Биолюминесцентные биотесты: современное состояние и перспективы

Министерство науки и высшего образования Российской Федерации 
Сибирский федеральный университет 
Институт биофизики СО РАН 

БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ БИОТЕСТЫ: 
СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ 

Монография 

Под редакцией доктора биологических наук 
В.А. Кратасюк 

Красноярск 
СФУ 
2018 

УДК 591.148 
ББК 28.071.13 
Б634 

Подготовлено при поддержке Российского научного фонда (проект № 16-14-10115) 
и Министерства науки и образования РФ (государственное задание  
на выполнение работ, проект № 6.7734.2017/БЧ) 

Авторский коллектив: 
Е.Н. Есимбекова,   
Н.С. Кудряшева, 
В.А. Кратасюк,  
 
С.Е. Медведева, 
Е.В. Немцева,  
М.А. Кириллова 

Рецензенты: 
А.Б. Салмина, доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник и руководитель НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, зав. кафедрой биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, проректор по инновационному развитию и международной деятельности ФГБОУ ВО КрасГМУ 
имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого; 
Д.И. Стом, доктор биологических наук, профессор, зав. лабораторией 
водной токсикологии НИИ биологии, профессор биолого-почвенного факультета ФГБОУ ВО «Иркутский государственный университет» 

Б634 
Биолюминесцентные биотесты: современное состояние 
и перспективы : монография / Е.Н. Есимбекова, В.А. Кратасюк, Е.В. Немцева [и др.] ; под ред. В.А. Кратасюк. – Красноярск : Сиб. федер. ун-т, 2018. – 256 с. 
ISBN 978-5-7638-3910-4 

Рассмотрены проблемы биологических методов тестирования окружающей среды. Представлены современные методы биотестирования на основе 
светящихся организмов и выделенных из них ферментативных систем. Приведены примеры использования биолюминесцентных методов в избирательном 
и интегральном анализе сред. Особое внимание уделено методам на основе 
ферментов светящихся бактерий, преимуществам их использования в биолюминесцентном биотестировании. Изучены способы стабилизации ферментов 
светящихся организмов и примеры их использования в качестве биологического 
модуля биосенсоров. 
Предназначена для специалистов, ведущих исследования в области экологической токсикологии, биотехнологии, биофизики и смежных областях, аспирантов и студентов, обучающихся по этим направлениям. 

Электронный вариант издания см.: 
УДК 591.148 
http://catalog.sfu-kras.ru  
ББК 28.071.13 

ISBN 978-5-7638-3910-4 
© Сибирский федеральный 
университет, 2018 

ОГЛАВЛЕНИЕ 

 
 
СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ ......................................... 6 

ВВЕДЕНИЕ .......................................................................................................... 8 

Глава 1. БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ТЕСТИРОВАНИЯ 
ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ................................................................. 13 
1.1. Многообразие биологических методов тестирования .................... 14 
1.2. Проблемы биотестирования .............................................................. 18 
1.3. Перспективы использования биолюминесцентных методов  
в биотестировании .............................................................................. 21 

Глава 2. ПРИМЕНЕНИЕ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ГРИБОВ   
В БИОТЕСТИРОВАНИИ .................................................................. 22 

Глава 3. МЕТОДЫ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА   
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНОЙ 
БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ................................................................ 28 
3.1. Основные принципы разработки биолюминесцентных  
биотестов на основе бактерий ........................................................... 28 
3.2. Влияние химических веществ различной природы   
на люминесценцию бактерий ............................................................ 31 
3.3. Биотесты на основе лиофильно высушенных клеток ..................... 34 
3.4. Биотесты на основе рекомбинантных клеток бактерий ................. 36 
3.5. Биотесты на основе иммобилизованных клеток бактерий ............. 40 
3.6. Примеры использования биолюминесцентных биотестов   
в экологическом мониторинге ........................................................... 44 

Глава 4. МЕТОДЫ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА, 
ОСНОВАННЫЕ НА ИСПОЛЬЗОВАНИИ  
ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ................................................... 52 
4.1. Селективные методы биолюминесцентного анализа in vitro ......... 52 
4.1.1. Применение биолюминесцентной ферментной системы 
светляков .............................................................................................. 52 
4.1.2. Применение биолюминесцентной ферментной системы 
бактерий ............................................................................................... 59 
4.2. Интегральные методы биолюминесцентного анализа in vitro ....... 62 
4.2.1. Предпосылки для разработки ферментативных методов 
биотестирования .................................................................................. 62 

3 

4.2.2. Принципы биолюминесцентного  
биотестирования in vitro ..................................................................... 66 
4.3. Построение сигнальной системы биолюминесцентных тестов ..... 70 
4.3.1. Принципы конструирования биолюминесцентных  
тестов in vitro ....................................................................................... 70 
4.3.2. Применение сигнальной системы биотестов  для анализа 
пестицидов ........................................................................................... 75 

Глава 5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ВЛИЯНИЯ   
ЭКЗОГЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ  
НА БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ ........................................................ 82 
5.1. Влияние экзогенных соединений на процессы переноса  
энергии в биолюминесцентной системе ........................................... 82 
5.2. Воздействие ксенобиотиков на процессы переноса электрона   
в биолюминесцентной системе .......................................................... 87 
5.3. Влияние молекул на процессы переноса водорода   
в биолюминесцентной системе .......................................................... 91 
5.4. Взаимодействие экзогенных соединений   
с ферментами биолюминесцентной системы ................................... 94 

Глава 6. НАПРАВЛЕНИЯ РАЗВИТИЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ 
ТЕСТОВ IN VITRO ........................................................................... 101 
6.1. Биолюминесцентные методы в экологии ....................................... 101 
6.1.1. Биолюминесцентный метод анализа токсичности воды .... 101 
6.1.2. Биолюминесцентный метод оценки радиотоксичности 
растворов ............................................................................................ 115 
6.1.3. Способы оценки эффективности детоксикации   
природными гуминовыми веществами ........................................... 134 
6.2. Биолюминесцентные методы in vitro в пищевой  
промышленности ............................................................................... 143 
6.3. Биолюминесцентные методы in vitro в медицине ......................... 147 
6.4. Анализ стресса растений биолюминесцентными методами ........ 151 

Глава 7. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ РЕАГЕНТЫ  
ДЛЯ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА ............................ 155 
7.1. Способы стабилизации ферментов ................................................. 155 
7.2. Методы стабилизации ферментов светящихся организмов ......... 159 
7.3. Иммобилизованные реагенты для ферментативного 
биотестирования ................................................................................ 165 
7.3.1. Выбор условий иммобилизации биферментной системы  
NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза + люцифераза ........................... 165 

4 

7.3.2. Разработка многокомпонентного иммобилизованного 
реагента .............................................................................................. 167 
7.4. Сравнение характеристик иммобилизованной и растворимой 
биферментной системы  NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза + 
люцифераза ........................................................................................ 170 
7.5. Способы увеличения чувствительности иммобилизованных 
реагентов ............................................................................................ 175 
7.6. Методика биотестирования с использованием реагента 
«Энзимолюм» .................................................................................... 183 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................... 187 
 
ПОСЛЕСЛОВИЕ ............................................................................................. 187 

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................... 195 
 

5 

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ 

2,4,5-TCP
2,4-ДНФ 
3,5-DCP 
ADР 
AMP 
ATP 
EC (ЭК) 
EDTA 
FAD 
FMN 
FMNH2 
GGBP 
I1 
I2 
 
Iк 
 
Iо 
 
KM 
kсп 
L 
LD (ЛК) 
NAD+/NADP+ 
 
NADH 
P 
PCL-1 
PLG2 

 
 
POPOP 
PVP 
R 
R+L 
 

RCHO

–
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
–  
–  
–  
–  
–  
–  
 
–  
 
–  
 
–  
–  
–  
–  
–  
 
–  
–  
–  
– 

– 
– 
– 
– 

–

2,4,5-трихлорофенол
2,4-динитрофенол 
3,5-дихлорофенол 
аденозиндифосфат 
аденозинмонофосфат 
аденозин-5’-трифосфат 
эффективная концентрация 
этилендиаминтетрауксусная кислота 
флавинадениндинуклеотид 
флавинмононуклеотид 
флавинмононуклеотид восстановленный 
D-галактоза/D-глюкоза-связывающий белок 
максимум интенсивности свечения системы 
интенсивность свечения системы через заданное время 
после достижения максимума 
максимальная интенсивность свечения в контрольной 
пробе 
максимальная интенсивность свечения при добавлении 
анализируемой пробы 
константа Михаэлиса 
константа спада свечения 
люцифераза 
летальная концентрация 
никотинамидадениндинуклеотид / никотинамидадениндинуклеотид фосфат 
никотинамидадениндинуклеотид восстановленный 
период задержки свечения 
пероксид чувствительная арилборная кислота 
химерный белок, состоящий из N-домена люциферазы 
Photinus pyralis, соединенного с С-доменом люциферазы 
Luciola italica 
1,4-бис(5-фенил-2-оксазолил)бензол 
поливинилпирролидон 
NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза 
биферментная система NAD(P)H:FMN-оксидоредуктаза
+ люцифераза 
алифатический альдегид

6 

RCOOH

Tmax 
 
YFP 
АДГ 
БИ 
БПК 
БСА 
БСС 
ГВ 
ГХК 
ГХЦГ 
ДСД 
ДТТ 
ДХФ 
K 
КИМ 
КоА 
КОЕ 
ЛДГ 
ЛИТ 
МИТ 
МСБ 
МЭС 
НТО 
ПВА 
ПДК 
ПХФ 
ТМТД 
УББР 
ЦБК 
ЭБМ 

–
– 

– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 
– 

карбоновая кислота
время выхода интенсивности свечения на максимальный 
уровень 
желтый флуоресцентный белок 
алкогольдегидрогеназа 
биолюминесцентный индекс  
биологическое потребление кислорода 
бычий сывороточный альбумин 
биолюминесцентная сигнальная система 
гуминовые вещества 
горно-химический комбинат 
гексахлоранциклогексан 
допустимая для человека суточная доза 
дитиотреитол 
3,5-дихлорфенол 
максимальный коэффициент детоксикации 
коэффициент интенсивности метаболизма 
кофермент A 
колониеобразующая единица 
лактатдегидрогеназа 
люциферазный индекс токсичности 
микробиолюминесцентный индикатор токсичности 
метилстерилбензол 
микроэкосистема 
тритиевая вода 
поливинилацетат 
предельно допустимая концентрация 
пентахлорфенол 
тетраметилтиурамдисульфид 
уровень биологически безопасного разведения 
целлюлозно-бумажный комбинат 
эколого-биохимический мониторинг 

 

7 

ВВЕДЕНИЕ 

Коллектив авторов этой книги поручил мне написать введение к ней. 

Размышления над текстом монографии, выстраданным в течение многих 
лет, потому что текст был написан на основе многих публикаций соавторов монографии, являющихся результатом более чем 40-летнего периода 
использования светящихся бактерий и их ферментов для экологического 
мониторинга, подталкивали меня отойти от привычного изложения введений к монографии, а подобно авторам «Двойной спирали» [1], рассказать 
об увлекательном процессе появления нового направления в биомониторинге – ферментативных биолюминесцентных биотестах. И тогда, как  
у Дж. Уотсона, можно было бы показать, «что наука вопреки мнению непосвященных редко развивается по прямому логическому пути. На самом 
деле, каждый ее шаг вперед (а иногда и назад) – очень часто событие глубоко личное, в котором главную роль играют человеческие характеры  
и национальные традиции». Конечно, в этом случае изложение истории 
открытия оказалось бы романтичным, как и было в реальности, но и одновременно довольно субъективным. Замечания соавторов были вполне 
справедливы: они считали, что такой текст противоречит стилю научной 
книги, а больше подходит для мемуаров; поэтому введение к монографии 
стало серьезным. Однако текста, написанного об истории открытия, всетаки жалко, потому мы поместили его как послесловие. 

Систематический мониторинг состояния всех природных компонентов: воздуха, водных объектов, почвы и др. – является первоочередным  
в числе мероприятий по улучшению качества окружающей среды и имеет 
крайне важное значение для последующих природоохранных мер. 
В государственной политике РФ вопросы экологии имеют приоритетное значение. В соответствии с нормативными актами РФ в области 
охраны окружающей среды система наблюдения за уровнем загрязнения 
природных объектов проводится по физическим, химическим, гидробиологическим показателям (для водных объектов). Однако, несмотря на совершенствование действующих мер во всех направлениях экологической  
политики, используемые в настоящее время методы мониторинга часто  
не отражают реальной ситуации. Так, например, перечень загрязняющих 
веществ, определяемых в атмосферном воздухе государственными экологическими службами, осуществляющими наблюдения на территории области или края, составляет обычно 25–30, а в водных объектах, имеющих 
рыбохозяйственное значение, – 35–40 наименований. В действительности 
же количество загрязняющих веществ может исчисляться сотнями. Увели
8 

чение числа определяемых загрязняющих веществ, безусловно, позволит 
получить более подробную картину состояния среды, но в то же время потребует увеличения времени пробоотбора, анализа, обработки результатов, 
а значит, стоимости анализа. 
Современные методы химической оценки загрязнения объектов 
окружающей среды имеют ряд существенных недостатков, таких как 
сложная предварительная обработка образца, длительное время обнаружения и др. Но главным является то, что они не показывают потенциальные 
эффекты, оказываемые опасными веществами на живой организм [2; 3]. 
Эту задачу комплексной оценки реакции отдельных живых организмов на 
воздействие различных загрязнителей решают методики биотестирования 
для анализа безопасности различных сред [4; 5].  
Особое место среди методов биотестирования занимают биолюминесцентные, применяемые для проведения первичного интегрального 
анализа объектов окружающей среды и характеризующиеся простотой, 
быстротой выполнения, относительно низкой стоимостью и возможностью проведения исследований в полевых условиях. Биолюминесцентные методы обладают хорошей чувствительностью к разнообразным 
химическим соединениям, характерным для промышленных сбросов, загрязнений почвы, воды, воздуха (тяжелые металлы, фенолы, формальдегид, пестициды и т.д.). Уровень тушения биолюминесценции пропорционален концентрации токсических веществ. Специальная светорегистрирующая аппаратура (био- и хемилюминометры) позволяет измерять интенсивность свечения реагента до и после введения неизвестного токсиканта в образце небольшого объема (0,2–0,5 мл). Время анализа, который можно проводить также и в полевых условиях, обычно не превышает нескольких минут.  
Биолюминесцентные биотесты предпочтительны в качестве первичных тестов для скринингового быстрого ответа на вопрос о том, присутствуют или нет в среде токсические агенты в концентрации, опасной для 
человека и других живых организмов. Если промышленное предприятие 
выбрасывает во внешнюю среду преимущественно один тип токсического 
вещества, ответ биолюминесцентного биотеста позволяет судить о концентрации данного соединения и тогда отпадает необходимость в дополнительных методах анализа [6–10]. 
Высокая скорость, доступность реагентов и простота процедуры анализа определяют еще одно важнейшее преимущество биолюминесцентных 
тестов – возможность проведения большого количества измерений в сопоставимых условиях, что обеспечивает статистическую достоверность анализа. Это свойство выгодно отличает биолюминесцентные тесты от классических биотестов, основанных на многоклеточных организмах.  

9 

Монография посвящена рассмотрению вопросов перспективности использования биолюминесцентных организмов в биотестировании. Для подтверждения актуальности развития этого нового направления в экологическом мониторинге – биолюминесцентных биотестов – в первой главе изучено 
современное состояние и проблемы биологических методов тестирования 
окружающей среды. Несмотря на многообразие биотестов, существуют проблемы при их использовании, которые систематизированы для того, чтобы 
показать необходимость в биолюминесцентных биотестах, так как существует надежда, что именно использование явления «живого свечения» поможет 
решить современные проблемы биотестирования. 
В главе 2 описывается использование свечения грибов в биотестах 
«ждущего типа». На примере грибов показано, каким образом новые,  
недавно обнаруженные светящиеся организмы могут быть использованы  
в качестве тест-объектов в методах биотестирования.  
В главе 3 представлены биотесты с использованием светящихся бактерий, основанные на влиянии химических веществ различной природы  
на люминесценцию бактерий. Рассмотрены особенности биотестов на основе лиофильно высушенных, рекомбинантных и иммобилизованных клеток бактерий. В этой главе приведены многочисленные примеры использования светящихся бактерий в биотестах для экологического мониторинга. 
В настоящее время биотесты на светящихся бактериях широко применяются в экологическом мониторинге и являются самыми быстрыми и чувствительными к широкому классу органических соединений, пестицидов, 
тяжелых металлов и других поллютантов. Однако при всех своих достоинствах они имеют и ряд недостатков. (Впрочем, для справедливости следует 
заметить, что этими недостатками обладают и другие биотесты с использованием в качестве тест-объектов живых организмов.) Выявленные недостатки классических биотестов явились причиной успешной попытки  
использовать в биотестах ферменты вместо живых организмов. Особенно 
перспективной эта идея оказалась для создания нового направления биотестирования – ферментативные биолюминесцентные биотесты. Биолюминесцентным методам, основанным на использовании ферментативных реакций, посвящены три последующие главы монографии. Рассматриваются 
две основные ферментативные системы – светляков и бактерий – и их 
применение в избирательном и интегральном анализе. Особое внимание 
уделяется ферментам светящихся бактерий, которые имеют очевидные 
преимущества для использования в биолюминесцентных биотестах и биосенсорах.  
Глава 4 монографии посвящена построению сигнальной системы 
биолюминесцентных тестов. И тут мы обращаем внимание читателей  
на методологию конструирования новых методов анализа, которые проде
10