Известия Тульского государственного университета. Естественные науки, 2019, № 2
научный журнал
Покупка
Тематика:
Общая биология
Издательство:
Тульский государственный университет
Год издания: 2019
Кол-во страниц: 50
Дополнительно
Тематика:
ББК:
- 201: Человек и окружающая среда. Экология человека. Экология в целом. Охрана природы
- 24: Химические науки
- 28: Биологические науки
УДК:
- 54: Химия. Кристаллография. Минералогия. Минераловедение
- 57: Биологические науки
- 574: Общая экология. Биоценология. Гидробиология. Биогеография
ГРНТИ:
Скопировать запись
Фрагмент текстового слоя документа размещен для индексирующих роботов.
Для полноценной работы с документом, пожалуйста, перейдите в
ридер.
Министерство науки и высшего образования Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Тульский государственный университет» 16+ ISSN 2071-6176 ИЗВЕСТИЯ ТУЛЬСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ Выпуск 2 Тула Издательство ТулГУ 2019
Известия ТулГУ. Естественные науки. 2019. Вып. 2 2 РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ: ISSN 2071-6176 Председатель Грязев М.В., д-р техн. наук, проф., ректор Тульского государственного университета. Заместитель председателя Воротилин М.С., д-р техн. наук, проф., проректор по научной работе. Ответственный секретарь Фомичева О.А., канд. техн. наук, доц., начальник Управления научно-исследовательских работ. Главный редактор Прейс В.В., д-р техн. наук, проф., заведующий кафедрой. Члены редакционного совета: Батанина И.А., д-р полит. наук, проф., – отв. редактор серии «Гуманитарные науки»; Берестнев М.А., канд. юрид. наук, доц., – отв. редактор серии «Экономические и юридические науки». Часть 2. «Юридические науки»; Борискин О.И., д-р техн. наук, проф., – отв. редактор серии «Технические науки»; Егоров В.Н., канд. пед. наук, доц., – отв. редактор серии «Физическая культура. Спорт»; Заславская О.В., д-р пед. наук, проф., – отв. редактор серии «Педагогика»; Качурин Н.М., д-р техн. наук, проф., – отв. редактор серии «Науки о Земле»; Понаморева О.Н., д-р хим. наук, доц., – отв. редактор серии «Естественные науки»; Сабинина А.Л., д-р экон. наук, доц., – отв. редактор серии «Экономические и юридические науки». Часть 1. «Экономические науки». РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ: Ответственный редактор Понаморева О.Н., д-р хим. наук (ТулГУ, г. Тула). Заместитель ответственного редактора Горячева А.А., канд. хим. наук (ТулГУ, г. Тула). Ответственный секретарь Блохин И.В., канд. хим. наук (Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого, г. Тула). Члены редакционной коллегии: Алфёров В.А., канд. хим. наук (ТулГУ, г. Тула); Атрощенко Ю.М., д-р хим. наук (Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого, г. Тула); Иванищев В.В., д-р биол. наук (Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого, г. Тула); Каримов М.Б., д-р хим. наук (Дангаринский государственный университет, г. Дангара, Таджикистан); Кизим Н.Ф., д-р хим. наук (Российский химикотехнологический университет имени Д.И. Менделеева, г. Новомосковск); Ким Ю.А., д-р физ-мат. наук (Институт биофизики клетки РАН, г. Пущино); Короткова А.А., д-р биол. наук (Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого, г. Тула); Матвейко Н.П., д-р хим. наук (Белорусский государственный экономический университет, г. Минск, Республика Беларусь); Музафаров Е.Н., д-р биол. наук (ТулГУ, г. Тула), Решетилов А.Н., д-р хим. наук (Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина, г. Пущино); Шахкельдян И.В., д-р хим. наук (Тульский государственный педагогический университет им. Л.Н. Толстого, г. Тула). Сборник зарегистрирован в Федеральной службе по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор). ПИ № ФС77-61106 от 19 марта 2015 г. Подписной индекс сборника 27845 по Объединённому каталогу «Пресса России». © Авторы научных статей, 2019 © Издательство ТулГУ, 2019
Химические науки 3 ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ УДК 543.4 ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ МИКРОКАПСУЛЫ С ИНКАПСУЛИРОВАННОЙ УРЕАЗОЙ: ИЗМЕРЕНИЕ pH СРЕДЫ ГИДРОФОБНЫМ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ ЗОНДОМ Е.А. Ягольник, М.Г. Фомкина, Е.А. Замятина, Н.О. Аппазов, С.Ж. Ибадуллаева, Ю.А. Ким Показана возможность определения рН среды по флуоресценции гидрофобного зонда N-((4-(6-phenyl-1,3,5-hexatrienyl)propyl)trimethylammonium p-toluenesuifonate (TMA-DPH), включенного в полиэлектролитные микрокапсулы, а для исследования характеристики микрокапсулы и визуализации ее оболочки из полиэлектролитов на флуоресцентном микроскопе применен зонд амфифильной природы мероцианин 540 (М540). Полиэлектролитные микрокапсулы, толщина оболочки которых была приблизительно 400 нм (для капсул с числом слоев 6), получали методом поочередной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов полистиролсульфоната (ПСС) и полиаллиламина (ПАА) на частицы СаСОз или биоминеральные ядра СаСОз/белок. Ключевые слова: биосенсор, pH, полиэлектролитные микрокапсулы, флуоресцентные зонды. Введение Показатель pH – это важнейший параметр многих химических и биологических процессов, протекающих в природе и в живых организмах, в клиническом анализе, контроле качества продуктов и т.д., для измерения которого используются различные сенсорные устройства. Наряду с традиционными методами измерения pH среды с помощью химических индикаторов и амперометрических или потенциометрических устройств, в которых используется стеклянный электрод, для определенных задач разработаны и ведутся исследования по разработке новых устройств и методов определения этой величины. Так при анализе объектов окружающей среды применяются оптические волноводы, позволяющие локально детектировать сигнал с высоким разрешением, а сенсорные микропланшеты дают возможность одновременного скриннинга большого числа образцов. Для детектирования пространственного распределения pH в образце разработаны планарные сенсорные мембраны. Значительный исследовательский интерес сосредоточен на разработке химических или биологических датчиков с использованием функциональных полимеров [1] и, конкретно, методов, используемых для рН измерений [2]. Измерение уровней pH основаны на полимерных материалах [3] к которым относятся покрытые полимером волоконно-оптические датчики, устройства с
Известия ТулГУ. Естественные науки. 2019. Вып. 2 4 электродами, модифицированными pH-чувствительными полимерами, флуоресцентными индикаторами pH, потенциометрические датчики pH. Поверхность с биоэлементом, которая взаимодействует с анализируемым объектом, формируются путем прямого включения индикатора в матрицу или предварительным включением его в микро- или наночастицы с последующим включением в матрицу [4-6 ]. При создании рН-сенсоров в качестве индикаторов, наиболее чаще используются феноловый красный, бромтимоловый синий (БТС), производные флуоресцеина, гидроксикумарины и др. [7, 8]. У большинства оптических датчиков узкий динамический диапазон измерения pH и сигнал зависит от ионной силы образца [9, 10]. Этот недостаток преодолен применением липофильного эфира флуоресцеина, несущие один отрицательный заряд, которые были встроены в незаряженный, проницаемый для протонов гидрогель [11]. В результате был получен оптический датчик pH с динамическим диапазоном pH от 4,5 до 8. Оптические датчики pH, основанные на измерении фотолюминесценции обладают большими достоинствами применительно в биотехнологии и биомедицине [12]. Основная концепция оптических методов измерения pH опирается на тот факт, что падающий луч света проходит через световод к активному концу датчика, где он взаимодействует с химическим веществом индикатора, который изменяет интенсивность пучка обычно путем поглощения или флуоресценции [13]. Примеры оптического метода измерения pH в физиологических образцах описаны в работах [14, 15]. Большой интерес представляет капсулирование биологического материала, в том числе фотометрических и люминесцентных органических реагентов в полиэлектролитные микрокапсулы, которые были впервые получены [16, 17] путем удаления коллоидной частицы (ядра), покрытой полиэлектролитной оболочкой. Технология позволяла получать микрокапсулы определенной формы и размера, зависящих от используемых матриц-ядер, причем оболочка микрокапсул обеспечивала требуемые каталитические или аффинные свойства, стабильность, проницаемость, совместимость и регулирование высвобождения внутреннего материала капсулы. Материалы и методы В настоящей работе мы исследовали возможность измерения рН среды по флуоресценции гидрофобного зонда N-((4-(6-phenyl-1,3,5hexatrienyl)propyl)trimethylammonium p–toluenesuifonate (TMA-DPH), включенного в оболочки полиэлектролитныхе микрокапсул. Молекулы зонда TMA-DPH при введении в среду с полиэлектролитными микрокапсулами из полистиролсльфоната (ПСС) и полалиламина (ПАА)
Химические науки 5 спонтанно включались в слои оболочек. При взаимодействии с интактными покоящимися клетками в водной суспензии молекулы зонда TMA-DPH включаются в мембраны согласно закону распределения, т. е. количество включенного зонда пропорционально доступной поверхности мембраны [18]. Катионное производное дифенилгексатриена-TMA-DPH используют в качестве флуоресцентного зонда для исследования полярной области мембран [19]. Рабочая концентрация флуоресцентного зонда TMA-DPH (Molecular probes) составляла 2,0 × 10-6 М. Флуоресцентные измерения проводились на спектрофлуориметре Perkin Elmer MPF-44B при комнатной температуре и постоянном перемешивании раствора. Длины волн возбуждения и флуоресценции 350 и 430 нм соответственно. Мероцианин 540 (М540) нами был использован для исследования характеристики микрокапсулы и визуализации ее оболочки из полиэлектролитов на флуоресцентном микроскопе. Это гетероциклический хромофор с локальным отрицательным зарядом, интенсивность флуоресценции которого зависит от количества молекул, связавшихся с мембранами клеток, мембранного потенциала и ориентации молекул зонда относительно фосфолипидных молекул. В связи с этим его используют часто для тестирования упаковки фосфолипидных молекул во внешнем листке мембраны. [20]. Спектральные свойства зонда зависят от свойств микроокружения: в гидрофобном микроокружении зонд существует в виде мономеров, полярное микроокружение вызывает ассоциацию молекул зонда, причем флуоресцируют только мономеры зонда [21]. При введении молекул зонда в среду измерения, содержащую полиэлектролитные микрокапсулы, появляется флуоресценция. Визуализация микрокапсул с иммобилизованными молекулами красителя была выполнена на конфокальном лазерном микроскопе LSM 510 NLO (Carl Zeiss). В качестве источника возбуждения использовали лазеры Argon 2 (длина волны 477 нм) и HeNe 1 (длина волны 543 нм). Обработка изображений производилось с помощью программы LSM 510 и Lucida Analyse 5. Полиэлектролитные микрокапсулы получали методом поочередной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов полистиролсульфоната (ПСС) и полиаллиламина (ПАА) на частицы СаСО3 или биоминеральные ядра СаСО3/белок. Полученные по стандартной методике [22] микрочастицы карбоната кальция имели сферическую форму и размер 3–6 мкм. После формирования определенного числа полиэлектролитных слоев минеральную составляющую ядер удаляли раствором этилендиаминтетраацетата (ЭДТА), рН=7,4.
Известия ТулГУ. Естественные науки. 2019. Вып. 2 6 Результаты и обсуждение Включение флуоресцентных молекул в полиэлектролитные микрокапсулы можно производить непосредственно внесением раствора красителя в водную суспензию капсул или предварительно на стадии формирования оболочки. Другим способом является использование их конъюгатов с высокомолекулярными веществами (белками, полимерами) для формирования ядер путем совместной копреципитации с неорганическими компонентами и последующей процедурой формирования полиэлектролитной оболочки. Функционирование полиэлектролитной микрокапсулы в качестве сенсора возможно благодаря полупроницаемости ее мембраны: она проницаема для низкомолекулярных веществ и непроницаема для высокомолекулярных. Загрузка капсул флуоресцентными индикаторами, чувствительными к определенным ионам и молекулам, ведет к созданию хемосенсоров, а их комбинация с биологическими компонентами, например ферментами, - биосенсоров. Таким образом, на основе полиэлектролитных микрокапсул возможно конструировать биосенсоры для определения различных метаболитов. Эксперименты по подбору флуоресцентного зонда показали возможность использования зондов амфифильной природы, к числу которых относится мероцианин 540. Зонд включается в полиэлектролитные микрокапсулы в результате не ковалентных взаимодействий: гидрофобных и электростатических, флуоресцирует в гидрофобном окружении и был использован для исследования характеристик полых полиэлектролитных микрокапсул ПСС и ПАА [23] на флуоресцентном микроскопе (рис. 1, а), а TMA-DPH для регистрации изменения рН в растворе с микрокапсулами, содержащими уреазу, при действии мочевины. В воде М540 флуоресцирует очень слабо, а при включении в микрокапсулы интенсивность его резко возрастает. На рис. 1 представлена микрофотография микрокапсулы с числом слоев 6 и распределение интенсивности флуоресценции молекул зонда по сечению микрокапсулы на глубине 2 мк. Оценка толщины оболочки микрокапсулы по окрашиванию зондом М540 дало величину приблизительно 400 нм для капсул с числом слоев 6. Как показали эксперименты, после введения М540 в водную среду с микрокапсулами интенсивность флуоресценции увеличивалась с течением времени и достигала некоторого равновесного состояния (рис. 2, б). С увеличением числа полиэлектролитных слоев в капсуле наблюдался рост интенсивности флуоресценции зонда.
Химические науки 7 а 0 2 4 6 8 0 20 40 60 80 100 120 140 florescence intensity, relative units б Рис. 1. а - Микрофотография микрокапсулы с числом слоев 6, меченых мероцианином 540, б - Распределение интенсивности флуоресценции молекул зонда по сечению микрокапсулы на глубине 2 мк 560 580 600 620 640 66 0 20 40 60 80 100 florescence intensity, relative units wavelength, nm а 0 200 400 600 800 1000 1200 0 10 20 30 40 50 b florescence intensity, relative units sec a б Рис. 2. а - Спектр флуоресценции мероцианина 540 (10-8 М) в полиэлектролитных микрокапсулах из ПСС и ПАА с числом слоев 9. Длина волны возбуждения 540 нм; б - Кинетика включения флуоресцентного зонда мероцианин 540 в полиэлектролитные микрокапсулы (а – микрокапсула с числом слоев 9, b – микрокапсула с числом слоев 6). Стрелкой указан момент введения зонда. Длина волны возбуждения 540 нм, флуоресценции - 580 нм На экспериментальных кривых можно выделить два участка: быстрая стадия (t < с) и медленный этап взаимодействия, длящийся десятки и сотни секунд (рис. 2, б). Существование двух столь разных процессов обусловлено особенностями строения микрокапсул. Быстрая фаза, возможно, отражает процесс связывания флуоресцентной метки с однонитевыми комплементарно несвязанными участками полиэлектролитов, а медленная – процесс диффузии молекул зонда в глубь оболочки капсул, разрушения комплементарно связанных комплексов из
Известия ТулГУ. Естественные науки. 2019. Вып. 2 8 поликатионов и полианионов и связывание М540 преимущественно с расплетенными полиэлектролитными нитями [23]. По результатам флуоресцентных исследований и анализа микрофотографий мы предположили, что оболочки полиэлектролитной микрокапсулы состоят в основном из интерполиэлектролитных комплексов и имеют на своей поверхности участки молекул полиэлектролитов, несвязанные комплементарно с противоположно заряженными полиэлектролитными нитями. Увеличение интенсивности флуоресценции зонда с увеличением числа слоев в оболочке микрокапсулы связано с ростом числа мест связывания. Встраивание зонда в оболочку микрокапсул дает возможность для их изучения на флуоресцентном микроскопе (рис. 1). Связывание молекул зонда с микрокапсулами происходит с положительно заряженными нескомпенсированными фрагментами ПАА на поверхности микрокапсул и с гидрофобными участками полиэлектролитных ее структур. Аналогичным образом, возможно, включаются в полиэлектролитные микрокапсулы заряженные гидрофобные красители. Флуоресцентный гидрофобный зонд TMA-DPH, включенный в полиэлектролитные микрокапсулы, был использован для регистрации изменения pH среды. В водной среде с полиэлектролитными микрокапсулами при рН ниже 5,0-5,1 введение зонда TMA-DPH в используемой концентрации не приводило к его свечению, т.е. молекулы зонда не включались в полиэлектролитные комплексы. При изменении рН раствора выше указанных значений появлялась флуоресценция (рис. 3, а), интенсивность которого увеличивалось с ростом значений рН (рис. 3, б). Эту особенность в поведении молекул зонда мы использовали для регистрации изменения рН среды в результате реакции мочевины с уреазой, инкапсулированной в полиэлектролитные микрокапсулы. На рис. 3 б представлена кинетика роста интенсивности флуоресценции зонда в водной среде с полиэлектролитными микрокапсулами, в которые инкапсулированы молекулы уреазы, после добавления мочевины различной концентрации. Молекулы уреазы вступают в реакцию с мочевиной, в результате которой происходит защелачивание среды инкубации. Последнее приводит, по-видимому, к встраиванию молекул зонда в гидрофобные области полиэлектролитных микрокапсул, в результате которой наблюдается увеличение интенсивности флуоресценции.
Химические науки 9 350 400 450 500 550 600 650 5 10 15 20 25 30 35 40 florescence intensity, relative units wavelength, nm а 0 100 200 300 400 500 600 0 20 40 60 80 100 florescence intensity, relative units sec 1 2 3 б Рис. 3. а - Спектр флуоресценции TMA-DPH (2,0 × 10 -6 М) в водном растворе полиэлектролитных микрокапсул (5,0 × 10 6 , 7 слоев), содержащих уреазу. рН раствора 8,0, длина волны возбуждения 350 нм; б - Кинетика включения флуоресцентного зонда ТМА-DPH в полиэлектролитные микрокапсулы с числом слоев 7 при рН 5,7 (3), рН 8,5 (1) и рН 7,2 (2) .Стрелками указаны моменты введения микрокапсул и зонда соответственно. Длина волны возбуждения 350 нм, флуоресценции - 430 нм Как видно из рис. 3, б, кинетические кривые роста интенсивности флуоресценции при взаимодействии с микрокапсулами состоят в основном из двух частей – быстрой фазы роста флуоресценции и медленной. На рис. 4, а представлена кривая зависимость начальной скорости роста интенсивности флуоресценции от концентрации мочевины. Для определения зависимости интенсивности флуоресценции TMADPH в водном растворе с микрокапсулами от величины pH среды, значение рН раствора изменяли введением соответствующего количества NaOH из 0,01М и регистрировали флуоресценцию. Одновременно на рНметре регистрировали значение рН раствора при тех же количествах NaOH. Затем амплитуду сигнала флуоресценции соотносили к кинетическим кривым на 30-35-й минуте. Как следует из приведенного рис. 5, регистрация изменения pH раствора с помощью флуоресцентных зондов аналогична традиционному способу с помощью стеклянного электрода. Можно предположить, что такой способ может быть использован после усовершенствования метода, например, для определения pH с помощью одной сенсорной капсулы.
Известия ТулГУ. Естественные науки. 2019. Вып. 2 10 0,01 0,1 1 10 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 Initial Rates Urea, mM а 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 0,1 1 10 C, mM pH б Рис. 4. а - Зависимость начальной скорости роста интенсивности флуоресценции от концентрации мочевины; б - Значения рН раствора через 30-35 мин после добавления мочевины различной концентрации в образец с полиэлектролитными микрокапсулами (ПСС-ПА, 7 слоев, 5,0 × 106) с включенными молекулами уреазы (зависимость построена по величине интенсивности флуоресценции зонда на 30-35-й мин после добавления мочевины) в полулогарифмическом масштабе 0 10 20 30 40 50 60 5,4 5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 pH min Urea, 1mM а 0 10 20 30 40 50 60 10,5 11,0 11,5 12,0 12,5 13,0 13,5 14,0 14,5 15,0 1mM Urea fluorescence intencity min б Рис. 5. а - Кривая роста рН в водном растворе полиэлектролитных капсул (ПСС-ПАА, 7 слоев, 5,0 × 106) с включенными молекулами уреазы после добавки мочевины 1 мМ. (Запись сделана на рН-метре); б - Кривая роста интенсивности флуоресценции зонда TMA-DPH (2,0 мкМ) в водном растворе полиэлектролитных капсул (ПСС-ПАА, 7 слоев, 5,0 × 106) с включенными молекулами уреазы после добавки мочевины 1мМ. (Запись сделана на флуориметре одновременно с записью на рН метре образца одного и того же приготовления)