Размножение плодовых и ягодных растений в культуре in vitro

ISBN 978-985-08-1952-9
© Институт плодоводства 
    НАН Беларуси, 2016 
© Оформление. РУП «Издательский 
    дом «Беларуская навука», 2016

УДК 634-153(476)

Размножение плодовых растений в культуре in vitro / Н. В. Кухарчик 

[и др.] ; под общ. ред. Н. В. Кухарчик. – Минск : Беларуская навука, 2016. – 
208 с. – ISBN 978-985-08-1952-9.

В монографии обобщены результаты многолетних исследований по размножению в куль
туре in vitro сортов и подвоев плодовых и ягодных культур, выращиваемых в Беларуси. 
Изложены общие вопросы работ со стерильной культурой растений и особенности выращивания in vitro конкретных генотипов яблони, груши, вишни, сливы, смородины черной и красной, крыжовника, малины летней и ремонтантной, ежевики, земляники садовой, голубики, 
брусники, клюквы, рябины, аронии черноплодной.

Предназначена для специалистов сельского хозяйства, преподавателей и студентов вузов.
Табл. 49. Ил. 143. Библиогр.: 363 назв.

А в т о р ы:

Н. В. Кухарчик, М. С. Кастрицкая, С. Э. Семенас, Е. В. Колбанова, 

Т. А. Красинская, Н. Н. Волосевич, О. В. Соловей, А. А. Змушко, Т. Н. Божидай, 

А. П. Рундя, А. М. Малиновская

Р е ц е н з е н т ы:

член-кореспондент НАН Беларуси, доктор биологических наук, 

профессор Ж. А. Рупасова

доктор биологических наук, доцент  О. В. Морозов

ВВЕДЕНИЕ

Потребность в высококачественных, свободных от патогенных вирусов 

саженцах для закладки базовых, маточных коллекций, а также промышленных 
плантаций в настоящее время велика. Одним из способов быстрого размножения сортов плодовых и ягодных растений является использование культуры 
изолированных тканей in vitro. Одновременно с этим наиболее перспективные 
способы оздоровления от вирусов основаны также либо на использовании непосредственно культуры тканей in vitro (апикальная меристема), либо на сочетании термотерапии и хемотерапии с культурой in vitro. Разработка и адаптация методик микроразмножения in vitro и последующего выращивания микрорастений ex vitro к сортименту плодовых и ягодных растений Беларуси 
позволяет не только своевременно размножать единичные экземпляры, но и включать технику in vitro в процесс оздоровления, депонирования, защиты от реинфицирования и безопасного обмена растительным материалом.

С другой стороны, необходимость разработки методик микроразмноже
ния определяется тем, что использование культуры in vitro в тиражировании 
плодовых и ягодных растений должно обеспечивать, кроме высокого коэффициента размножения, близкую к традиционным методам получения посадочного материала генетическую стабильность растений. 

Третьей составляющей, определяющей актуальность исследований, явля
ется перспективность создания генобанков вегетативно размножаемых культур с использованием, в том числе, криоконсервации, поскольку регенерация 
растений после длительного хранения базируется именно на этих методиках. 

Главной целью данной работы явилось обобщение методик микроразмно
жения, основанных на традиционных путях воспроизводства растений в естественных условиях, разработанных и адаптированных нами к белорусскому 
сортименту плодовых и ягодных растений.

Сотрудники отдела биотехнологии признательны коллегам с Научно-прак
тического центра НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству, 
с Гомельской и Брестской ОСХОС НАН Беларуси, Гродненского зонального 
института растениеводства НАН Беларуси, Института защиты растений, биологического факультета БГУ, Белорусской государственной сельскохозяйственной академии за совместную работу и апробацию результатов исследований. 

Авторы выражают благодарность кандидату сельскохозяйственных наук, 

первому руководителю лаборатории Малюкевич Майе Петровне, сотрудникам: 
Фоминой Елене Георгиевне, Жук Наталье Глебовне, Круглеевскому Михаилу 
Александровичу, Гашенко Ольге Александровне; огромную благодарность за 
совместную работу агрономам, лаборантам и инженерам отдела: Холохоренко 
Нелли Брониславовне, Гузей Марии Петровне, Найловец Нине Иосифовне, 
Тупичкиной Елене Геннадьевне, Кухаревой Клавдии Васильевне, Горбач Марии Михайловне, Умецкой Тамаре Александровне, Хрипач Светлане Славовне, Пивоварчик Инне Александровне, Савостиной Наталье Николаевне, 
Кирченко Анне Владимировне, Колядко Оксане Сергеевне, Бредневу Александру Александровичу, Подобеду Александру Владимировичу, Дедюле Валерию 
Антоновичу.

Глава 1

ПРИМЕНЕНИЕ КУЛЬТУРЫ IN VITRO

В РАБОТЕ С ПЛОДОВЫМИ И ЯГОДНЫМИ РАСТЕНИЯМИ

В настоящее время использование культуры тканей и органов in vitro имеет 

широкие перспективы и является частью большого перечня технологических 
операций в сельском хозяйстве. В плодоводстве культура тканей in vitro используется при:

освобождении от системных патогенов (вирусов, фитоплазм, бактерий), 

как отдельно, так и в комплексе с хемо- и термотерапией in vitro;

массовом размножении посадочного материала;
депонировании генотипов при нормальной и минимальной вегетации, со
здании коллекций;

регенерации растений после криоконсервации;
ускоренном размножении единичных экземпляров хозяйственно-полезных 

генотипов;

обмене растительным материалом с минимальными затратами на подтверж
дение карантинного соответствия.

Освобождение от системных патогенов. Основными способами форми
рования безвирусных коллекций плодовых и ягодных растений являются фитосанитарный отбор и последующее выделение здоровых растений из имеющихся насаждений, а также различного рода терапевтические мероприятия – 
оздоровление от вирусов в культуре апикальных меристем, термотерапия, 
хемотерапия и получение высококачественного маточного материала для дальнейшего вегетативного размножения растений. Выбор того или иного метода 
формирования коллекций основан на степени зараженности вирусами культур и сортов растений. При возможности прямого выделения безвирусных растений у плодовых и ягодных культур, оздоровление (как более дорогостоящее) 
не применяется. 

В тоже время большинство маточных насаждений клоновых подвоев пло
довых культур, земляники садовой и других ягодных растений в странах Западной Европы выращены с применением культуры in vitro, или оздоровлены 
с использованием апикальных меристем, термотерапии и хемотерапии. Это 
значительно снизило уровень инфицированности вирусными и вирусоподобными патогенами маточных и промышленных насаждений и уменьшило риск 
повторного инфицирования здоровых растений [1–5].

Метод оздоровления с использованием культуры апикальных меристем 

в настоящее время наиболее перспективный и эффективный с фитосанитарной 

и фитотерапевтической точек зрения, так как обладает определенной универсальностью. Использование культуры изолированных апексов приводит к комплексному оздоровлению растений, позволяет в значительной степени освободиться от вирусных, бактериальных, грибных заболеваний и нематодных инвазий [6–10]. Элиминация вирусных болезней методом культуры меристем 
является, по-прежнему, одним из самых интересных направлений применения 
культуры ткани in vitro. 

Основной причиной возможности оздоровления растений от вирусных ин
фекций методом культивирования меристематических верхушек P. Boxus
и P. Druart [11] считают наличие градиента концентрации вирусных частиц 
в тканях растений. Количество вирусов в растении увеличивается в направлении от молодой ткани к старой, а апикальные ткани зараженных вирусами растений практически не содержат вирусных частиц и, соответственно, не передают их при введении в культуру in vitro.

По мнению В. А. Высоцкого [6], освобождение растений от вирусов имеет 

несколько предположительных механизмов: отсутствие в зоне апикальной меристемы проводящей системы, что обеспечивает снижение скорости распространения вирусов в меристематических клетках; ингибирование репликации 
вирусов биологически активными веществами ауксиновой, цитокининовой 
или иной природы, находящимися в питательной среде; ингибирование вирусов в процессе культивирования на питательных средах; взаимодействие всех 
вышеназванных механизмов элиминации вирусных частиц.

Электронно-микроскопические исследования показали наличие для каж
дой пары взаимодействующих компонентов «растение–вирус» характерного 
апикального иммунитета, который и определяет оптимальный размер выделяемого экспланта: от 0,1–0,3 мм, если только самые крайние клетки не содержат 
вирус, до 0,5–3,0 мм, если «чистая» зона является достаточно крупной [12–14].

В то же время существует возможность получения безвирусных растений 

из клеток, содержащих вирус. В качестве возможных версий оздоровления 
тканей, содержащих вирусы, рассматривается возможное соперничество при 
синтезе нормальных и вирусных нуклеотидов, присутствие экзогенных ингибиторов в питательной среде и метаболический разрыв, происходящий из-за 
повреждения клеток при выделении экспланта [12, 14].

Степень успеха в элиминации вируса непосредственно связана с размером 

выделяемых эксплантов. L. Navarro [15] достиг 100% уничтожения вирусов, 
когда выделял апекс не более чем с двумя листовыми примордиями (0,1–0,15 мм). 
Авторы также указывают на различную эффективность культивирования апикальных меристем различных видов при освобождении от разных вирусов. Так, 
при замене термотерапии винограда (эффективность устранения вирусов – 
27,3%) на культуру меристем, в среднем 80,4% регенерировавших растений 
оказывались свободными от вирусов [16]. Результативность при оздоровлении 
персика от вируса Шарки и от вируса некротической кольцевой пятнистости – 
72 и 57% соответственно. P. Boxus и P. Druart [11] показали, что успех в элими

нации вирусов больше зависит от вируса, чем от вида растения. На различную 
степень элиминации вирусов у разных растений указывают и другие авторы. 
M. Barda, L. Martino, F. Lauretti [17] отмечают, что клональное микроразмножение с успехом применяется для элиминации PPV, ACLSV, PDV, PNRV, 
ApMV из растений сливы, персика и миндаля различных сортов, однако является неодинаково эффективным методом при освобождении разных растений 
от определенных вирусов.

Необходимо отметить, что и при использовании культуры in vitro эффект 

оздоровления от вирусов достигается не всегда. Основными причинами, определяющими неполное удаление вирусов, являются слишком маленькая зона 
апикального иммунитета для пары растение–вирус, недостаток дифференцирования в течение культуры ткани апексов малых размеров, слабое укоренение 
растений после культуры in vitro. Две последние причины определяются недостаточной разработанностью методических рекомендаций по культивированию видов in vitro. Но в целом выращивание посадочного материала с использованием культуры апикальных меристем позволяет в значительной степени 
оздоровить получаемый посадочный материал плодовых и ягодных растений. 
По мнению И. В. Жарковой [5], только применение оздоровления земляники методом верхушечных меристем дало увеличение урожайности в среднем на 20%.

Исследования J. M. Deogratias с соавторами [18] показывают, что можно 

устранить вирусы черешни путем длительного культивирования in vitro на 
среде, богатой гормонами. Возможно, гормональная насыщенность культуральной среды увеличивает конкурентоспособность клетки в борьбе с вирусом.

Об успешном применении апикальных меристем в освобождении плодо
вых растений от вирусов сообщают W. Hurt, H. Krczal, L. Kunze [19] (яблоня), 
J. Vertesy [20] (персик).

Депонирование генотипов при нормальной и минимальной вегетации, 

создание коллекций. Депонирование сортов и гибридов плодовых и ягодных 
растений в культуре in vitro используется для:

создания коллекций генотипов и длительного их хранения на минималь
ных площадях; 

предотвращения реинфицирования оздоровленных коллекций и, соответст
венно, сокращения периодических тестирований на зараженность вирусами;

массового размножения растений с использованием микроразмножения, 

исключая самый медленный этап – введение в культуру in vitro;

обмена растительным материалом с минимальными затратами на под
тверждение карантинного соответствия;

периодического возобновления коллекций ex vitro.
В зависимости от температур выделяются длительное культивирование 

при температурах, обеспечивающих нормальную вегетацию растений (+20 – 
+25 ºС); хранение при пониженных температурах, обеспечивающих минимальную вегетацию (+5 – +8  ºС). 

Хранение коллекций в условиях минимальной вегетации in vitro характе
ризуется сведением к минимуму числа пассажей, снижением темпов роста 
и старения культуры. Для того чтобы избежать частых пересадок растений 
in vitro, используются условия, которые, с одной стороны, ограничивают рост 
регенерантов, с другой – обеспечивают высокую сохранность и способность 
к росту, размножению и укоренению после окончания периода депонирования.

Массовое размножение посадочного материала. Для многих ягодных 

растений и клоновых подвоев отмечено значительное увеличение вегетативной продуктивности после прохождения растений через культуру in vitro, без 
других оздоровительных процедур. Отмеченная закономерность согласуется 
с многолетними исследованиями зарубежных ученых и практическими результатами. 

Использование современных технологий массового тиражирования расте
ний на искусственных питательных средах, в том числе биореакторов, искусственных субстратов и т. д., приводит к тому, что себестоимость размножаемых in vitro растений снижается и, с учетом высокого качества получаемой 
продукции, ее цена устраивает покупателя. 

Размножение на основе индукции прямого органогенеза из тканей мате
ринского растения является наиболее перспективным при размножении in vitro,
а наиболее удобным объектом для прямого органогенеза служат вегетативные 
почки растений, поскольку именно в них содержатся основные зачатки органов растений, представленные наименее специализированной меристематической тканью. Вегетативные почки могут вводиться in vitro как целыми с почечными чешуями и без, на одревесневших и неодревесневших черенках, так 
и в виде изолированных меристем. 

Органогенез растения в культуре in vitro при этом происходит практиче
ски так же, как in vivo, за исключением того, что с повышением в культуре 
in vitro концентрации веществ цитокининовой группы, по сравнению с естественной в растении, инициируется развитие не только верхушечной меристемы, 
но и конгломерата микропобегов. Снятие апикального доминирования путем 
формирования побегов с относительно укороченными междоузлиями, инициация развития пазушных почек и меристематических бугорков, которые дают 
начало новым побегам, рекультивируемым с теми же результатами, является 
наиболее универсальной моделью прямого органогенеза in vitro, и имеет хорошую воспроизводимость в пределах широкого набора видов растений. Метод 
является наиболее надежным при производстве посадочного материала плодовых и ягодных культур in vitro. Тем не менее каждая культура в процессе 
органогенеза имеет свои особенности и предъявляет определенные требования к составу питательных сред по минеральным компонентам, углеводам, 
фитогормонам и их концентрациям, физическим условиям культивирования 
на различных этапах.

С технической точки зрения, процесс размножения плодовых и ягодных 

культур in vitro можно разделить на несколько этапов: изоляция и стерилизация 

экспланта, создание условий для его роста на питательной среде (т. е. инициация культуры in vitro); максимальное увеличение количества микрорастений, 
(собственно микроразмножение); укоренение размноженных побегов; возврат 
растений из условий in vitro в условия ex vitro (адаптация регенерантов).

Промышленное использование методов культуры ткани для вегетативно
го размножения растений впервые начато более 30 лет назад. G. Morel [21] 
применил вегетативное размножение in vitro орхидей взамен семенному размножению. В настоящее время с использованием метода клонального микроразмножения (культуры ткани и клетки) в мире получают более 200 миллионов растений в год. Особенно широкое распространение микроразмножение 
получило у декоративных, затем плодовых деревьев и ягодных кустарников. 
В странах ЕС количество лабораторий, занимающихся промышленным размножением плодовых растений за последнее время значительно увеличилось 
и достигло по Prunus – 57; Fragaria – 19; Malus – 18; Actinidia – 17; Rubus – 16 
[22, 23].

Литература

1. Effect of in vitro propagation on field performance of two strawberry cultivars / S. N. Nehra 

[et al.] // Euphytica. – 1994. – Vol. 76. – P. 107–115. 

2. Cameron, J. S. Enhanсed vigor in vegetative progeny of micropropagated strawberry plants / 

J. S. Cameron, J. F. Hancock, J. A. Flore // Hort. Sci. – 1986. – Vol. 21. – P. 1225–1226.

3. Cameron, J. S. The field performance of strawberry nursery stock produced originally from 

runners of micropropagation / J. S. Cameron, J. F. Hancock, T. M. Nourse // Adv. Strawberry product. –
1985. – Vol. 4. – P. 56–58.

4. Составляющие потенциала возможной продуктивности маточных растений земляни
ки / Н. Ю. Джура [и др.] // Промышленное производство оздоровленного посадочного материала 
плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур: материалы Междунар. науч.-практ. конф., 
Москва, 20–22 ноября 2001 г. / Рос. Акад. с.-х. наук. ВСТИСП. – М., 2001. – С. 113–117.

5. Жаркова, И. В. Микроклональное размножение земляники // Интенсификация возде
лывания ягодных культур: межвуз. сб. науч. тр. / Ленингр. с.-х. ин-т. – Л., 1988. – С. 41–45.

6. Высоцкий, В. А. Культура изолированных тканей и органов плодовых растений: оздо
ровление и микроклональное размножение / В. А. Высоцкий // С.-х. биология. – 1983. – № 7. – 
С. 42–46.

7. Осипов, Ю. В. Производство оздоровленного посадочного материала земляники / 

Ю. В. Осипов, М. И. Джигадло // Плодоовощное хозяйство. – 1987. – Т. 5. – С. 20–21.

8. Приходько, Ю. Н. Совершенствование технологии оздоровления яблони от латентных 

вирусов / Ю. Н. Приходько, Д. Н. Редин., В. И. Кашин // Плодоводство и ягодоводство России: 
сб. науч. работ / ВСТИСП – М., 2000. – Т. VII. – С. 89–101.

9. Высоцкий, В. А. Клональное микроразмножение и оздоровление растений и декора
тивных кустарников / В. А. Высоцкий // Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве: сб. науч. тр. / ВНИИС им. И. В. Мичурина. – Мичуринск, 1989. – С. 3–8.

10. Walkey, D. G. A. Production of virus-free plants / D. G. A. Walkey // Applied Plant Virology. 

John Wiley & Sons: New York. – 1991. – P. 270–292.

11. Boxus, P. Chapter II Virus-Free Trees Through Tissue Culture / P. Boxus, P. Druart // 

Biotechnology in Agriculture and Forestry. – 1986. – Vol. 1. – P. 24–30.

12. Mellor, F. C. Development of excised potato buds in nutrient culture / F. C. Mellor, R. Stace
Smith // Can. J. Bot. – 1969. – Vol. 47. № 10. – P. 1617–1621.

13. Spiegel, S. Recent Developments in Therapy and Virus-Detection Procedures for International 

Movement of Clonal Plant Germ Plasm / S. Spiegel, E. A. Frison, R. H. Converse // The American 
Phytopathological Society Plant Disease. – 1993. – Vol. 77, № 12. – P. 176–180.

14. Stace-Smith R. Virus-free clones through plant tissue culture // Comprehensive Biotechno
logy: The Principles, Applications and Regulations of Biotechnology in Industry, Agricul ture, and 
Medicine / M. Moo-Young (ed.), Oxford, England. Pergamon Press. – 1985. – P. 69–179.

15. Navarro, L. Application of shoot-tip grafting in vitro to woody species / L. Navarro // Acta 

Hortic. – 1988. – V. 227. – P. 43–55.

16. Bariass, M. Elimination of stem pitting and corky bark disease from grapevine by fragmented 

shoot apex culture / M. Bariass // Ann. Appl. Biol. – 1987. – № 110. – P. 653–656.

17. Barda, M. Comparison of different methods to produce virus free stone fruits / M. Barda, 

L. Martino, F. Lauretti // Acta Horticulture. – 1992. – № 309. – P. 385–392.

18. Deogratias, J. M. Eradication of prune dwarf virus, prunus necrotic ringspot virus, and apple 

chlorotic leaf spot virus in sweet cherries by a combination of chemotherapy, thermotherapy, and 
in vitro culture / J. M. Deogratias, F. Dosba, A. Lutz // Can. J. Plant Pathol. – 1989. – Vol. 11, № 4. – 
P. 337–342.

19. Hurt, W. H. Jahresber. Biol. Bundesanst. Land – und Forstwirtsch / W. Hurt, H. Krczal, 

L. Kurze // Berlin und Braunshweig, 1979. – S. 60.

20. Vertesy, J. Plant Virology / J. Vertesy // Proc. 9th Conf. CS Plant Virologists. – Bruno. – 1981. – 

S. 197–200.

21. Morel, G. 1964 Tissue culture; a new means of clonal propagation of orchids / G. Morel // 

Orhid Soc. Bull. – Vol. 31. – P. 473–478.

22. Reuther, G. Carrent status and future prospects of large scale micropropagation in commercial 

plant prodacion / G. Reuther // Food Biotechnology, 1990. P. 445–459. 

23. Reuther, G. Comparative anatomical and physiological studies with ornamentals plants under 

in vitro and greenhouse conditions / G. Reuther // Acta Horticulturae. – 1988. – P. 91–98.