Аналитическая биохимия: монография: в 3 т. Т. 3

Н.Н. Мушкамбаров



АНАЛИТИЧЕСКАЯ БИОХИМИЯ

В трех томах

Том 3

Монография

3-е издание, стереотипное





Москва Издательство «ФЛИНТА» 2020

УДК 577.01
ББК 28.072 М93





    Мушкамбаров Н.Н.
М93 Аналитическая биохимия [Электронный ресурс] : монография : в 3 т. / Н.Н. Мушкамбаров. — 3-е изд., стер. — М. : ФЛИНТА, 2020. — 512 с. — Т. 3. — 512 с.

    ISBN 978-5-9765-2293-0

          В книге представлен оригинальный, разработанный автором, курс. Он содержит те же, что классическая биохимия, разделы: «Белки», «Ферменты», «Сложные белкосодержащие структуры», «Нуклеиновые кислоты и синтез белков», «Молекулярно-клеточная биология», «Метаболизм». Но все эти проблемы рассматриваются с позиций математической логики, а также с использованием методов биофизической химии и биофизики. Таким образом, основное содержание книги — это детальный математический анализ (в основном, на достаточно простом уровне) биохимических объектов и явлений. При этом многие формулы и почти все количественные оценки получены самим автором.
          Книга адресована студентам (медикам и биологам), готовящимся к научной работе, а также аспирантам, стажерам и всем, кому необходимо научиться анализировать сведения о молекулярной организации жизни.
УДК 577.01
ББК 28.072





ISBN 978-5-9765-2293-0

       © Мушкамбаров Н.Н., 2015
© Издательство «ФЛИНТА», 2015

- 801 -

    Раздел V. НЕКОТОРЫЕ ПРОБЛЕМЫ МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИЯ



     В этом разделе мы рассмотрим следующие проблемы:
      а)  дифференцировку клеток.
      б) вирусную инфекцию клеток животных,
      в)        искусственное изменение клеточного генома (генную инженерию)

Глава 21. Дифференцировка клеток. Эритропоэз и сперматогенез

21.1. Общие вопросы дифференцировки

21.1.1.  Введение
     а)       Как известно, дифференцировка - это процесс, который приводит к образованию
       А. вначале из зиготы стволовых клеток того или иного типа.
       Б. а затем из последних - зрелых дифференцированных клеток соответствующего вида (эритроцитов, мышечных клеток или волокон, нейронов и т. д.).
     б)       А. Основа дифференцировки - изменение спектра Функционирующих в клетке генов.
        Б. Это приводит к изменению белкового состава клетки, что. в конечном счете, сказывается на всех прочих характеристиках ее структуры и функции.

     в)       А. Чаще всего спектр активных генов меняется путём "выключения" одних и "включения" других генов.
        Б. В таких случаях генбм дифференцированной клетки не отличается от генома зиготы.
        В. Способы "включения" и "'выключения" генов указывались в п. 20.1.3:
          I.  переход эухроматина в гетерохроматин и обратно,
         II.           избирательное блокирование и деблокирование отдельных генов (по принципу оперонной регуляции),
        III. метилирование или деметилирование ДНК.

- 802 -

     г)      А. Реже меняется сам состав генома, т. е. количество в ядре тех или иных генов.
        Б. Одним из способов такого изменения является транспозиция. т.е. перемещение отдельных фрагментов ДНК в геноме с образованием новых генов.
    Видимо, этот механизм используется при развитии иммунных клеток (глава 22).
        В. Другие способы изменения генома.            I.              АмплиДмкация. т.е. многократное удвоение какого-либо гена. В частности, так резко увеличивается число генов рРНК в созревающих ооцитах лягушки.
           II.            Леминуация. т.е. потеря отдельных хромосом. Это явление встречается в соматических клетках аскарид.

    д)      А. Почти в любом случае дифференцировка - это длительный, многостадийный процесс.
        Б. А механизмы, обеспечивающие чередование стадий, как правило, основаны на принципе саморазвития.
   Это означает, что переход клетки в очередное промежуточное состояние служит сигналом для начала следующей стадии созревания - и так далее, до полного завершения дифференцировки.

21.1.2.Число генов, затрагиваемых дифференцировкой
     Оценим среднее количество генов, которые определяют "лицо" дифференцированной клетки. При этом здесь (и далее в этой главе) будем считать', что спектр активных генов меняется путем их "включения" и "выключения".
    а)  Другие исходные посылки таковы.- чвя
        А. Всего в гаплоидном геноме человека - п,.еН » 300.000 генов (16.85.6),
    а -число различных видов дифференцированных клеток -     » 200
(это, правда, весьма грубая оценка).
       Б. В каждой же такой клетке функционирует
           I.           некоторое среднее число (я) неспецифических генов (которые активны в клетках практически всех видов) и
          II.          некоторое среднее число (у) специфических генов, активных в клетках только одного вида.
    Последний тезис - это, конечно, сильное упрощение, но примем


его.

-

    б)      А. Тогда можно составить элементарную систему двух уравнений:

        £ахт’^ген = ® ⁺ У '■ »С”»П„-у + X (21.1,а-б),

где text " средняя доля активных генов в клетке (от общего числа генов).
       Б. Здесь первое уравнение подводит баланс активных генов, а второе - баланс общего числа генов в гаплоидом геноме.
    в)     А. Возьмём три достаточно вероятные значения taxi (0.1: 0,2 и 0,3) и решим систему уравнений для каждого из них. Результаты сведены в таблице. -
        Табл. 21.1               Б. Как видно, во всех случаях у.

^акт   X        У
0,3  -88950 -1055
0,2  -58800 -1200
0,1  -28640 -1360

т.е. число специфических генов, активных в клетке, составляет лишь несколько сотен.
    г)     А. Правда, по мере снижения («кт величина у увеличивается. Но до какого предела ?
    Б. Максимума у достигает, разумеется, не при <ₑKₜ = 0 (тогда система (21.1) потеряла бы биологический смысл).

а тогда, когда все гены являются специфическими, т. е. при х • 0.
        В. Из уравнения (21.1,6) для этой ситуации получаем:


Утах ~ 15.0Q


(21.2).

        Г. И хотя такая ситуация тоже маловероятна (в этом случае доля активных генов, согласно (21.1,а), равнялась бы всего

            mln         чел
taxi ~ Утах/^ген ⁼          ⁼ 0.005 = 0,5 X (21.3),


здесь тоже у лишь ненамного больше тех оценок, что получены для более реальных значений taxi (табл. 21.1).


        Д. Таким образом, все особенности дифференцированной клетки, действительно, определятся активностью примерно тысячи генов.

- 804 -

д) А. Итак, у варьирует в пределах от юоо до 1500 генов.
        Б. Будем считать зиготу тоже особенным видом клеток, в котором имеются свои специфические гены.
        В. Тогда при переходе от зиготы к специализированной клетке необходимо "выключить" -1000 одних и "включить" примерно столько же других генов, что составляет вместе

(21.5)
ДНК

чел
1лк» • 2 У/Пг.и - QJLS              (21.4)
от общего числа генов.
        Г. Таковы, по нашим оценкам, генетические масштабы дифференцировки.
21.1.3 ⁽,⁾ Формулировка принципа саморазвития
     а)     А. Теперь попробуем представить простейшую модель, которая бы иллюстрировала ключевой для дифференцировки принцип саморазвития.
        Б. В качестве таковой можно принять схему (21.5).
В. На ней не указан фактор, запускающий транскрипцию гена 1, но показано, что продукт деятельности этого гена (белок Рг,) активирует ген 2; белок Prₜ активирует следующий ген и т.д.
     б)     А. Тогда получаем систему "зацепляющихся" дифференциальных уравнений:


ген 1 ген 2 ген 3

I ®/1 ®/1 mPHKj / мРНКг I мРНКз

  d [RNAJ/dt = Гни*., -

                          d [Prₜ]/dt = kfT'i-lRNAiJ -

    для 1)2                                               (21.6,

  d [RNAjl/dt - Vo*, j Дак», i ~ ^rma. i '[RHAi];

                          d [Prₜ]/dt - kpr.i-fRWAJ - kfr.i-H’rJ

-805 -

       Б. Здесь каждая пара уравнений описывает изменение со временем концентраций mFHKj и Prₜ.
       В. "Зацепление" же обусловлено наличием в уравнениях для [MPHKₜ] (при I > 2) множителя Дакт.1 - относительной активности 1-птоао гена, которая, согласно схеме (21.5), зависит от концентрации (1-1)-го белка.
    в)      А. Сама эта зависимость может быть различной, например, гиперболической:
fPTj.J
П.жт.1 - ------------------ (21.7).
«1-1 ⁺ IPrt-i]


       Б. Но наиболее отчётливо идея "включения" и "выключения"

генов проявляется в триггерном варианте зависимости:

             ( ° при (Ptl-J  < ^^1-1 m 1 п
Лакт,1   ~ 1 1 1 при [Рг,.,] >     -1 ^mln

(21.8, а-б).

    В нём предусматривается, что активность t-того гена меняется в ответ на повышение концентрации (1-1)-го белка скачкообразно: она практически отсутствует при концентрациях ниже порогового уровня
      и сразу становится максимальной, когда [Рг^] достигает этого уровня.
   г)     Сделаем ешё три замечания относительно системы (21.6).-А. По аналогии с (20.64; 20,65), её постоянные параметры определяются формулами:



VRNA, 1 (tRHA¹/c) “                     Крг. 1 ⁼ taut. 1 ‘I'pd/A^MPHK. 1
(21 .9. a-6).
Для разных генов (разных t) эта параметры могут различаться, но могут и совпадать.
       Б. Далее: в системе (21.6) положено, что скорости распада мРНКг и Prₜ (вторые члены уравнений) пропорциональны концентрациям тех же веществ - соответственно, mPHKj и Prₜ. Т.е. гипотеза В. Арбузова (пп. 20.3.4 -20.3.5) здесь не учитывалась.
       В. Наконец, под [ММ}] и [Prₜ ] надо иметь в виду концент

-806рации. относящиеся к объему всей клетки (а не только ядра или цитоплазмы) .
    Поэтому иногда удобней составлять аналогичные уравнения для количества молекул MPHKi и Prₜ в клетке.

21.1.4. *•’ Кинетика накопления в клетке t-того белка
    Исследуем дальше систему (21.6), предполагая триггерный вариант (21.8) включения генов.
   а)     А. Пусть в момент t ■ 0 происходит "включение" l-того гена. Б. Установим, как будут меняться со временем [RMAj] и [PrJ. для которых мы введем обозначения:

[HNAJ ■ х. (PrJ ■ у                  (21.10.a-б).

    Иными словами, найдем в явном виде зависимости x(t) и y(t).
      В. Заметим: под х следует понимать количество функционально активной MPHKi (а не общие запасы этой мРНК).

   б)     А. Согласно (21.8,6). в момейт t=0 коэффициент 1ЦЖТг1 для 1-того гена превращается из 0 в 1, и система (21.6,в-г) приобретает следующий вид:


                   О                       ♦
          dx/dt_- vₓ - k*-x; dy/dt = ky-x - ky-y


(21.11. a-6).

   Индекс t здесь, как и далее, опущен, а в других индексах от обозначений "RNA" и "Рг" тоже перешли к "х" и "у".
      Б. Исходя из формулировки задачи, оба начальные условия -нулевые:
при t-О х₀ - 0 , у₀ - 0               (21.12,а-б).

    в)      Применяя уже не раз использованный нами метод (пп.9.2.2 -9.2.5), находим:
         А. стационарные концентрации мРНК и белка -

X -        ; Y - х-ку/ку

(21.13.а-б),

Б. характеристическое уравнение и его корни -

-807X² + V(kj + ку) + £ ку - °'         °,,ty'a ki = " Х₂ - -
(21. 14.а-в).

В. коэффициенты при экспонентах (по ф-лам (9.25,а-г), но с учётом того, что система (21.11) - неоднородная) и, наконец, окончательный вид решения (промежуточные процеду     (Заметим, что здесь можно было бы - и это оказалось бы проще - использовать другой метод: решать уравнения по отдельности; см. п. 22.3.4).

     г)     А. Первая формула описывает динамику накопления мРНК₁. Как видно, это обычная гипербола, стремящаяся со временем к стационарной концентрации mPHKj (21.16,а).
        Б. Вторая формула относится к белку (Pri). Здесь получаем S-об-разную кривую, которая тоже стремится к стационарному уровню (21.16,6).

     д)     А. Дифференцируя эту формулу, находим скорость накопления белка:



             кх ‘ку dy/dt = —------           ку _ ку


   ' -Ку • t -ку • V У- е - е

(21 .17. а).
Она положительна как при ку > к*.

-808так и при ку < к, . Б. Данная функция имеет колоколообразный вид (21.17,6): из условия d²y/dt² = 0 можно найти момент достижения максимальной
скорости:
J ‘------------ш к" Л"                  (21.18).
пах -        - ух
к — к у х
    Сама же максимальная скорость равна _ 1нх max dy/dt = У-kZ-d , зЭе а ■ к^/Ъ <21.19. а-б)

    е)      А. Во всех полученных формулах фигурируют константы распада мРНК (к^ ) и белка (ку* ).
       Б. Можно убедиться, что увеличение любой из них снижает
   I. предельную концентрацию синтезируемого белка - Y (21.13,6)
  II. и максимальную скорость его накопления - max dy/dt (21.19).


    ж)      А. Наконец, заметим: во всех этих формулах мы должны считать, что к*~ х kf .
   А что будет при равенстве данных констант ?
       Б. В этом случае в формуле зависимости y(t) (21.15,6) сумма двух последних членов превращается в неопределенность вида 0/0.
       В. Чтобы разрешить её, будем считать одну из констант (напр., kf ) переменной величиной и воспользуемся правилом Лопи-таля:

11m у к**-* к” х у

   11m Y
к* к" х у

(21 .20).

------ (к d к у
    х

Г. Это приводит к следующим формулам: при к* * ку = к

у = У- 1 - е

-к • t
> -а + к -t)

             _ 2 -kt dy/dt = Y-(к ) t-e

(21 .21. a-6).

Д. Они описываются такими же кривыми (21.16,6;

21.17.6),