Хромосомы типа ламповых щеток: современные представления и перспективы исследований
Покупка
Основная коллекция
Тематика:
Общая генетика. Общая цитология
Издательство:
Санкт-Петербургский государственный университет
Год издания: 2019
Кол-во страниц: 104
Дополнительно
Вид издания:
Монография
Уровень образования:
ВО - Магистратура
ISBN: 978-5-288-05984-1
Артикул: 767949.01.99
Доступ онлайн
249 ₽
В корзину
Издание содержит обзор современных работ по хромосомам типа ламповых щеток. Рассмотрены механизмы поддержания хромомерно-петлевой организации хромосом типа ламповых щеток, характер транскрипции на латеральных петлях хромосом, классификация формирующихся в определенных локусах хромосом ядерных доменов. Описаны методы работы с хромосомами типа ламповых щеток, которые позволяют использовать этот объект для развития исследований в актуальных направлениях клеточной и молекулярной биологии, биологии развития и цитогенетики. Научный труд предназначен ученым и специалистам, профиль научно-педагогической деятельности которых связан со структурой и функцией хромосом и ядерных телец, транскрипцией и процессингом РНК, регуляторными и архитектурными некодирующими РНК, и может быть полезен студентам и аспирантам естественнонаучных факультетов вузов и академических институтов.
Скопировать запись
Фрагмент текстового слоя документа размещен для индексирующих роботов.
Для полноценной работы с документом, пожалуйста, перейдите в
ридер.
А. В. Красикова, Т. В. Куликова ХРОМОСОМЫ ТИПА ЛАМПОВЫХ ЩЕТОК СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ИЗДАТЕЛЬСТВО САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
УДК 576.316.353
ББК 28.05
К78
Р е ц е н з е н т д-р биол. наук Д. С. Боголюбов (ФГБУН Ин-т цитологии РАН)
К78
Красикова А. В., Куликова Т. В.
Хромосомы типа ламповых щеток: современные представления и перспективы исследований. — СПб.: Изд-во С.-Петерб.
ун-та, 2019. — 104 с.
ISBN 978-5-288-05984-1
Издание содержит обзор современных работ по хромосомам типа ламповых щеток. Рассмотрены механизмы поддержания хромомерно-петлевой организации хромосом типа ламповых щеток, характер транскрипции на латеральных петлях хромосом, классификация формирующихся
в определенных локусах хромосом ядерных доменов. Описаны методы работы с хромосомами типа ламповых щеток, которые позволяют использовать этот объект для развития исследований в актуальных направлениях
клеточной и молекулярной биологии, биологии развития и цитогенетики.
Научный труд предназначен ученым и специалистам, профиль научнопедагогической деятельности которых связан со структурой и функцией
хромосом и ядерных телец, транскрипцией и процессингом РНК, регуляторными и архитектурными некодирующими РНК, и может быть полезен
студентам и аспирантам естественнонаучных факультетов вузов и академических институтов.
УДК 576.316.353
ББК 28.05
Издание осуществлено при финансовой поддержке
Российского фонда фундаментальных исследований
по проекту № 19-14-00024, не подлежит продаже.
В оформлении обложки использован рисунок авторов
© Санкт-Петербургский
государственный университет, 2019
© А. В. Красикова, Т. В. Куликова, 2019
ISBN 978-5-288-05984-1
ОГЛАВЛЕНИЕ Предисловие ................................................................................................... 7 Глава 1. Современные представления о хромосомах типа ламповых щеток ............................................................................ 9 1.1. Гипертранскрипционный тип оогенеза ........................... — 1.2. Ядро ооцита при гипертранскрипционной активности хромосом .......................................................... 10 1.3. Организация хромосом типа ламповых щеток ............. 14 1.4. Строение центромерных районов хромосом типа ламповых щеток .................................................................... 21 1.5. Строение терминальных районов хромосом типа ламповых щеток .................................................................... 22 1.6. Хроматин хромосом на стадии ламповых щеток .......... 23 1.7. Котранскрипционные этапы процессинга РНК. Состав РНП-матрикса латеральных петель хромосом типа ламповых щеток ........................................................... 29 1.8. Спектр последовательностей, транскрибируемых на хромосомах типа ламповых щеток .............................. 33 Глава 2. Ассоциированные с хромосомами типа ламповых щеток ядерные домены ....................................................................... 40 2.1. Сложные петли хромосом типа ламповых щеток как локус-ассоциированные ядерные домены ...................... 41 2.2. Ядрышки .................................................................................. 46 2.3. Коилинсодержащие тельца: тельце гистонового локуса, «жемчужины» и осевые гранулы ........................ 47 2.4. Центромерные белковые тела............................................. 52 2.5. Спагетти-маркер .................................................................... 55 Глава 3. Методы работы с ядрами растущих ооцитов и хромосомами типа ламповых щеток .................................... 57 3.1. Методы работы с ядрами растущих ооцитов. Исследования трехмерной организации хромосом типа ламповых щеток ........................................................... — 3.2. Методы микроинъекций генно-инженерных конструкций, антител и других молекул в цитоплазму и ядро ооцита ......................................................................... 58
3.3. Микрохирургические методы получения препаратов хромосом типа ламповых щеток ....................................... 59 3.4. Флуоресцентная гибридизация in situ и иммунофлуоресцентное окрашивание хромосом типа ламповых щеток ........................................................... — 3.5. Микродиссекция хромомеров и маркерных структур 61 3.6. Сканирующая электронная микроскопия хромосом типа ламповых щеток ........................................................... 62 Глава 4. Перспективы исследований хромосом типа ламповых щеток ............................................................................ 63 4.1. Гипотезы о функциональном значении хромосом типа ламповых щеток ........................................................... — 4.2. Фундаментальные открытия, сделанные с помощью хромосом типа ламповых щеток ....................................... 65 4.3. Перспективы исследований ................................................ 67 Приложения .................................................................................................... 70 П. 1. Протокол получения препаратов хромосом типа ламповых щеток ........................................................ — П. 2. Протокол иммунофлуоресцентного окрашивания препаратов хромосом типа ламповых щеток .............. 75 П. 3. Протоколы ДНК/(ДНК+РНК-транскрипт) флуоресцентной гибридизации in situ на препаратах хромосом типа ламповых щеток ......... 77 П. 4. Протокол 3D иммунофлуоресцентного окрашивания ядер ооцитов ............................................. 81 П. 5. Протокол 3D РНК-флуоресцентной гибридизации in situ ядер ооцитов ............................................................ 82 Словарь терминов ......................................................................................... 84 Литература ...................................................................................................... 86
Биология иногда выявляет свои универсальные принципы через то, что выглядит как тайна или даже странность. Но в эволюции большинство вещей остались преимущественно механистически одинаковыми на молекулярном уровне, а то, что меняется, — это степень и окружение, в которых разыгрываются различные молекулярные процессы. Поэтому то, что выглядит как исключение, часто оказывается манифестацией молекулярного процесса, который в действительности в основе своей консервативен. Э. Блэкберн
Предисловие Ядро — ключевая для функционирования клетки органелла, которая содержит геномную ДНК организма. Запрограммированная регуляция экспрессии эукариотического генома невозможна без выраженной функциональной компартментализации клеточного ядра. Компартментализация межхроматинового пространства способствует правильному протеканию в ограниченном объеме интерфазного ядра ключевых внутриядерных процессов, таких как тран- скрипция, созревание вновь синтезируемых транскриптов, упаковка и транспорт информационной и некодирующей белки РНК, репликация, репарация и рекомбинация ДНК. Визуализация внутриядерных структур и процессов, происходящих на молекулярном уровне, представляется мощным инструментом при исследовании универсальных принципов организации архитектуры генома и механизмов регуляции экспрессии генов. Для этого перспективно привлечение модельного объекта, позволяющего преодолеть ограничения, связанные с небольшими размерами и «теснотой» интерфазных ядер. За счет гигантских размеров, выраженной хромомерно-петлевой организации, транскрипционной активности, а также отсутствия межхромосомных контактов и контактов с ядерной оболочкой на роль такого модельного объекта идеально подходят хромосомы типа ламповых щеток. Настоящий труд посвящен хромосомам типа ламповых щеток, изучение которых привело ко множеству фундаментальных открытий в области структуры и функции хромосом. К актуальным биологическим проблемам, в решении которых может быть полезно изучение хромосом типа ламповых щеток, можно отнести построение моделей организации хромосом эукариот, иерархическую доменную организацию хроматина, динамику и механизмы регуляции транскрипции и процессинга РНК in vivo, функции длинных некодирующих РНК, механизмы формирования ядерных телец, в том числе в результате
активности определенных локусов генома, фундаментальную роль хромосом в компартментализации клеточного ядра. Целью настоящей работы являлось восполнение нехватки современных сведений о хромосомах типа ламповых щеток. В книге освещаются вопросы организации ядра ооцита при гипертранскрипционном типе оогенеза, строения хромосом типа ламповых щеток, состава эу- и гетеро- хроматина и рибонуклеопротеинового матрикса латеральных петель хромосом типа ламповых щеток, спектра транскрибируемых на латеральных петлях последовательностей, а также классификации ассоциированных с хромосомами типа ламповых щеток ядерных телец. Следует отметить, что настоящий обзор не является исчерпывающим и опирается на ряд современных экспериментальных и обзорных статей, где даны более детальные сведения по отдельным разделам книги; исторические сведения наиболее подробно изложены в монографии Г. Кэллана (Callan, 1986). В заключение приведен перечень методов работы с хромосомами типа ламповых щеток и дано краткое описание методов приготовления препаратов хромосом типа ламповых щеток из ооцитов шпорцевой лягушки, флуоресцентной гибридизации in situ и иммунофлуоресцентного окрашивания хромосом типа ламповых щеток как в интактном ядре, так и на предметном стекле. Авторы выражают глубокую признательность Елене Романовне Гагинской — основателю научной школы изучения хромосом типа ламповых щеток птиц — за посвящение в эту область исследований и годы научного руководства. Авторы благодарны Херберту Макгрегору и Джозефу Голлу — первопроходцам в изучении хромосом типа ламповых щеток амфибий — за многолетнюю поддержку. Благодарим всех сотрудников лаборатории структуры и динамики клеточного ядра и кафедры цитологии и гистологии биологического факультета СПбГУ, с которыми мы работали в разные годы. Авторы очень признательны Дмитрию Сергеевичу Боголюбову и Евгению Валерьевичу Шевалю за подробные комментарии к рукописи. Отдельно хочется поблагодарить коллег, предоставивших оригинальные микрофотографии в качестве иллюстраций к тексту: Антонину Владимировну Маслову (рис. 1, б; 18), Дмитрия Викторовича Дедуха (рис. 2; 7, а) и Анну Михайловну Злотину (рис. 7, в). Книга издана на средства гранта Российского фонда фундаментальных исследований № 19-14-00024. В книге частично представлены результаты исследований, выполненных при поддержке грантов Российского научного фонда № 14-14-00131, № 19-74-20075, грантов Президента РФ МК-3609.2014.4, МК-1630.2017.4 и грантов Российского фонда фундаментальных исследований № 12-04-01807, № 15-34-21020.
Глава 1 СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ХРОМОСОМАХ ТИПА ЛАМПОВЫХ ЩЕТОК 1.1. Гипертранскрипционный тип оогенеза Все многоклеточные организмы, размножающиеся половым путем, способны формировать высокоспециализированные клетки — гаметы. В ходе дифференцировки обоих типов гамет (яйцеклеток и сперматозоидов) их геномы редуцируются в результате мейотических делений, чтобы, слившись, сформировать зиготу — клетку, способную дать начало новому индивидууму. Оогенез — процесс формирования яйцеклетки — имеет особое значение, поскольку формирующая- ся после оплодотворения зигота наследует от яйцеклетки не только генетическую информацию, но и цитоплазматический материал. В цитоплазме ооцита (созревающей яйцеклетки) накапливаются питательные вещества, рибосомы, митохондрии и множество ферментативных комплексов, используемых эмбрионом на ранних стадиях развития. Кроме того, ооцит запасает множество разнообразных материнских матричных РНК (мРНК), которые в ходе эмбриогенеза будут служить матрицами для синтеза белков. Материнская цитоплазма необходима не только для энергетической и пластической (строительной, синтетической) поддержки ранних этапов развития эмбриона; в ходе оогенеза в ней накапливаются факторы эпигенетической регуляции экспрессии генома зародыша, такие, например, как короткие регуляторные РНК и ДНК-метилтрансферазы. Таким образом, цитоплазма яйцеклетки формирует среду, определяющую ход ранних этапов развития эмбриона, а эмбриогенез берет начало в оогенезе [Дондуа, 2018]. Роль цитоплазмы женских половых клеток эволюционно консервативна, однако в разных филогенетических группах сформированы разные механизмы достижения цитоплазмой функциональной зрелости. Различия этих способов определяют разнообразие типов оогенеза и связаны со степенью вовлеченности в синтез накапливаемых
ооцитом веществ генетического и синтетического аппаратов самого ооцита, клеток гонад и других органов и тканей. Например, в ходе эволюции трофической функции яйцеклетки нагрузка, связанная с синтезом питательных веществ, переносится сначала с ооцита на специализированные желточные клетки в гонадах (у низших беспозвоночных), а затем выводится за пределы гонады и возлагается на клетки печени (у позвоночных) или жирового тела (у насекомых) [Гилберт, 2010]. В разных типах оогенеза различаются также и источники запасаемых ооцитом матричных и регуляторных материнских РНК. Так, согласно одной из классификаций, различают полигеномный и гипертранскрипционный типы оогенеза [Дондуа, 2018]. Оогенез называют полигеномным, если ядерный аппарат ооцита не участвует в синтезе материнских РНК, а их синтез осуществляется в ядрах специализированных клеток гонады. Например, у насекомых из отряда двукрылых ядро ооцита транскрипционно неактивно, а синтез информационных и регуляторных РНК осуществляется в ядрах так называемых питающих клеток [Bogolyubov, Parfenov, 2008]. Питающие клетки имеют общее с ооцитом происхождение, т. е. относятся к клеткам зародышевого пути. В ядрах данных клеток происходит политенизация хромосом, что позволяет увеличить производительность транскрипции, а следовательно, и ускорить оогенез. Гипертранскрипционным называется тип оогенеза, при котором наибольшую активность в синтезе материнских РНК проявляет ядерный аппарат самого ооцита. По такому пути происходит оогенез у рыб, амфибий, рептилий, а также у насекомых из таких отрядов, как прямокрылые, стрекозы и поденки. В некоторых таксономических группах животных и ядро ооцита, и ядра окружающих фолликулярных клеток вносят свой, неравноценный, вклад в производство материнской РНК. По такому, сочетанному, типу осуществляется оогенез, например, у птиц [Гагинская, 1975]. 1.2. Ядро ооцита при гипертранскрипционной активности хромосом При гипертранскрипционном и сочетанном типах оогенеза происходит характерная трансформация ядерного аппарата, обеспечивающая интенсивную транскрипцию определенных участков генома. При этом ядро ооцита значительно увеличивается в размере, а хроматин деконденсируется. Так, диаметр ядра ооцита шпорцевой лягушки достигает 400 мкм, что позволяет видеть ядро невооружен
ным глазом. Здесь стоит напомнить, что диаметр интерфазного ядра в соматических клетках у этого же вида составляет в среднем 10 мкм, таким образом, объем ядра ооцита в ~105 раз больше объема ядра соматической клетки. Благодаря крупным размерам ядер ооцитов клеточное ядро впервые обнаружено и описано при исследовании ооцитов курицы с помощью простой лупы. Ядро ооцита тогда было названо зародышевым пузырьком ([Purkinje, 1825], цит. по [Gall et al., 2004]). Растущие ооциты амфибий и птиц являются исключительно удобными и широко используемыми модельными объектами для изучения структуры и функции эукариотического ядра и других общебиологических проблем [Callan, 1986; Macgregor, 1986; Morgan, 2002; Gall et al., 2004; Gaginskaya et al., 2009]. Ядра ооцитов амфибий на протяжении многих лет служат модельным объектом для исследования различных внутриядерных органелл. В ооцитах амфибий подробно изучены особенности морфофункциональной и молекулярной организации ядрышек и других внутриядерных телец, участвующих в динамике компонентов аппарата экспрессии генов ([Gall et al., 1999; Квасов и др., 2000; Gall, 2000; Gall et al., 2004] и др.). В ядрах ооцитов амфибий помимо хромосом присутствуют многочисленные экстрахромосомные тельца (рис. 1, а): 1500–2000 экстрахромосомных ядрышек, достигающих 10–15 мкм в диаметре, 50–100 не связанных с хромосомами телец, и кроме этого, тысячи кластеров интерхроматиновых гранул (КИГ) [Gall et al., 2004]. Изучению ядрышек в ооцитах амфибий способствовало открытие явления амплификации генов рибосомной РНК (рРНК), приводящей к появлению сотен экстрахромосомных ядрышек [Gall, 1968]. Показано, что 90 % запасаемой ооцитом РНК представлено рРНК, что в случае гипертранскрипционного типа оогенеза обеспечивается амплификацией, т. е. множественным копированием локуса ядрышкового организатора. В ядре растущего ооцита шпорцевой лягушки экстра- хромосомные ядрышки лежат на периферии ядра, что обеспечивает быстрый экспорт рибосомных субчастиц в цитоплазму ооцита, а на более поздних стадиях ядрышки мигрируют в центр ядра. Амплифицированные гены рРНК в экстрахромосомных ядрышках послужили удобным объектом для разработки метода гибридизации in situ [Gall, Pardue, 1969], который стал одним из наиболее широко используемых в молекулярной цитогенетике. Интересно, что у половозрелых самок птиц, в отличие от амфибий, амплификации ядрышкого организатора в оогенезе не происходит, более того, ядрышковый организатор на хромосоме остается неактивным [Koshel et al., 2016]. Таким образом, в ядре ооцита половоз
релой самки ядрышки не формируются. В этом случае необходимый пул рРНК, запасаемой в ооплазме, обеспечивается фолликулярными клетками [Koshel et al., 2016], тогда как синтез других материнских РНК осуществляется в ядре самого ооцита. Интенсивная транскрипция на хромосомах в ооцитах животных с гипертранскрипционным и сочетанным типами оогенеза приводит к значительной декомпактизации хромосом. В результате они приобретают характерную форму, которая первым исследователям напомнила щетки для чистки стекол керосиновых ламп (или ершики для мытья бутылок), в связи с чем для хромосом этого типа Й. Рюкертом был предложен метафорический термин «хромосомы типа ламповых щеток» ([Rückert, 1892], цит. по [Callan, 1986]). Хромосомы типа ламповых щеток формируются в начале большого роста ооцитов, на диплотенной стадии профазы первого мейо- тического деления. У позвоночных период диплотены первой профазы мейоза, в котором хромосомы имеют форму ламповых щеток, может быть исключительно длительным (до нескольких лет). Первые данные о хромосомах этого типа, обнаруженных В. Флеммингом в ядрах ооцитов аксолотля Ambystoma mexicanum, были опубликованы около 140 лет назад ([Flemming, 1882], цит. по [Callan, 1986]). Хромосомы типа ламповых щеток обнаружены у позвоночных (рыб, амфибий, рептилий, птиц) и беспозвоночных (насекомых). Среди млекопитающих они не формируются, за исключением яйцекладущих. Наиболее подробно хромосомы типа ламповых щеток охарактеризованы у хвостатых амфибий с большим размером генома (тритонов, саламандр и аксолотля) [Callan, 1986; Macgregor, 1986], у шпорцевой лягушки — распространенного модельного объекта [Gall, 2014], и у домашней курицы с хорошо охарактеризованным кариотипом и геномом [Gaginskaya et al., 2009]. В последнее время к решению различных биологических задач также привлекаются хромосомы типа ламповых щеток рептилий [Lisachov et al., 2019] и рыб (личное сообщение Д. В. Дедуха). В гигантском ядре ооцита хромосомы типа ламповых щеток занимают центральную область ядра, не контактируя с ядерной оболочкой. В связи с этим такие хромосомы, так же как и ядра ооцитов, можно изолировать при помощи несложных микрохирургических манипуляций (см. главу 3). В трехмерном пространстве ядра хромосомы типа ламповых щеток не соприкасаются и расположены хао- тично, в отличие от хромосомных территорий в интерфазном ядре соматических клеток (рис. 1, б) [Маслова, Красикова, 2011]. Актуален вопрос о том, как обеспечивается поддержание архитектуры генома в гигантских ядрах ооцитов, достигающих 400 мкм в диа
Доступ онлайн
249 ₽
В корзину