Механизмы клеточной химиорезистентности при раке молочной железы

УДК 618.19-006.6:615.28(476)

Демидчик, Ю. Е. Механизмы клеточной химиорезистентно
сти при раке молочной железы / Ю. Е. Демидчик, С. А. Костюк, 
И. Ю. Третьяк. –  Минск : Беларуская навука, 2016. – 152 с. – 
ISBN 978-985-08-1991-8.

В монографии подробно описаны принципы молекулярно-биоло ги че
с ких методов, которые используются в онкологии, обобщены данные о механизмах клеточной химиорезистентности при раке молочной железы, преимущественно ассоциированных с изменением функциональной активности 
белков семейства ABC-ранспортеров, глутатион-S-трансфераз. Определен круг 
наибо лее прогностически значимых факторов развития клеточной химиорезистентности при раке молочной железы.  

Предназначена для врачей-онкологов, онкологов-хирургов, врачей клиниче
ской лабораторной диагностики, а также врачей широкого профиля.

Табл. 29. Ил. 29. Библиогр.: 175  назв.

Р е ц е н з е н т ы:

доктор медицинских наук М. В. Фридман,

доктор медицинских наук, профессор В. И. Прохорова,

доктор медицинских наук, профессор Ю. М. Гаин

ISBN 978-985-08-1991-8
© Демидчик Ю. Е., Костюк С. А., 
    Третьяк И. Ю., 2016 
© Оформление. РУП «Издательский
    дом «Беларуская навука», 2016

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 

АПХТ – адъювантная полихимиотерапия
AT – доксорубицин + таксаны
АТФ – аденозинтрифосфат
ВПЧ – вирус папилломы человека
ДИ – доверительный интервал
ДЛТ – дистанционная лучевая терапия
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖКТ – желудочно-кишечный тракт
ИГХ – иммуногистохимия
кб – килобаза
МЛУ – множественная лекарственная устойчивость
НПХТ – неоадъювантная полихимиотерапия
НСД – нуклеотидсвязывающий домен 
ОИФ РМЖ – отечно-инфильтративная форма рака молочной железы
ОР – относительный риск
ОТ-ПЦР – обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция
ОШ – отношение шансов
п. н. – пары нуклеотидов
п. о. – пары оснований
ПД РМЖ – первично-диссеминированный рак молочной железы
ПТИ – посттерапевтический индекс 
ПХТ – полихимиотерапия
ПЦР – полимеразная цепная реакция
РМЖ – рак молочной железы
РНК – рибонуклеиновая кислота
ТМД – трансмембранные домены 
ТМС – твердофазное мини-секвенирование
AC/EC  – циклофосфан + доксорубицин/эпирубицин + циклофосфан
CAF/FEC – циклофосфан + доксорубицин + 5-фторурацил/5-фторурацил +

эпирубицин + циклофосфан

CMF  – циклофосфан + метатрексат + 5-фторурацил
FISH – флуоресцентная in situ гибридизация
GST – глутатион-S-трансферазы
HER2neu – эпидермальный фактор роста 2-го типа

ПРЕДИСЛОВИЕ

В монографии подробно описаны принципы молекулярно- 

биологических методов, используемых в онкологии, освещены 
механизмы клеточной химиорезистентности при раке молочной 
железы, преимущественно ассоциированные с изменением функ циональной активности белков семейства ABC-транспортеров, 
глутатион-S-трансфераз. Представлены новые сведения о роли глутатион-S-трансфераз и ABC-транспортеров как предикторов кли нического исхода у пациенток, страдающих раком молочной железы.

В одной из глав книги приведены характеристики основных 

диагностических и прогностических молекулярных маркеров, применяемых в онкологии, предложены стратегии выбора маркеров 
и методов анализа в зависимости от целей и задач, которые стоят 
перед практическим здравоохранением.

Отдельные главы в книге посвящены анализу современных до
стижений в области изучения механизмов клеточной химиорезистентности при раке молочной железы, связанных с изменением 
экспрессии белков семейства ABC-транспортеров, глутатион-S- 
трансфераз. В связи с преимущественным изучением по литературным данным экспрессии GST и ABC-транспортеров иммуногистохимическим методом (определение экспрессии белков), а также ПЦР (полиморфизм генов GST, ABC), представлены результаты 
собственных исследований по разработке методики определения 
уровней нормализованной экспрессии генов семейств ABC, GST.

Особый интерес вызовут главы, в которых представлена роль 

экспрессии генов семейств ABC, GST в определении различий 
в реакциях на противоопухолевое лечение.

Авторами с благодарностью будут восприняты и учтены 

в дальнейшей работе все замечания и пожелания читателей.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время большое количество научных исследова
ний посвящено изучению отдельных молекулярно-биологических характеристик опухолевой ткани, однако из-за множества 
потенциально значимых факторов и больших различий в данных 
об их прогностической значимости, представленных в литературе, выбор определенного типа терапии остается затруднительным. При этом сегодня назначение большинства противоопухолевых препаратов основывается не на индивидуализированном 
подходе, а на статистической вероятности получе ния положительного эффекта. Недостатки эмпирического подхода для выбора терапии представляются особенно очевидными именно 
в онкологии: отсутствие достаточного резерва времени для оптимизации лечения, выраженные побочные эффекты химиотерапии, 
высокая стоимость большинства цитостатиков [12].

Рак молочной железы (РМЖ) занимает одно из ведущих мест 

в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями в большинстве стран мира, в том числе в Республике Беларусь. За последние 10 лет (2004–2013 г.) отмечено увеличение 
количества первичных случаев этого новообразования с 65,9 до 
76,4 на 100 тыс. женского населения. Следует отметить, что в течение последних лет смертность от РМЖ в нашей стране устойчиво занимает первое место в структуре смертности от злокачественных новообразований среди женского населения, составив 
в 2013 г. 17,0% от числа всех умерших [21]. Таким образом, неуклонный рост заболеваемости РМЖ, высокая смертность от 
данной патологии делает исследование этого заболевания одним 
из самых актуальных в клинической онкологии. Как правило, ко 

времени выявления данное заболевание представляет собой системный опухолевый процесс, лечение которого требует применения цитостатиков [18]. 

Согласно современным представлениям, эффективность хи
миотерапии зависит от степени фармакокинетической чувствительности раковых клеток и в значительной мере обусловлена 
васкуляризацией новообразования, определяющей условия для 
высокой либо низкой концентрации противоопухолевых препаратов [108]. Резистентность раковых клеток в основном представляет собой проявление фенотипа множественной лекарственной 
устойчивости (МЛУ) с их перекрестной невосприимчивостью 
к воздействию широкого круга структурно и функционально 
«неродственных» цитостатиков [32]. 

Основные механизмы формирования МЛУ включают в себя 

уменьшение накопления чужеродного вещества за счет активации энергозависимого обратного транспорта химиопрепарата из 
клетки, стимуляцию системы внутриклеточной детоксикации 
и усиление репарации внутриклеточных повреждений [1]. При 
этом одной из наиболее частных причин МЛУ считается активация выброса противоопухолевых лекарственных средств из 
клет ки вследствие повышенной экспрессии белков семейства АВС- 
транспортеров (АТФ-зависимые транспортеры, ATP Binding Cassette transporters). Глутатион-S-трансферазы (GST) находятся 
в центре внимания при характеристике лекарственно-устойчивых клеток, принимая участие в детоксикации ксенобиотиков 
[161]. Полагается, что количество цитостатиков, резистентность 
к которым определяется усилением репарации внутриклеточных 
повреждений, значительно меньше, чем химиопрепаратов, лекарственная устойчивость к которым обусловлена первыми двумя 
механизмами [1]. Соответственно, изучение и понимание молекулярных механизмов, оказывающих влияние на течение опухолевого процесса, представляются важными и перспективными 
в лечении рака молочной железы.  

Глава 1

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 

В ОНКОЛОГИИ

1.1. Диагностика злокачественных новообразований

Достижения генетики и молекулярной биологии последних 

десятилетий оказали огромное влияние на понимание природы 
инициализации и прогрессии злокачественных новообразований. Рак представляет собой гетерогенную группу заболеваний, 
в основе возникновения которых лежит комплекс генетических 
нарушений, обеспечивающих возможность неконтролируемого 
роста опухолевых тканей и способность к метастазированию. 
Онкологические заболевания характеризуются клональной эволюцией трансформированных клеток. Одним из механизмов возникновения раковых клеток является трансформация нормальных клеток вследствие накопления наследуемых (герминативных) и приобретенных (соматических) мутаций в критических 
протоонкогенах и ассоциированных с опухолями генах-супрессорах. Эти знания открыли принципиально новые возможности в диагностике и лечении злокачественных новообразований 
[30, 105].

Влияние конкретных генетических нарушений, лежащих в ос
нове опухолевого роста, позволило обнаружить специфические 
молекулярные маркеры и разработать на их основе тесты ранней диагностики опухолей. Современная диагностика опухолей 
предусматривает обязательное применение наряду с классичес кими морфологическими методами иммуноцитохимических и мо лекулярно-генетических методов [7].

Есть и другой аспект проблемы, который связан с ранним 

распознаванием метастазов. Наличие минимальной остаточной 
опухоли и микрометастазов существенно ограничивает перспек

тиву дальнейшего увеличения показателей выживаемости. До 
последнего времени поиск микрометастазов осуществляли только традиционными методами световой микроскопии, которые 
в большинстве случаев оказываются неэффективными. Развитие иммуноцитохимических и молекулярно-биологических технологий сделало возможной идентификацию единичных изолированных опухолевых клеток в лимфатических узлах, серозных 
жидкостях организма, периферической крови и костном мозге. 
В частности, удается выявить одну опухолевую клетку среди 
1 млн разнообразных по своей природе кроветворных клеток 
костного мозга [19, 55]. 

1.2. Маркеры опухолевого роста и их выявление

Выделяют три группы маркеров опухолевого роста: белок- 

ассоциированные маркеры, РНК-маркеры и ДНК-маркеры. 

Белок-ассоциированные маркеры могут определяться в обыч
ных пробах крови рутинными биохимическими и иммунохимическими методами. Среди таких маркеров следует упомянуть 
простатоспецифический антиген (ПСА) при раке предстательной 
железы, СА 125 при раке яичника, раково-эмбриональный антиген (РЭА) при карциномах органов пищеварительного тракта, человеческий хорионический гонадотропин при трофобластических опухолях, альфа-фетопротеин при гепатоцеллюлярном раке 
и эмбриональных карциномах. Выявление этих белков важно 
для определения прогноза и мониторинга заболевания, раннего 
обнаружения метастазов и рецидивов опухоли. Однако их применение ограничено, так как они недостаточно специфичны для 
какой-либо одной опухоли или типа опухолей, а их присутствие в крови часто указывает на уже распространенный процесс 
[19, 130]. 

Использование маркеров, ассоциированных с РНК, основано 

на наличии мутаций в протоонкогенах и генах-супрессорах опухолей, которые могут определяться и в транскриптах. Проведение диагностики на основе РНК-маркеров является трудоемким, 
так как они легко деградируют, но оценка экспрессии генов на 

уровне РНК может быть использована как важный диагностический критерий. Современные методы позволяют определять экспрессию тех или иных мутантных генов путем выделения РНК 
из клинического материала с последующей обратной транскрипцией (ОТ) и полимеразной цепной реакцией (ПЦР) для амплификации ДНК (ОТ-ПЦР) [52]. 

Анализ цельной крови и костного мозга на наличие анор
мальных транскриптов, полученных из трансформированных клеток, применяют для мониторинга пациентов с хроническим миелолейкозом, минимальной резидуальной болезнью. Наиболее 
перспективно использование этого метода для обнаружения микрометастазов – единичных опухолевых клеток в тканях [7].

ДНК-маркеры – самый распространенный субстрат для мо
лекулярно-биологической диагностики, так как ДНК стабильна 
и может быть быстро амплифицирована с использованием методики ПЦР, что дает возможность обойтись минимальным количеством клеточного материала. При диагностике онкологических 
заболеваний с использованием ДНК-маркеров выявляют мутации гена р53 в ДНК, выделенной из мочи пациентов с раком мочевого пузыря, а также мутации онкогена Ras в ДНК, выделенной из биологического материала пациентов с колоректальным 
раком. Мутации генов р53 и Ras выявляют также в ДНК, выделенной из мокроты пациентов с раком легкого [7, 19, 105].

Важное место в обнаружении опухолевых клеток занимает 

анализ повторов последовательностей нуклеотидов в микросателлитной ДНК, который позволяет установить как наличие новой аллели гена (что свидетельствует о нестабильности микросателлитной ДНК), так и потерю одной из его аллелей (потерю 
гетерозиготности). Такие находки указывают на присутствие 
клеточных клонов, содержащих измененную генетическую информацию, что характерно для опухолевых клеток. Анализ микросателлитной ДНК применяют при исследовании мочи у больных 
раком мочевого пузыря и гипернефромой, слюны при опухолях 
головы и шеи, панкреатического сока при раке поджелудочной 
железы, изучении пункционных аспиратов при раке молочной 
железы, мокроты при раке легкого [19, 30, 96].

В целом обнаружение в клинических образцах потери гете
розиготности и/или нестабильности микросателлитной ДНК 
указывает на присутствие клеток, несущих искаженную информацию, свойственную опухолевому росту [7].

Известно, что нормальные и опухолевые клетки различаются 

по экспрессии многих сотен генов, поэтому разработаны современные методы серийного анализа экспрессии, основанные на 
технологии микрочипов и позволяющие оценивать сотни и даже 
тысячи генов одновременно [30, 92].

Одним из новых перспективных молекулярных маркеров 

опухоли является телоизомераза, рибонуклеопротеиновый фермент, наращивающий нуклеотидные последовательности на концах хромосом (теломерах). Активность данного фермента постоянно присутствует в более чем 90% опухолей и практически не 
обнаруживается в нормальных тканях. 

ДНК-тестирование успешно применяется при различных на
следуемых опухолях: ретинобластоме, полипозе кишечника, множественных эндокринных опухолях второго типа (MEN2), а также гены предрасположенности к раку молочной железы и яичников BRCA I, BRCA II [28, 96, 120, 121, 175].

Внедрение современных методов молекулярной диагности
ки в широкую онкологическую практику неизбежно потребует 
серьезного технического перевооружения существующих клинических лабораторий и специально подготовленного персонала. 
Сами методы диагностики при этом должны пройти масштабные клинические испытания с учетом принципов рандомизации [30].

Несмотря на возможности, связанные с использованием пере
численных маркеров опухолевого роста, пока еще не существует 
абсолютно надежных методов ранней (досимптомной) диагностики опухолей. В преобладающем большинстве случаев врачам-онкологам приходится иметь дело с уже развившимися опухолями. И основными задачами лабораторной службы являются 
морфологическое подтверждение диагноза, установление гистоструктуры и гистогенеза опухоли, определение степени ее злокачественности, выявление метастатического поражения регио