ПЦР в реальном времени

8-е издание, электронное

Под редакцией
д-ра биол. наук Д. В. Ребрикова

ПЦР
В РЕАЛЬНОМ
ВРЕМЕНИ

Москва
Лаборатория знаний
2020

УДК 577.21
ББК 28.04

П11

А в т о р ы:
Д. В. Ребриков, Г. А. Саматов, Д. Ю. Трофимов,
П. А. Семёнов, А. М. Савилова, И. А. Кофиади,
Д. Д. Абрамов

Под общей редакцией д. б. н. Д. В. Ребрикова

П11

ПЦР в реальном времени / Д. В. Ребриков, Г. А. Саматов,
Д. Ю. Трофимов
[и др.]
;
под
ред.
д. б. н.
Д. В. Ребрикова. — 8-е
изд.,
электрон. — М.
:
Лаборатория знаний, 2020. — 226 с. — Систем. требования:
Adobe Reader XI ; экран 10". — Загл. с титул. экрана. —
Текст : электронный.
ISBN 978-5-00101-794-3
Рассмотрены
различные
варианты
и
особенности
оборудования
для
проведения
ПЦР
«в
реальном
времени»,
даны рекомендации по выбору амплификатора. Разобраны
особенности
систем
флуоресцентной
регистрации
накопления ДНК. Рассмотрены ключевые факторы, определяющие
выбор
последовательности
олигонуклеотидов
и
параметры
программ амплификации. Уделено внимание подготовке проб
и особенностям анализа получаемых данных, что необходимо
для получения наиболее достоверных результатов. Отдельные
главы посвящены применению ПЦР «в реальном времени»
для решения различных задач: определения уровня представленности транскриптов, вирусной нагрузки, нуклеотидного
полиморфизма,
относительного
содержания
нуклеиновых
кислот на примере ГМО.
Для сотрудников генно-инженерных и медицинских диагностических
лабораторий,
а
также
для
преподавателей
и студентов, специализирующихся в области молекулярной
биологии.
УДК 577.21
ББК 28.04

Деривативное
издание
на
основе
печатного
аналога:
ПЦР в реальном времени / Д. В. Ребриков, Г. А. Саматов,
Д. Ю. Трофимов [и др.] ; под ред. д. б. н. Д. В. Ребрикова. —
7-е изд. — М. : Лаборатория знаний, 2018. — 223 с. : ил. —
ISBN 978-5-00101-085-2.

В
соответствии
со
ст. 1299
и
1301
ГК
РФ
при
устранении
ограничений, установленных техническими средствами защиты
авторских прав, правообладатель вправе требовать от нарушителя
возмещения убытков или выплаты компенсации

ISBN 978-5-00101-794-3
c○ Лаборатория знаний, 2015

2

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие Л. А. Остермана . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

Предисловие Е. Д. Свердлова . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

Список сокращений. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

Перечень компаний, упомянутых в тексте . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

Глава 1. Что такое ПЦР . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.1. Изобретение ПЦР. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.2. Изобретение ПЦР «в реальном времени» . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3. Отличие анализа продуктов ПЦР «по конечной точке»
и «в реальном времени» . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.4. Развитие ПЦР «в реальном времени»
как диагностического инструмента . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

Глава 2. Основы полимеразной цепной реакции . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.1. Общие сведения о ПЦР . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2. Организация ПЦР-лаборатории . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.3. Оборудование и материалы для ПЦР . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.4. Свойства олигонуклеотидов (праймеров и проб) . . . . . . . . . 26
2.5. Влияние ионов Mg2+ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.6. Свободные дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTPs) . . . 29
2.7. Влияние pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.8. Минеральное масло . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.9. Другие компоненты, добавление которых влияет
на ПЦР . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.10. Ферменты, используемые в ПЦР . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.11. Программы амплификации. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.12. «Горячий старт» (hot start) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Глава 3. Оборудование для ПЦР «в реальном времени» . . . . . . . . . . 39

3.1. Устройство детектирующих амплификаторов . . . . . . . . . . . 39
3.2. Основные функциональные узлы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.3. Обзор характерных разновидностей приборов. . . . . . . . . . . 52
3.4. Тенденции развития оборудования для ПЦР
«в реальном времени» . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

Глава 4. Визуализация накопления ДНК при проведении ПЦР
«в реальном времени» . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

4.1. Флуоресценция . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
4.2. Флуорофоры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.3. Гасители флуоресценции. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

4.4. Неспецифичные системы детекции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.5. Специфичные системы детекции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

Глава 5. Дизайн праймеров и проб, программы амплификации . . . 85

5.1. Параметры, влияющие на взаимодействие
олигонуклеотида и ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

5.2. Выбор последовательности проб . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.3. Программное обеспечение для дизайна праймеров
и проб . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

5.4. Особенности систем праймеры–проба. . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
5.5. Особенности программ амплификации для ПЦР
«в реальном времени» . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

Глава 6. Особенности очистки нуклеиновых кислот для ПЦР
«в реальном времени». . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

6.1. Общие принципы очистки нуклеиновых кислот
для использования в ПЦР . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

6.2. Особенности взятия биоматериала для клинических
ПЦР-исследований и риск контаминации. . . . . . . . . . . . . 103

6.3. Особенности методов очистки НК для ПЦР
«в реальном времени» . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

6.4. Типовые ошибки использования ПЦР
«в реальном времени», связанные с количеством
нуклеиновых кислот, забираемых в реакцию . . . . . . . . . . 106

Глава 7. Анализ данных ПЦР «в реальном времени» . . . . . . . . . . . 109

7.1. Методы и средства анализа графиков накопления
ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109

7.2. Простая модель ПЦР . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
7.3. Связь флуоресцентного сигнала и накопления ДНК
в ходе ПЦР . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

7.4. Пороговый метод сравнения графиков накопления
ДНК (Ct) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

7.5. Определение эффективности ПЦР . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
7.6. Недостатки порогового метода и пути их преодоления . . . 122
7.7. Методы прямого сравнения графиков накопления
ДНК (Ср) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129

7.8. Комбинация методов Ct и Cp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134

Глава 8. Определение уровня представленности транскриптов. . . 141

8.1. Организация эксперимента. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141
8.2. Абсолютное определение уровня представленности
транскриптов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

8.3. Относительное определение уровня представленности
транскриптов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 155

8.4. Нормировка данных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 156
8.5. Внутренний контрольный образец . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 160

4
Оглавление

8.6. Отрицательный контрольный образец . . . . . . . . . . . . . . . . 161

Глава 9. Количественное определение вирусной нагрузки . . . . . . . 165

9.1. Количественное определение вирусной нагрузки . . . . . . . 165
9.2. Источники погрешностей и варианты учета потерь
и эффективности реакции . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182

Глава 10. Использование ПЦР «в реальном времени»
для определения однонуклеотидного полиморфизма . . . . . . . . . . . . 188

10.1. Однонуклеотидный полиморфизм
последовательностей ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 188

10.2. Идентификация ОНП с помощью аллель-специфичных
праймеров . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190

10.3. Дифференциация аллелей с помощью
олигонуклеотидных проб . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 196

10.4. Генотипирование ОНП методом плавления
ДНК-дуплексов. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 199

Глава 11. Определение относительного содержания
нуклеиновых кислот на примере генетически
модифицированных источников. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202

11.1. Общие сведения о ГМИ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202
11.2. Классификация существующих методов определения
ГМИ в продуктах питания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202

11.3. Организация чужеродной ДНК в геноме растений . . . . . 205
11.4. Выбор последовательностей-мишеней для выявления
чужеродной ДНК в геноме растения . . . . . . . . . . . . . . . . 205

11.5. Тест-системы для определения процентного содержания
чужеродной ДНК относительно геномной ДНК
растений. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207

11.6. Выбор чужеродной и нормировочной ДНК
для количественного определения ГМИ. . . . . . . . . . . . . . 210

11.7. Калибровочные образцы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211
11.8. Точность метода определения процентного содержания
генетически модифицированных ингредиентов в пище
с помощью метода ПЦР «в реальном времени» . . . . . . . 212

Предметный указатель . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216

Оглавление
5

ПРЕДИСЛОВИЕ Л. А. ОСТЕРМАНА

Развитие большинства современных научных дисциплин
напрямую связано с развитием применяемых исследователями
методов. В последние десятилетия именно новые методические
подходы определяли прорывы в области биохимии и молекулярной генетики. При этом понимание сути используемых методик всегда являлось необходимым условием эффективного
экспериментального подхода. Одним из таких методов, позволивших генетикам и молекулярным биологам сделать сразу несколько огромных шагов вперед, безусловно стало изобретение
метода полимеразной цепной реакции.
Несмотря на то, что принцип ПЦР понятен большинству
школьников после краткого его изложения, этот метод обладает массой нюансов, о существовании которых подозревают далеко не все исследователи, использующие его в повседневной
практике. Так, далеко не каждый экспериментатор учитывает
влияние эффективности ПЦР на результат амплификации.
А между тем данный параметр определяет возможность сравнения результатов для разных реакций. Другой пример типичного «заблуждения» — отождествление накопления ДНК и
накопления флуоресцентного сигнала при проведении ПЦР «в
реальном времени», хотя есть масса примеров из практики,
когда эти процессы идут независимо.
Предлагаемая читателю книга направлена, в первую очередь, на объяснение тонкостей метода полимеразной цепной
реакции с регистрацией результатов в режиме «реального времени». Авторы постарались рассмотреть все нюансы метода,
позволяя читателю разобраться в сути процесса. Работа выстроена по принципу использования метода ПЦР «в реальном
времени» для решения различных задач. При этом авторы постарались сделать так, чтобы исследователь мог обратиться к
каждой отдельной главе, поняв особенности данного варианта
применения метода даже без прочтения всей книги.

Л. А. Остерман

ПРЕДИСЛОВИЕ Е. Д. СВЕРДЛОВА

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) «в реальном времени» — методика, прочно вошедшая в повседневную практику
исследовательских и клинических лабораторий по всему миру.
Спектр задач, для решения которых применяется ПЦР «в реальном времени», увеличивается с каждым днем. Сюда можно
отнести как сферу научных исследований (определение уровня
экспрессии генов, анализ количественного соотношения альтернативно сплайсированных форм мРНК и т. д.), так и сферу
прикладных применений (определение уровня бактериальной
или вирусной нагрузки органа, поиск следов генно-инженерных
конструкций в продуктах питания и т. д.).
Несмотря на то, что число обзоров и монографий (A–Z of
Quantitative PCR; Real-Time PCR (BIOS Advanced Methods)),
посвященных ПЦР «в реальном времени», постоянно растет,
ощущается значительная нехватка подобных работ на русском
языке. Поэтому книга Д. В. Ребрикова с соавторами, являющаяся первой работой такого уровня, посвященной различным аспектам ПЦР «в реальном времени», вне всякого сомнения,
актуальна и с успехом заполнит существующий вакуум соответствующих русскоязычных учебных пособий.
Книга написана коллективом авторов, не просто использующих ПЦР «в реальном времени» в повседневной практике, но
являющихся ведущими в нашей стране разработчиками оборудования и реагентов для ПЦР в «реальном времени». Разностороннее и творческое понимание физической и биологической
составляющих научной основы метода помогло авторам в полной мере осветить особенности ПЦР «в реальном времени» и
дать читателям точную, написанную доступным языком картину процессов, идущих в реакционной пробирке.
По своей структуре и глубине описания этих процессов
книга нацелена, в первую очередь, на сотрудников научно-исследовательских лабораторий и студентов, стремящихся разобраться в фундаментальных принципах и нюансах метода.
Вместе с тем, каждая глава содержит много конкретных практических рекомендаций, делая книгу ценной также для
практикующих специалистов.
Е. Д. Свердлов
Академик РАН и РАСХН, советник РАН

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AMV — вирус миелобластоза птиц
dNTPs — дезоксирибонуклеозидтрифосфаты
DTT — дитиотрейтол
EBV — вирус Эпштейна–Барр
FACS — флуоресцентный клеточный сортировщик
FLASH — флуоресцентная детекция результатов после ПЦР
FRET — флуоресцентно-резонансный перенос энергии
GFP — зеленый флуоресцирующий белок
HBV — вирус гепатита B
HCV — вирус гепатита C
HIV — вирус иммунодефицита человека
HSV — вирус простого герпеса
LCR — лигазная цепная реакция
LNA — линейная нуклеиновая кислота
MGB — связыватель малой бороздки
MMLV — вирус лейкемии мышей Молони
NASBA—основаннаянапоследовательностинуклеиновыхкислотамплификация
pH — водородный показатель
Tm — температура «плавления»
TMA — опосредованная температурой амплификация
БСА — бычий сывороточный альбумин
ВКО — внутренний контрольный образец
ГиФА — гибридизационно-ферментный анализ
ГМ — генетически модифицированный
ГМИ — генетически модифицированный источник
ГМО — генетически модифицированный организм
ДМСО (DMSO) — диметилсульфоксид
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖХВД (HPLC) — жидкостная хроматография высокого давления
ИКП — инвертированный концевой повтор
кДа — килодальтон
кДНК — комплементарная ДНК
КПД — коэффициент полезного действия
мкМ — микромоль
мМ — миллимоль
мРНК — матричная РНК
НК — нуклеиновая кислота
ОЕ — оптическая единица
ОНП — однонуклеотидный полиморфизм
ОТ — обратная транскрипция
ОТ-ПЦР — обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция
п. н. — пара нуклеотидов
ПААГ (PAGE) — электрофорез в полиакриламидном геле
ПЗС — прибор с зарядовой связью
ПЦР — полимеразная цепная реакция
рекДНК — рекомбинантная ДНК
РНК — рибонуклеиновая кислота
рРНК — рибосомальная РНК
т. п. н. — тысяча пар нуклеотидов
ТЭ — термоэлектронный
УФ — ультрафиолет
ФЭУ — фотоэлектронный умножитель
ЭДТА — этилендиаминтетраацетат

ПЕРЕЧЕНЬ КОМПАНИЙ,
УПОМЯНУТЫХ В ТЕКСТЕ

Agilent Teсhnologies

Ambion

Applied Biosystems

Bayer Diagnostics

Bio-Rad

Cepheid

Corbett Research

Digene Diagnostics

DNASTAR

Gen-Probe Inc.

Hasting Software

Idaho

Molecular Biology Insights

Organon Teknika

QIAGEN

Roche

Stratagene

НПФ ДНК-Технология

ГЛАВА 1

ЧТО ТАКОЕ ПЦР

1.1. ИЗОБРЕТЕНИЕ ПЦР

В последние годы все больше молекулярно-биологических
методов находят практическое применение в различных областях медицины, промышленности и сельского хозяйства. Один
из таких методов — полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая нарабатывать в пробирке определенный участок молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) практически
в неограниченных количествах.
В медицине ПЦР применяют при диагностике инфекционных и наследственных заболеваний, при диагностике рака и
иммунных патологий. ПЦР используют для идентификации
личности и определения биологического родства индивидов.
Санитарно-эпидемиологические службы используют ПЦР для
контроля за микробиологическим загрязнением окружающей
среды и продуктов питания, а также для выявления генетически модифицированных источников пищи (ГМИ). В научноисследовательских лабораториях ПЦР используют для изучения нуклеиновых кислот и проведения манипуляций с ними.
Например, благодаря ПЦР стало возможным быстрое получение исследуемых участков ДНК в чистом виде и в достаточном
количестве.
Открытие полимеразной цепной реакции стало одним из
наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять данную
область науки на качественно новый уровень. Внедрение полимеразной цепной реакции в медицину открыло новое диагностическое направление — ДНК-диагностику.
Основные принципы полимеразной реакции и состав реакционной смеси для получения копий ДНК впервые были описаны Kleppe с соавт. в 1971 году [Kleppe et al, 1971]. Однако
исследователями не была продемонстрирована главная черта
ПЦР — экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК.