Влияние тяжелых металлов на большого прудовика

УДК 594.381.5:591.1[546.6+546.48]

Дромашко, С. Е. Влияние тяжёлых металлов на большого 

прудовика Lymnaea stagnalis L. / С. Е. Дромашко, С. Н. Шевцова, 
А. С. Бабенко ; под общ. ред. С. Е. Дромашко ; Нац. акад. наук 
Беларуси, Ин-т генетики и цитологии ; Белорус. общество генетиков и селекционеров. – Минск : Беларуская навука, 2018. – 
172, [2] с. – ISBN 978-985-08-2327-4.

Одними из приоритетных поллютантов поверхностных вод Республики 

Беларусь являются соли тяжёлых металлов, вызывающие токсический эффект 
у водных и околоводных организмов на молекулярно-клеточном уровне. Брюхоногий моллюск Lymnaea stagnalis (большой прудовик) рекомендован Министерством здравоохранения Республики Беларусь для оценки эмбриотоксичности и генотоксичности при биотестировании металлосодержащих отходов 
и потенциально опасных химических веществ. В монографии описаны результаты исследований воздействия солей свинца, никеля, меди, кобальта, 
цинка, кадмия на различные стадии жизненного цикла L. stagnalis (эмбриональное развитие, ювенильные и половозрелые особи). У половозрелых особей 
большого прудовика изучены репродуктивные и цитогенетические показатели, а также экспрессия генов металлотионеинов – многофункциональных 
стрессорных белков.

Рассчитана на научных работников, преподавателей вузов, аспирантов, 

магистрантов, студентов, а также на всех, кто интересуется оценкой качества 
водных экосистем с помощью биологических объектов.

Таб. 27. Ил. 41. Библиогр.: 265 назв.

Р е ц е н з е н т ы:

доктор биологических наук, профессор  С. Б. Мельнов,

доктор биологических наук, доцент  В. М. Байчоров

ISBN 978-985-08-2327-4
© Дромашко С. Е., Шевцова С. Н., 
    Бабенко А. С., 2018
© Оформление. РУП «Издательский дом
    «Беларуская навука», 2018

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение ...........................................................................................................  
6

Принятые сокращения .................................................................................  
11

Глава 1. Антропогенное воздействие на гидроэкосистемы и перспективы применения моллюсков в биомониторинге и биотестировании ....  
12

1.1. Загрязнение водной среды тяжёлыми металлами: общее состояние и тенденции .....................................................................................  
12

1.2. Формы нахождения и миграция тяжёлых металлов в экосистемах пресных водоёмов ............................................................................  
18

1.3. Роль моллюсков в пассивном и активном мониторинге водных 
экосистем ..................................................................................................  
23

1.4. Перспективы применения L. stagnalis и других брюхоногих 
моллюсков в биотестировании водной среды .....................................  
29

1.5. Методы нормирования тяжёлых металлов в водной среде 
и проблема оценки качества пресных вод ............................................  
36

1.6. Использование экспрессии генов металлотионеинов для оценки 
качества водной среды ............................................................................  
39

Глава 2. Материалы и методы, используемые при изучении эффектов 
солей тяжёлых металлов у Lymnaea stagnalis L. .....................................  
42

2.1. Объект исследования ........................................................................  
42

2.2. Приготовление растворов солей тяжёлых металлов и условия 
проведения экспериментов .....................................................................  
43

2.3. Изучение эмбрионального развития L. stagnalis в условиях влияния солей тяжёлых металлов ...............................................................  
46

2.4. Оценка роста особей L. stagnalis на ювенильной стадии жизненного цикла в условиях влияния солей тяжёлых металлов ...........  
48

2.5. Оценка репродуктивных показателей и организации зародышевых капсул у L. stagnalis в условиях влияния солей тяжёлых 
металлов ....................................................................................................  
49

2.6. Анализ цитологических препаратов гемоцитов L. stagnalis .......  
50

2.7. Статистическая обработка и анализ данных .................................  
52

2.8. Исследование экспрессии металлотионеинов ..............................  
52

Глава 3. Влияние солей тяжёлых металлов на эмбриональное развитие Lymnaea stagnalis L. ................................................................................  
54

3.1. Эффекты ацетата свинца ..................................................................  
54

3.2. Эффекты нитрата никеля .................................................................  
58

3.3. Эффекты сульфата меди ..................................................................  
63

3.4. Эффекты сульфата кобальта ............................................................  
68

3.5. Эффекты ацетата цинка ...................................................................  
72

3.6. Эффекты ацетата кадмия .................................................................  
76

Глава 4. Влияние солей тяжёлых металлов на рост ювенильных 
особей Lymnaea stagnalis L. ..........................................................................  
83

4.1. Эффекты солей свинца, никеля, меди, кобальта, цинка, кадмия ....  
83

4.2. Сравнение эффектов солей тяжёлых металлов на рост молоди 
лёгочных моллюсков ...............................................................................  
87

Глава 5. Влияние солей тяжёлых металлов на репродуктивные показатели и организацию зародышевых капсул у Lymnaea stagnalis L.....  
92

5.1. Эффекты ацетата свинца ..................................................................  
92

5.2. Эффекты нитрата никеля .................................................................  
96

5.3. Эффекты сульфата меди ..................................................................  
98

5.4. Эффекты сульфата кобальта ............................................................  
102

5.5. Эффекты ацетата цинка ...................................................................  
103

5.6. Эффекты ацетата кадмия .................................................................  
106

Глава 6. Влияние солей тяжёлых металлов на цитогенетические показатели гемоцитов у половозрелых особей Lymnaea stagnalis L. ......  
114

6.1. Эффекты ацетата свинца ..................................................................  
114

6.2. Эффекты нитрата никеля.................................................................  
116

6.3. Эффекты сульфата меди ..................................................................  
117

6.4. Эффекты ацетата цинка ...................................................................  
119

6.5. Эффекты ацетата кадмия .................................................................  
120

Глава 7. Разработка на основе полимеразной цепной реакции тест- 
системы для оценки влияния тяжёлых металлов на экспрессию 
металлотионеина у половозрелых особей Lymnaea stagnalis L. ..........  
123

7.1. Конструирование нескольких наборов специфических олигонуклеотидных праймеров для амплификации кДНК фрагмента гена 
металлотионеина L. stagnalis .................................................................  
123

7.2. Оптимизация условий классической полимеразной цепной 
реакции......................................................................................................  
128

7.3. Молекулярное клонирование кДНК фрагмента гена металлотионеина L. stagnalis с целью получения положительного контроля 
полимеразной цепной реакции ..............................................................  
131

7.4. Оптимизация условий амплификации фрагмента кДНК гена 
металлотионеина L. stagnalis методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени ..........................................................  
136

7.5. Использование разработанных подходов на примере оценки 
эффектов ацетата свинца и ацетата кадмия .........................................  
140

Заключение .....................................................................................................  
147

Conclusions .......................................................................................................  
150

Литература и источники .............................................................................  
153

Кромсаем лёд,
меняем рек теченье,
твердим о том, что дел невпроворот…
Но мы еще придем
                               просить прощенья
у этих рек,
барханов
и болот,
у самого гигантского
                               восхода,
у самого мельчайшего
                               малька...
Пока об этом
думать неохота.
Сейчас нам не до этого
пока.
Аэродромы,
                    пирсы
                               и перроны,
леса без птиц
и земли без воды...
Всё меньше –
                      окружающей природы,
Всё больше –
                      окружающей среды.

  Р о б е р т   Р о ж д е с т в е н с к и й

ВВЕДЕНИЕ

По мере роста численности населения и развития промыш
ленности расширяется спектр и увеличивается число ксенобиотиков, загрязняющих биосферу. Известно, что в данном отношении 
водная среда отличается максимальной уязвимостью, поскольку 
большинство загрязнителей успешно накапливаются компонентами гидроэкосистем, но элиминируются из них чрезвычайно 
медленно [1]. В пресные водоёмы постоянно поступает огромное количество промышленных, бытовых и сельскохозяйственных отходов при сбросе недостаточно очищенных сточных вод, 
путём атмосферного переноса, в составе поверхностного стока.

Одними из приоритетных поллютантов поверхностных вод 

Республики Беларусь, как и многих других стран мира, являются 

соли тяжёлых металлов (ТМ) [2]. При поступлении в гидроэкосистемы значительных количеств металлосодержащих отходов, 
ТМ оказывают токсический эффект на водные и околоводные 
организмы на молекулярно-клеточном уровне [3].

В настоящее время на территории стран СНГ проводятся изу
чение и оценка воздействия ТМ и других техногенных загрязнителей на состояние гидроэкосистем. Исследования в данном 
направлении имеют не только большое фундаментальное значение, но и существенную практическую значимость, поэтому 
поиск и разработка наиболее чувствительных критериев оценки 
влияния ТМ на водные организмы не теряют актуальности.

В практике активного и пассивного биомониторинга приме
няются гидробионты, относящиеся к различным таксонам: от 
бактерий до рыб и млекопитающих. Различные представители 
типа Mollusca являются одними из наиболее широко используемых тест-систем в экологических и токсикологических исследованиях, а также играют существенную роль при проведении 
мониторинга водных объектов, испытывающих значительную 
техногенную нагрузку [4]. Брюхоногие моллюски отличаются 
рядом качеств, обусловливающих целесообразность их применения в экологическом мониторинге водных экосистем и в лабораторном биотестировании. Необходимость разработки протоколов биотестирования с применением пресноводных гастропод 
в лабораторных условиях обусловлена рядом причин.

Во-первых, сегодня брюхоногие моллюски практически отсут
ствуют среди объектов, используемых в системе оценки качества 
водной среды. Согласно литературным данным, существенную 
часть рациона пресноводных брюхоногих моллюсков составляет 
детрит [5], а сами моллюски оказывают существенное влияние на 
многие виды макрофитов, поедая не только перифитон, но и высшие водные растения [6]. Составляя существенную долю кормовой базы рыб и птиц, данные беспозвоночные играют значительную роль в функционировании водных экосистем и поддержании 
их целостности. Поэтому изучение откликов пресноводных моллюсков на химическое загрязнение водной среды является актуальным для экологической оценки состояния гидроэкосистем.

Во-вторых, перспективность применения пресноводных мол
люсков в практике биотестирования оправдана методической 
простотой и экономичностью [7]. В силу того, что репродуктивная система брюхоногих моллюсков отличается высокой чувствительностью к воздействию гормонально-активных загрязнителей водной среды, очевидна целесообразность оценки лекарственных средств и различных поллютантов органической природы на 
показатели воспроизводства этих гидробионтов как в целях биотестирования, так и для разработки природоохранных мер [8]. 
Относительно недавно пресноводные моллюски Potamopyrgus 
antipodarum и Lymnaea stagnalis были рекомендованы Организацией экономического сотрудничества и развития для проведения длительных хронических экспериментов по оценке воздействия гормонально-активных ксенобиотиков [9]. Кроме того, 
пресноводный брюхоногий моллюск Lymnaea stagnalis был рекомендован к использованию в качестве объекта для оценки эмбриотоксических свойств оловоорганических соединений [10].

Большой прудовик (Lymnaea stagnalis Linnaeus, 1758) широ
ко распространён в средней полосе Европы [11]. Данный вид 
вторичноводных моллюсков населяет озёра, пруды, водохранилища, а также заросшие макрофитами речные затоки [12]. Особи
L. stagnalis часто перемещаются по поверхности донных осаждений и различных подводных субстратов, а физиологическая 
необходимость периодического заполнения лёгочной полости 
атмосферным воздухом обусловливает частое всплывание лёгочных моллюсков к поверхности воды. Таким образом, лимнеид 
относят к массовым представителям макрозообентоса, которые 
могут применяться при интегральной оценке качества водной 
среды в силу особенностей образа жизни.

Для данного вида пресноводных моллюсков характерен 

двухлетний жизненный цикл, что наряду с относительной простотой отлова особей из естественных мест обитания позволяет 
использовать их в практике пассивного мониторинга состояния 
водоёмов, испытывающих существенную антропогенную нагрузку. Кроме того, высокая плодовитость, простота и экономичность 
поддержания лабораторной культуры L. stagnalis обусловливает 

возможность применения этих беспозвоночных в практике лабораторного биотестирования. Целесообразность использования 
большого прудовика в биотестировании подтверждается также 
наличием инструкций, одобренных Министерством здравоохранения Республики Беларусь по применению у данного вида 
некоторых показателей эмбриотоксичности и генотоксичности 
в биотестировании металлосодержащих отходов и потенциально 
опасных химических веществ [13, 14].

В Беларуси экологические и токсикологические исследова
ния с применением L. stagnalis проводятся в лаборатории моделирования генетических процессов Института генетики и цитологии НАН Беларуси под руководством доктора биологических 
наук С. Е. Дромашко, в лаборатории профилактической и экологической токсикологии Республиканского унитарного предприятия «Научно-практический центр гигиены» по инициативе кандидата биологических наук А. М. Войтовича, а также на 
базе кафедры биологии человека и экологии Международного 
государственного экологического института имени А. Д. Сахарова Белорусского государственного университета под руководством доктора биологических наук А. П. Голубева. Значительный теоретический и практический задел, сформированный 
к настоящему времени в изучении биологии и экологии лёгочных моллюсков в целом и большого прудовика в частности, 
может служить основой для дальнейшего развития и совершенствования методик применения брюхоногих моллюсков в практике биотестирования.

Таким образом, проведение экологических, токсикологиче
ских и экотоксикологических исследований с использованием
большого прудовика (Lymnaea stagnalis) является актуальным. 
Анализ литературных источников свидетельствует о том, что 
анатомо-физиологическая организация [15], особенности размножения [16] и эмбрионального развития [17, 18] L. stagnalis
являются хорошо изученными, что обусловливает широкое применение моллюсков данного вида в качестве объекта экологических и токсикологических исследований. На сегодня изучен 
ряд физиологических аспектов влияния сульфата меди, хлорида 

цинка, нитрата свинца на большого прудовика в остром эксперименте [19, 20]. В литературе также имеются данные о негативном воздействии солей кадмия и кобальта, наночастиц серебра на зародышевое развитие L. stagnalis [21–23]. Вместе с тем 
в большинстве опубликованных работ, посвящённых оценке 
воздействия солей ТМ на большого прудовика, использованы 
относительно высокие концентрации металлов (на порядок и более 
превышающие предельно допустимые концентрации – ПДК), 
фактически не регистрируемые даже в водных объектах с максимальной техногенной нагрузкой.

В связи с вышеизложенным, исследования воздействия солей 

ТМ на различные стадии жизненного цикла L. stagnalis актуальны для совершенствования системы оценки состояния водных 
экосистем в условиях техногенной нагрузки, а также методов 
оценки качества водной среды в практике. Большой интерес также представляет исследование эффектов солей ТМ на экспрессию 
генов металлотионеинов (МТ) – многофункциональных стрессорных белков.

Главы 1–6 основаны на материалах кандидатской диссерта
ции С. Н. Шевцовой «Воздействие солей тяжёлых металлов на 
эмбриологические, репродуктивные и цитогенетические показатели брюхоногого моллюска Lymnaea stagnalis L.», выполненной под руководством доктора биологических наук, профессора С. Е. Дромашко и защищенной в 2016 г. в Государственном 
научно-производственном объединении «Научно-практический 
центр Национальной академии наук Беларуси по биоресурсам». 
В основу написания главы 7 легли результаты, полученные 
в ходе выполнения проекта Белорусского республиканского фонда фундаментальных исследований Х12-104 «Оценка влияния 
химических загрязнителей на изменение уровня экспрессии металлотионеинов Lymnaea stagnalis in vivo с помощью ПЦР в режиме реального времени», а также после его завершения в 2014 г. 
Эти материалы тоже нашли отражение в главах 1 и 2. В выполнении проекта Х12-104 принимал участие кандидат химических 
наук А. С. Бабенко, который также является автором данной монографии.