Геноидентификация вируса бычьего лейкоза

                НАУЧНАЯ МЫСЛЬ




СЕРИЯ ОСНОВАНА В 2008 ГОДУ






ГЕНОИДЕНТИФИКАЦИЯ
ВИРУСА
БЫЧЬЕГО ЛЕЙКОЗА



МОНОГРАФИЯ




znanium.com

Москва ИНФРА-М 2020

        УДК 619(075.4)
        ББК 48
        Г34

   ФЗ    Издание не подлежит маркировке  
№ 436-ФЗ в соответствии с п. 1 ч. 2 ст. 1

Геноидентификация вируса бычьего лейкоза : монография / Г34 Н.З. Хазипов, Р.Р. Вафин, А.Ю. Шаева [и др.]. — М. : ИНФРА-М, 2020. — 163 с. — (Научная мысль). — www.dx.doi.org/10.12737/21030.
         ISBN 978-5-16-012313-4 (print)
         ISBN 978-5-16-105217-4 (online)
         В монографии представлены сведения о лейкозе крупного рогатого скота — распространенной инфекции, наносящей значительный урон животноводству, о возбудителе этой инфекции — вирусе бычьего лейкоза, о трансформации клеток под действием вируса, что представляет риск развития онкологических болезней человека. Подробно рассматриваются вопросы генотипирования возбудителя, типизации депонированных в генбанке NCBI представителей вируса бычьего лейкоза в зависимости от способа геноидентификации, дается обоснование существования нового, 8-го генотипа вируса бычьего лейкоза и случаев его выявления в различных регионах мира, в том числе в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан.

УДК 619(075.4)
ББК 48

ISBN 978-5-16-012313-4 (print)

ISBN 978-5-16-105217-4 (online)

© Коллектив авторов, 2016

Подписано в печать 15.12.2016.
Формат 60x90/16. Печать цифровая. Бумага офсетная.
Гарнитура Newton. Усл. печ. л. 10,19.
ППТ8.

ТК 640666-851546-100816

ООО «Научно-издательский центр ИНФРА-М» 127282, Москва, ул. Полярная, д. 31В, стр. 1.
                 Тел.: (495) 280-15-96, 280-33-86. Факс: (495) 280-36-29.
                 E-mail: books@infra-m.ru        http: //www.infra-m.ru
Отпечатано в типографии ООО «Научно-издательский центр ИНФРА-М» 127282, Москва, ул. Полярная, д. 31В, стр. 1
Тел.: (495) 280-15-96, 280-33-86. Факс: (495) 280-36-29

            ВВЕДЕНИЕ


   Лейкоз крупного рогатого скота - хроническое инфекционное заболевание опухолевой природы, возбудителем которого является вид Bovine leukemia virus (BLV), вирус бычьего лейкоза (ВБЛ) рода Deltaretrovirus семейства Retroviridae, согласно международной вирусной таксономии [133]. Это одна из наиболее распространенных инфекций, наносящая значительный экономический ущерб вследствие падежа животных, недополучения продуктов животноводства и снижения качества продукции, атакже затрат на проведение оздоровительно-профилактических мероприятий. Болезнь характеризуется прогрессивным увеличением в крови лейкоцитов с последующим развитием лейкозной опухоли и имеет значительное распространение в животноводческих хозяйствах страны.
   Лейкоз крупного рогатого скота является одной из важнейших проблем не только ветеринарной медицины, животноводства, но и биологии и экологии в целом и имеет непосредственное отношение к безопасности здоровья людей, так как вирус имеет близкое морфологическое и эволюционное родство с вирусом Т-клеточного лейкоза человека. Несомненно, одной из важнейших проблем онкологии и лейкозологии является возможная связь между заболеваемостью лейкозами и опухолями животных и человека [147]. Есть данные о способности некоторых онкогенных вирусов преодолевать межвидовые барьеры, а также о тенденции роста этих болезней [80]. Большой интерес представляют проблемы потенциальной опасности для человека продуктов питания от животных из стад, неблагополучных по лейкозу, влияния вредных метаболитов, накапливающихся в организме больных коров, на организм человека, а также использования животных для получения биопрепаратов. Имеются данные об экспериментальном заражении обезьян бычьим лейкозом. Кроме того, установлена высокая степень сходства ВБЛ с вирусом Т-клеточного лейкоза человека типа 1 (HTLV-1, Human T-cell leukemia virus type 1), относящимся также к семейству Retroviridae, что свидетельствует об их общем пути в процессе эволюции [59].
   Исследованиями G.C. Buehring et al. [94, 95] показано, что в организме человека обнаруживаются антитела к белкам вируса бычьего лейкоза, а в эпителиальных клетках молочных желез больных раком молочной железы - ДНК провируса и белки вируса бычьего лейкоза. ВБЛ обусловливает дестабилизацию клеточного генома, приводящую к развитию ракового перерождения клетки.
   В настоящее время в системе мероприятий по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота ведущее место занимает ранняя диагностика с последующим удалением инфицированных животных. В связи с этим, большое значение приобретает геноидентификация возбудителя.

3

   Исследованиями последних лет установлено 8 генотипов вируса бычьего лейкоза, однако особенности генотип-ассоциированного патогенеза не изучены. Для массовых же исследований животных антиген готовится без учета генотипа возбудителя, который циркулирует в животноводческих хозяйствах.
   В монографии представлены сведения о лейкозе крупного рогатого скота, характеристике его возбудителя, эпизоотологии, методах диагностики и профилактики, включая собственные результаты исследований авторов по геноидентификации вируса бычьего лейкоза.

   Монография была написана авторским коллективом:
   Хазипов Нариман Залилович — доктор ветеринарных наук, профессор, профессор кафедры биологической и неорганической химии Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана;
   Вафин Рамиль Ришадович — доктор биологических наук, профессор РАН, главный научный сотрудник Татарского научно-исследовательского института сельского хозяйства;
   Шаева Айгуль Юсуповна — кандидат биологических наук, ассистент кафедры микробиологии Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана;
   Закирова Зухра Рустамовна — кандидат ветеринарных наук, ветеринарный врач ветеринарно-санитарной экспертизы Сармановского районного государственного ветеринарного объединения;
   Алимов Азат Миргасимович — доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой биологической и неорганической химии Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана;
   Кабиров Галимзян Фазылзянович — доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой технологии животноводства Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана.

Глава 1.


            ЛЕЙКОЗ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА


   Лейкоз крупного рогатого скота - это хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, важным клинико-патологическим признаком которой является злокачественный рост клеток органов кроветворения с нарушением процесса их созревания, что приводит к диффузной инфильтрации этими кроветворными клетками органов или проявлению опухолей.
   Лейкоз крупного рогатого скота широко распространен в регионах с развитым животноводством практически на всей территории Российской Федерации и постсоветского пространства, а также за рубежом (в странах Восточной и Западной Европы, Азии, Южной и Северной Америки, Южной Африки, Австралии и Океании). Наиболее интенсивно поражаются вирусом бычьего лейкоза стада крупного рогатого скота молочного направления.
   Хроническая форма болезни протекает в виде лейкемии-лимфомы и сопровождается снижением продуктивности животных, а на стадии развития злокачественной опухоли приводит к вынужденной их выбраковке. Степень заболеваемости животных лейкозом крупного рогатого скота в различных хозяйствах может сильно варьировать. Хозяйства же, неблагополучные по данному заболеванию, терпят существенный экономический ущерб, в первую очередь по причине вынужденного забоя скота, а также из-за затрат на карантинные и противолейкозные мероприятия.
   Ранние сведения о лейкозе животных, в частности, лошадей, были опубликованы еще 1858 г. A. Leisering, а свиней - им же в 1871 г. [136]. А само терминологическое понятие «лейкоз» в патологию крупного рогатого скота ввел I. Doberstein (1934) [110].
   Согласно заключению большинства ученых того периода, лейкозы животных, включая лейкоз крупного рогатого скота, начали относить к злокачественным опухолям, патологический процесс развития которых необратимый [110].
   Установлено, что у крупного рогатого скота при лейкозе происходят изменения в лейкоцитарной формуле. Наблюдается увеличение как общего количества лейкоцитов, так и лимфоцитов, регистрируются измененные ядерные клетки [2,65,25].
   Термин «лейкоз» точно отражает суть заболевания, со свойственным ему скрытым течением без изменения показателей лейкоцитов в исследуемой периферической крови [65]. Для обозначения данной болезни используют и другие термины, например, лейкемия, злокачественная лимфома, лимфобластосаркома, лимфосаркома, лимфоцитоматоз, гис-тиоцитарная саркома, гемобластоз и прочие определения. Названия же

5

«лейкоз» и «гемобластоз» являются наиболее часто употребляемыми в научной литературе и государственных документах [157].
   Информация о выделении вируса бычьего лейкоза от инфицированных им коров появилась еще в 60-х годах XX века. J.M. Miller et al. (1976) выявил в сыворотках больных лейкозом коров специфические антитела к вирусу бычьего лейкоза (BLV) [150]. Изучение вирусной этиологии данной болезни, имевшее научно-практическую значимость, определило основные направления будущих исследований [138]. Большой вклад в изучение проблемы лейкоза крупного рогатого скота внесли советские ученые. В СССР выполнены фундаментальные исследования по клинико-гематологической и цитоморфологической диагностике Б.Б. Ермолаевым [21], Г.А. Симоняном [65], Н.М. Костроматиновым [40]; по патоморфологии- Т.П. Кудрявцевой [43]; по биохимическим и патогенетическим-Г.Ф. Коромысловым [39], генетическим - В.А. Бусол [10]; по эпизоотологическим аспектам - Э.М. Нымен [58], Д.Е. Беловым [9], Н.С. Мандигрой [53]). В нашей стране возникновение лейкоза связывают с завозом в 1940-1947 гг. животных из Германии и из других неблагополучных стран на территории Советского Союза.

Глава 2.


            ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ БЫЧЬЕГО ЛЕЙКОЗА


   На протяжении более века исследователи из разных государств мира изучали этиологию данного заболевания, но только 1969 год ознаменовался в истории изучения лейкоза годом открытия этиологического агента - вируса лейкоза крупного рогатого скота, или бычьего лейкозного вируса (Bovine Leukemia virus, BLV) [149].
   Возбудитель лейкоза крупного рогатого скота - онкогенный вирус (РНК-содержащий) рода Oncovirus семейства Retroviridae [89, 114, 137, 151, 164]. Вирус бычьего лейкоза (ВБЛ) в морфологическом аспекте проявляет схожесть с возбудителями, вызывающими лейкоз у других видов животных. При этом антигенная структура вируса существенно отличается. Известен серовариант вируса, к которому помимо крупного рогатого скота восприимчивы еще овцы и козы.
   По структуре и морфологии вирус бычьего лейкоза относится к типу С, а по онкогенным свойствам делится на три группы:
   1) медленнотрансформирующийся, или вирус хронического лейкоза;
   2) быстротрансформирующийся, или вирус острого лейкоза.
   3)   трансрегулирующиеся вирусы (по структуре и морфологии вирусы схожи с вирусом иммунодефицита человека - ВИЧ).
   Геном вируса бычьего лейкоза содержит гены, кодирующие как структурные белки (gag-ген), включая гликопротеид оболочки (env-ген), так и обратную транскриптазу (pol-ген). Вирус имеет в своем геноме онкогены V-onco [20]. Согласно данным многих ученых, вирусные частицы (вирионы) имеют выраженный полиморфизм.
   Большинство вирионов имеют сферическую форму диаметром 90120 нм и состоят из сердцевины, внутренней белковой мембраны и липидосодержащей наружной мембраны. На поверхности внешней оболочки имеются пепломеры (шипики) с утолщением пуговкообразной формы на конце (8-11 нм), состоящие из субъединиц, которые образованы двумя типоспецифичными вирусными белками (gp51, gp30). В сердцевине различают капсулу сердцевины с икосаэдральной симметрией и нуклеоид, расположенный в центре вириона, размером 60-90 нм [54].
   Структура вириона ВБЛ представлена на рис. А. Геном его составляют две ассоциированный молекулы РНК, которые с нуклеокапсидными и капсидными белками (Р24, Р15, Р12 и Р10) образуют капсид вириона.
   Две копии одноцепочечной геномной РНК упакованы в вирусной частице. Капсидные белки СА (p24) формируют капсид, который содержит вирусную РНК, связанную с нуклеокапсидным белком NC (p12). Матриксный белок МА (p15) взаимодействует с капсидом и внешней оболочкой, которая формируется двойным липидным слоем клеточного происхождения с включенными в него вирусными гликопротеидами gp30(TM)ngp51 (SU) [118].

7

Рис. А. Схематическое изображение вирусной частицы

   Оболочка вириона образована компонентами клеточной мембраны с включенными в них вирусными гликопротеидами - gp51 и gp3O. По аналогии с другими ретровирусами считается, что в капсиде должно быть немного обратной транскриптазы и интегразы, но филогенетическое сравнение различных ретровирусов показало, что ВБЛ образует среди них особую группу. Кроме того, обратная транскриптаза онкорна-вирусов имеет молекулярную массу 80 кДа и в одном вирионе присутствуют десятки этих молекул. Молекулярная масса ревертазы ВБЛ имеет такую же молекулярную массу, и, вероятнее всего, ее в вирионе ВБЛ нет [118].
   Геном вируса может существовать в двух формах: геномной 1-цепо-чечной РНК или в виде ДНК, синтезированной на геномной РНК как на матрице и интегрированной в хромосому клетки-хозяина в виде провируса. Геномная РНК содержится только в зрелых вирионах. В зрелом вирионе содержится две молекулы РНК (рис. А). В жизненном цикле вируса геномная РНК функционирует лишь 1 раз, когда служит матрицей для фермента- обратной транскриптазы при биосинтезе комплементарной ДНК. Весь объем биохимических процессов, необходимый для полной репликации вируса, выполняется с участием ДНК-провируса [69].
   Провирусная ДНК содержит около 9 тыс. нуклеотидных пар. В геноме ВБЛ различают гены gag, prt, pol, env, tax, rex, R3 и G4 (рис. Б). Кроме геномной РНК в процессе транскрипции путем альтернативного сплайсинга (вырезания определенных районов РНК-интронов) и сдвига рамок считывания образуются иРНК env (5,1 тыс.н.) иРНК gag-pol,

8

иРНК tax/rex (2,1 тыс.н.) и немного в меньшем количестве - иРНК, ко-диглюшие R3 и G4.
                                        . X .

Рис. Б. Структура провируса ВБЛ: гены, РНК-транскрипты и вирусные белки


   Провирус ограничен двумя идентичными последовательностями длинных концевых повторов (LTRs) и содержит открытые рамки считывания (ORFs), соответствующие gag, prt (протеаза), pol и env генам. Ряд ORFs, кодирующих Tax, Rex, R3 и G4, присутствуют в X-регионе между геном env и 3' LTR [118].
   На обоих концах молекулы содержатся последовательности нуклеотидов, называемые LTR (Long Terminal Repeat) - длинные концевые повторы, которые состоят из трех регионов: U3 - уникальная последовательность нуклеотидов (358 п.н.), R - повторяющиеся последовательности (100 п.н.) и U5 - уникальные последовательности нуклеотидов (180 п.н.).
   Транскрипция геномной РНК начинается с первого нуклеотида в R-районе 5' LTR и заканчивается последним нуклеотидом в R-районе 3' LTR.


9

   Регион U3 5' LTR - регуляторный район транскрипции вирусной РНК. Ключевым регуляторным районом является тройной повтор в 21 п.н. (TxRE), он находится в середине LTR и взаимодействует с клеточными факторами траскрипции - CREB (белок, связывающий элемент, реагирующий с циклической АМФ), ATF-1 и ATF-2. Этот же сайт LTR является мишенью для белка Tax, активатора вирусной транскрипции, который укрепляет связь CREB с ДНК [184].
   Есть и другие элементы в U3 районе, участвующие в регуляции транскрипции вирусных РНК. Среди них - NF-kB-связывающий сайт (ядерный фактор каппа белков), с которым связываются члены семейства каппа-В-белков (р49, р50 и р65) [90, 154]. Другой элемент необходим для ответной реакции LTR промотора к глюкокортикоидам [182, 107].
   В U5 районе есть сайт связывания интерферон-регуляторных факторов (IRF-1 и IRF-2), которые стимулируют транскрипцию в отсутствии белка Tax. Есть последовательности нуклеотидов и в R-районе 5' LTR, которые участвуют в регуляции транскрипции.
   За точкой старта транскрипции локализован Е-бокс мотив (5'-Ц-А-Ц-Г-Т-Г-3'), связывающий стимуляторные факторы транскрипции клетки -USF-1 и USF-2, которые подавляют LTR-направляемую экспрессию.
   Кроме того, вирусная экспрессия регулируется и путем модификации активности клеточной ДНК, например, с помощью ацетилирования гистонов и метилирования ДНК.
   Так же, как и клеточная, вирусная экспрессия регулируется и на посттранскрипционном уровне, например, вирусным белком Rex, который взаимодействует с 3' LTR, что необходимо для экспорта из ядра в цитоплазму целых или односплайсированных вирусных транскриптов.
   Транскрипция РНК с провирусной ДНК начинается с границы U2/R5' LTR и до последнего нуклеотида в R-районе 3' LTR, после чего она полиаденилируется. 3'-конец геномной РНК содержит высокоструктурированный район RxRE, который необходим для транспорта РНК-посредника из ядра в цитоплазму.
   После выхода из ядра геномная РНК может стать матрицей для синтеза белка-предшественника Рг145дад⁻ро¹, из которого после расщепления образуются структурные и энзиматические белки (остальные вирусные белки, необходимые для репродукции вируса, образуются путем транскрипции встроенной вирусной ДНК в соответствующие им иРНК) или включаться в формирующиеся вирионы, если эти белки в клетке уже есть [73, 118].
   Гены gag и протеазы. Ген gag кодирует белок-предшественник Pr44gag - полипептид, который впоследствии расщепляется на белки вирусной частицы (p15, p24 и p12) [130, 121, 141, 158, 171, 146].
   Матриксные (MA) белки p15 связаны с геномной вирусной РНК, но также взаимодействуют и с двойным липидным слоем вирусной мембраны. Структурно MA содержат четыре основные спирали, которые соединены короткими петлями (цепочками) [105]. Матриксный белок может быть далее расщеплен на три фрагмента: полипептиды p10, p4 и продукт из семи аминокислот [129].

10