой 
возникновение в геле пор, средний радиус которых зависит от концентрации используемой 
агарозы. Чем больше концентрация агарозы, тем меньше средний радиус пор геля. Становится 
очевидным, что чем крупнее молекулы нуклеиновых кислот, подвергающихся электрофорезу 
в геле агарозы определенной концентрации, тем труднее им "протиснуться" через поры геля. 
Именно на этом эффекте молекулярного сита и основан метод разделения нуклеиновых кислот 
в гелях агарозы.

Следует заметить, что в нейтральных и щелочных средах молекулы нуклеиновых кислот 

несут значительный отрицательный заряд, обусловленный диссоциацией фосфатных групп 
нуклеиновых кислот. Отношение же заряда молекулы к ее массе является постоянной 
величиной. Поэтому чем крупнее молекула, тем, с одной стороны, на нее накладывается 
большая электродвижущая сила и молекула должна двигаться быстро, но, с другой стороны, 

крупная молекула испытывает больший тормозящий эффект пор геля, чем небольшие 
молекулы. Таким образом, в большинстве случаев фракционирование нуклеиновых кислот 
при электрофорезе идет за счет различий в размере молекул, а не в их зарядах.

Методика проведения электрофореза нуклеиновых кислот в агарозных гелях 
Аппаратура. Электрофорез можно проводить в цилиндрических стеклянных трубках с 

гелем или в плоских пластинах геля. В первом случае одну пробу вносят на одну трубку. 
Преимущество этого варианта электрофореза:

1. достаточно большой объем пробы;
2. простота нанесения пробы;
3. легкость сканирования гелей;
4. возможность резки гелей на тонкие полоски;
5. возможность работы с очень длинными трубками гелей.

Электрофорез в пластинах обеспечивает:
1. стандартные условия для всех проб в одном и том же геле, что удобно для сравнения 

их электрофоретической подвижности;

2. большое число анализов на одной пластине;
3. экономию материалов (агарозы и исследуемого вещества);
4. возможность получить радиоавтограф при разделении меченых молекул нуклеиновых 

кислот.

Приборы с трубками обеспечивают проведение электрофореза в вертикальном 

направлении, тогда как электрофорез в пластинах можно проводить не только в вертикальном, 
но и в горизонтальном направлении, что позволяет использовать полужидкие гели с очень 
небольшой концентрацией агарозы для разделения крупных молекул ДНК.

Агароза для приготовления гелей должна быть высокой степени чистоты. Ее поставляет в 

виде лиофилизированного порошка целый ряд фирм. Производятся различные типы агарозы, 
отличающиеся температурами плавления и гелеобразования.

Агарозные гели можно приготовить очень быстро. Для этого навеску порошка агарозы 

суспендируют в соответствующем буфере и выдерживают на кипящей водяной бане до 
полного расплавления. Иногда суспензию агарозы просто кипятят в колбе. После охлаждения 
золя агарозы примерно до 50С его заливают в соответствующую форму, где агароза 
застывает, образуя гель.

Выбор концентрации агарозы, то есть пористости геля, диктуется размерами 

фракционируемых макромолекул. Поры геля должны быть легко проницаемы для молекул 
биополимера, чтобы лишь тормозить их миграцию в электрическом поле за счет трения, 
поэтому для электрофореза обычно применяют гели с концентрацией агарозы 0,4 - 2 %. Ниже 
для ориентировки представлены примерные концентрации гелей агарозы (в процентах) для 
некоторых распространенных объектов фракционирования:

Таблица 1.

Объект фракционирования
Концентрация геля

%

Высокомолекулярная ДНК вирусов и плазмид
0,4

Фрагменты ДНК (5 - 20 000 пар оснований)
0,7

Денатурированная мРНК
1,0

Двуцепочечная вирусная РНК (500 -5000 пар 
оснований)
1,5

Рибосомная РНК
1,75

Фрагменты ДНК (100 - 1000 пар оснований)
2,0

Горизонтальные пластины позволяют работать с очень жидкими гелями с концентрацией 

агарозы 0,1 - 0,3%, что дает возможность фракционировать крупноблочные молекулы ДНК с 
молекулярной массой до 500 мегадальтон.

Выбор буфера при электрофорезе нуклеиновых кислот в большинстве случаев не играет 

существенной роли. Чаще всего используют трис-боратный, трис-ацетатный и трисфосфатный буферы с рН 7,5 - 8,5.

Если электрофорез нужно вести в условиях, обеспечивающих денатурацию нуклеиновой 

кислоты, то они могут быть созданы, в частности, полимеризацией геля в растворе 0,02 - 0,03 
М NaOH.

Во все буферы, как правило, вносят этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) до концентрации 1 

- 2 мМ. Это необходимо не только для блокирования активности нуклеаз, но и для 
предупреждения осаждения нуклеиновых кислот двухвалентными металлами.

Рабочие значения напряжения и тока подбирают не только с учетом обеспечения 

теплоотвода, но и с таким расчетом, чтобы напряженность электрического поля в геле не 
превышала 5 В/см, так как при больших значениях напряженности поля крупные молекулы 
нуклеиновых кислот могут, деформируясь, "протискиваться" через поры геля независимо от 
своей массы.

Для визуального наблюдения за ходом электрофореза в лунки геля вместе с пробами 

вносят какой-либо краситель (так называемый лидирующий краситель), который заряжен, как 
и молекула нуклеиновой кислоты, отрицательно. Электрофорез обычно заканчивают, когда 
пятно красителя достигнет края геля. В качестве лидирующего красителя чаще всего 
используют бромфеноловый синий. Следует только иметь в виду, что в крупнопористых гелях 
агарозы малые фрагменты ДНК могут при электрофорезе даже обгонять бромфеноловый 
синий.

Анализ и характеристика нуклеиновых кислот, разделенных в агарозном геле  
Методы обнаружения и характеристики разделяемого в геле образца разнообразны по 

сложности и чувствительности. Их выбор определяется конечной целью, которую ставит 
перед собой экспериментатор. Чаще всего для обнаружения нуклеиновых кислот в гелях 
используют красители, образующие с нуклеиновыми кислотами комплексы. Так, краситель
Stains-all окрашивает ДНК в синий, а РНК - в голубовато-пурпурный цвет. Акридиновый 
оранжевый, связываясь с двуцепочечными участками ДНК, дает зеленую флуоресценцию, а, 
связываясь с одноцепочечными участками, флуоресцирует красным цветом. Метиленовый 
зеленый специфически окрашивает ДНК, но не связывается с РНК. Однако чаще всего для 
окрашивания ДНК и ее фрагментов в агарозных гелях используется бромистый этидий краситель, обладающий способностью внедряться (интеркалировать) в двуцепочечные 
участки нуклеиновых кислот между плоскостями соседних пар оснований. При освещении 
ультрафиолетом молекул нуклеиновых кислот, содержащих интеркалированные молекулы 
бромистого этидия, возникает флуоресценция в оранжевом участке спектра. Чувствительность 
метода обнаружения нуклеиновых кислот в гелях с помощью бромистого этидия очень 
высока: в гелях агарозы удается наблюдать полосы, содержащие 0,01 мкг ДНК.

При электрофоретическом разделении меченых молекул ДНК, то есть молекул, 

содержащих
радиоактивные 
изотопы 
(чаще 
всего 
атомы 
32Р), 
положение 
ДНК 

идентифицируют с помощью радиоавтографии. Данный метод основан на том, что гель после 
электрофореза помещают на фотографическую пластинку. При этом происходит потемнение 

фотоэмульсии в тех местах фотопластинки, против которых в геле находятся меченые 
молекулы ДНК.

Возможности метода электрофореза в агарозных гелях  
Электрофорез в агарозных гелях позволяет оценить размеры (или молекулярную массу) 

фракционируемых нуклеиновых кислот. Следует помнить, что размеры ДНК оценивают в 
тысячах пар оснований, а молекулярную массу - в дальтонах (Д). Один дальтон - это 1/12 
массы атома 12С. Так как средняя молекулярная масса одной пары оснований равна 660, то, 
например, молекулярная масса ДНК размером 3000 пар оснований равна 2 106 Д (Табл. 2.). 
На практике определение молекулярной массы ДНК после гель-электрофореза проводят 
графическим способом. Для каждой системы буфера и концентрации геля строят 
калибровочную кривую с помощью образцов ДНК известной молекулярной массы. Для этих 
целей используют специальные наборы фрагментов ДНК, полученных при воздействии на
ДНК бактериофага или на плазмидную ДНК, хорошо изученных эндонуклеаз рестрикции 
(рестриктаз) (Табл. 1.).

Сравнивая относительную подвижность исследуемого в этой системе образца ДНК с 

подвижностью фрагментов ДНК известной молекулярной массы, можно легко и точно 
определить молекулярную массу исследуемой ДНК на графике.

Таблица 1.

Схема расщепления ДНК бактериофага  рестриктазой BbvII

Фрагменты ДНК

В парах оснований
В дальтонах

14548
9,6  106

7965
5,2  106

7892
5,0 106

2768
1,8  106

2038
1,3  106

2023
1,3  106

1714
1,1  106

1364
0,9  106

1183
0,7  106

1110
0,7  106

976
0,6  106

894
0,5  106

889
0,5  106

822
0,5  106

462
0,3  106

405
0,2  106

403
0,2  106

307
0,2  106

292
0,2  106

242
0,1  106

67
0,4  105

62
0,4  105

38
0,2  105

Так как почернение фотоэмульсии при радиоавтографии гелей, содержащих меченую 

ДНК, или при фотографировании гелей, содержащих ДНК, окрашенную бромистым этидием, 
пропорционально концентрации ДНК, то при сканировании негативов с помощью оптических 
приборов, измеряющих степень почернения (оптическую плотность) фотоэмульсий, можно 
определить концентрацию образцов ДНК в каждой зоне геля (с этой целью используются 
денситометры, иногда в сочетании с лазером).

С помощью гель-электрофореза можно также оценить некоторые конформационные 

различия в молекулах нуклеиновых кислот, так как одна из особенностей гель-электрофореза 
заключается в том, что поведение нуклеиновых кислот в геле сильно зависит от их вторичной 
структуры. Так, длинная двуцепочная ДНК при нейтральных рН гибка и достаточно быстро 
продвигается через поры геля, тогда как одноцепочная молекула той же длины сворачивается 
клубком, что затрудняет ее продвижение в геле. Суперскрученные молекулы ДНК компактны 
и поэтому быстро продвигаются в геле при электрофорезе. Однако при разрыве нитей 
молекула ДНК разворачивается, и ее наружные размеры увеличиваются. Это позволяет 
разделить суперскрученные и линейные формы ДНК одинаковой молекулярной массы.

Метод электрофореза в агарозном геле
широко используют для получения
в 

препаративном количестве
целевых
фрагментов ДНК. Для этого после проведения 

электрофореза ДНК элюируют из кусочков геля различными способами.