Эффект мезенхимальных стволовых клеток при клеточной терапии рассеянного склероза

УДК 616.832-004-085.37

Зафранская, М. М. Эффект мезенхимальных ство ловых кле
ток при клеточной терапии рассеянного склероза / М. М. Зафранская, А. С. Федулов, Ю. Е. Демидчик. – Минск : Беларуская 
навука, 2016. – 213 с. – ISBN 978-985-08-1978-9.

В монографии представлен методологический подход к in vitro и in vivo

оценке иммуномодулирующих свойств мезенхимальных стволовых клеток 
при использовании клеточных культур для иммунотерапии рассеянного 
склероза.

Предназначена для специалистов в области клеточных технологий, им
мунологов, нейроиммунологов, неврологов, трансплантологов, биологов.

Табл. 23. Ил. 33. Библиогр.: 365 назв.

Р е ц е н з е н т ы: 

доктор медицинских наук, профессор М. П. Потапнев,

доктор медицинских наук, профессор С. А. Лихачев 

ISBN 978-985-08-1978-9 
 
 
 
 
 
© Зафранская М. М., Федулов А. С., 

Демидчик Ю. Е., 2016

© Оформление. РУП «Издательский дом 

«Беларуская навука», 2016

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

Аг 
- антиген

АИЗ 
- аутоиммунные заболевания

Ат 
- антитело

АПК 
- антиген-презентирующие клетки

АуТМСК 
- аутологичная трансплантация мезенхимальных стволовых клеток

ГЭБ 
- гематоэнцефалический барьер

ДНК 
- дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЛ 
- интерлейкин

ИЛ-1Ra 
- антагонист рецептора ИЛ-1

ИФН 
- интерферон

k 
– коэффициент супрессии

Кон А  
- конканавалин А

ЛПС 
- липополисахарид

МАТ 
- моноклональное антитело

МОГ 
- миелин-олигодендроцитарный гликопротеин

МПК 
- мононуклеары периферической крови

МСК 
- мезенхимальная стволовая клетка

НК-клетки - натуральные киллерные клетки
НСК 
- невральная стволовая клетка

ОБМ 
- основной белок миелина

ОКТ 
- оптическая когерентная томография

ПГE2
- простагландин Е2

ПЛП 
- протеолипидный протеин

рМОГ1-125
- рекомбинантный миелин-олигодендроцитарный гликопротеин 

                             с аминокислотной последовательностью 1-125
МРТ 
- магнитно-резонансная томография

РНК 
- рибонуклеиновая кислота

РС 
- рассеянный склероз

РТПХ 
- реакция «трансплантат против хозяина»

СПНВ 
- слой периферических нервных волокон

sФНО-R 
- растворимый рецептор ФНО-a

ТКР 
- Т-клеточный рецептор

ТReg
- регуляторные Т-клетки

ТРФ-b
- трансформирующий ростовой фактор b

Tх 
- Т-лимфоциты хелперы

ФГА 
- фитогеммагглютинин

ФНО-a
- фактор некроза опухоли-a

ФРФ-b
- фактор роста фибробластов

цАМФ 
- циклический аденозин монофосфат

ЦИК 
- циркулирующие иммунные комплексы

ЦНС 
- центральная нервная система

ЦТЛ 
- цитотоксические лимфоциты

ЭАЭ 
- экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит

ЭК 
- эндотелиальная клетка

bFGF 
- fibroblast growth factor b (фактор роста фибробластов b)

CD 
- сluster of differentiation (дифференцировочный антиген)

CFSE 
- 5-(и -6)-карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидил эфира

СOX 
- сyclooxygenase (циклооксигеназа)

CTLA-4 
- сytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4

DAMPs 
- damage-associated molecular patterns

EDSS 
– Expanded Disability Status Scale (шкала инвалидизации)

FDA 
- Food and Drug Administration

GM-CSF 
- гранулоцит/макрофагальный колониестимулирующий фактор

HGF 
- нepatocyte growth factor (фактор роста гепатоцитов)

HLA 
- human leukocyte antigen (человеческий лейкоцитарный антиген)

ICAM-1 
- intercellular adhesion molecule 1 (молекула межклеточной адгезии 1)

IDO 
- indoleamine-2,3-dioxygenase (индолеамин-2,3-диоксигеназа)

Ig 
- immunoglobulin (иммуноглобулин)

МНС 
- major histocompatibility complex (главный комплекс гистосов
                          местимости)
MMPs 
- matrix metalloproteinases (матричные металлопротеиназы)

MOG 
- myelin oligodendrocyte glycoprotein (миелиновый олигодендро- 

                          цитарный гликопротеин)
NF-kB 
- nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cell

NLR 
- nucleotid-binding oligomerization domain-like receptor

NO 
- nitric oxide (оксид азота)

NPCs  
- neural progenitor cells (нейральные клетки-предшественники)

OPCs 
- olygodendrocyte progenitor cells (клетки-предшественники оли
                          годендроцитов)
PAMPs 
- pathogen-associated molecular patterns

PD-L1 
- programmed cell death ligand-1

PDGF 
- platelet-derived growth factor (тромбоцитарный ростовой фактор)

PRRs 
- pattern recognition receptors (паттерн-распознающие рецепторы)

SDF-1  
- stromal cell-derived factor-1 (стромальный клеточный фактор-1)

TLRs  
- Toll-like receptors (Толл-подобные рецепторы)

TSG 
- tumor necrosis alpha-stimulating gene (ген фактора некроза опу
                          холи альфа)
VCAM-1  
- vascular-cell adhesion molecule 1 (сосудисто-эндотелиальная мо ле
                            кула адгезии 1)
VEGF 
- vascular endothelial growth factor (сосудисто-эндотелиальный

                          фактор роста)
VLA-4 
- very late antigen 4

ВВЕДЕНИЕ

Рассеянный склероз (РС) рассматривается как аутоиммун
ное заболевание центральной нервной системы (ЦНС) с выраженными воспалительным, миелин- и аксон-дегенеративным 
компонентами [126, 312]. РС представляет собой одну из наиболее социально и экономически значимых проблем современной 
нейроиммунологии и неврологии. Заболевание развивается преимущественно у молодых лиц в возрасте от 18 до 50 лет и при 
отсутствии адекватного лечения приводит к значимым нарушениям неврологических функций и ранней инвалидизации [14, 
125, 141]. В основе патогенеза РС лежат иммунологические процессы, связанные с нарушением регуляторной функции иммунной системы, активацией миелин-специфических клонов как 
CD4+, так и CD8+ Т-лимфоцитов с фенотипом клеток-памяти 
(СD45RO+), а также с функциональным изменением профиля 
минорных популяций лимфоцитов периферической крови [118, 
354]. В связи с этим новые подходы к терапии РС должны заключаться в отмене иммуномедиированного повреждения посредством модулирования или индукции толерантности в сочетании с обеспечением защиты ткани ЦНС и, в идеале, с поддержкой 
функциональной регенерации как невральных клеток, так и процессов ремиелинизации [80].

Используемые при данной патологии кортикостероиды, им
муномодуляторы, иммуносупрессанты и методы эфферентной 
терапии не дают продолжительного, устойчивого эффекта, а существующие направления селективной антиген-специфической 
иммунотерапии, основанные на применении модифицированных 
пептидных лигандов, ДНК- и Т-клеточной вакцинации, не всегда 

являются эффективными [75, 106, 148, 252, 286, 317]. Отсутствие 
оптимальных протоколов лечения РС, направленных на подавление аутореактивных клонов Т-лимфоцитов и восстановление поврежденных участков ЦНС, объясняет всевозрастающий интерес исследователей к использованию иммуномодулирующих 
и нейропротективных свойств мезенхимальных стволовых клеток [80, 329, 331].

Мезенхимальные стволовые/стромальные клетки (МСК) пред
ставляют собой гетерогенную популяцию постнатальных клеток-предшественников стромального происхождения (мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки). МСК могут 
быть выделены из различных тканей организма и наряду с регенеративным потенциалом обладают выраженными как in vitro, 
так и in vivo иммуномодулирующими свойствами [80, 239, 305, 
326, 329]. Кроме того, МСК обладают большей степенью пластичности по сравнению с другими популяциями стволовых 
клеток, в том числе способностью дифференцироваться in vitro
в клетки немезодермального типа, такие как нейроны и астроциты. Однако до сих пор остается дискутабельным, является ли 
клиническое улучшение заболеваний следствием клеточного замещения олигодендроцитов, последующей активации ремиелинизации и защиты аксонов или это результат иммунологических 
эффектов [27, 133, 239]. Накопленная информация свидетельствует о том, что в основе терапевтического эффекта при введении МСК в случае РС или его экспериментальной модели (экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита) лежат следующие механизмы: 

а) нейропротективное действие, обусловленное взаимодей
ствием трансплантированных МСК с клетками реципиента либо 
секрецией ростовых факторов; 

б) иммуномодулирующее воздействие, наблюдаемое как при 

системном, так и при локальном введении; 

в) ремиелинизация поврежденных участков ЦНС за счет функ
циональной активности трансплантированных клеток [360, 364].

Генетическая стабильность, пролиферативный потенциал, 

способность к миграции в область повреждения ткани, иммуно

супрессивные свойства и отработанные протоколы выделения 
и культивирования МСК являются основными преимуществами 
для успешного проведения как аутологичной, так и аллогенной 
трансплантации. Результаты клинических исследований по применению МСК у пациентов с РС указывают на эффективность 
и безопасность данного метода лечения [71, 72, 165, 166]. Тем не 
менее успешное применение клеточной терапии при РС возможно только после глубокого изучения и понимания биологии, взаимодействия с локальным микроокружением и использования 
МСК (доза, пути и кратность введения, миграция клеток в органы и ткани организма и др.). Следует также усовершенствовать 
критерии включения пациентов и идентификацию потенциальных иммунологических маркеров терапевтической эффективности [132, 332].

Одна из целей базисного исследования биологии МСК за
ключается в создании in vivo и in vitro аналитических систем. 
При этом, несмотря на огромное количество работ, посвященных изучению иммуномодулирующих свойств МСК, не определена взаимосвязь между выявляемыми эффектами МСК in vitro
и их эффектами in vivo, что объясняется отсутствием универсального общепринятого in vitro метода определения потенциального терапевтического эффекта МСК in vivo [305]. Кроме 
того, при исследовании in vivo иммунный статус опосредуется 
множеством эндогенных и экзогенных факторов, что создает 
проблему оценки функционального состояния отдельных пулов 
аутореактивных клеток при РС.

Важным этапом патогенетической терапии является разра
ботка критериев, которые позволят оценить иммуномодулирующее действие вводимых клеточных культур на иммунный ответ 
реципиента. В настоящее время описаны гуморальные и лигандрецепторные взаимодействия, опосредующие супрессорный/регуляторный эффект МСК [239, 243]. В то же время изменения 
функциональной активности лимфоцитов после клеточной терапии оцениваются по узкому спектру параметров c преимущественным анализом экспрессии активационных маркеров на 
Т-лимфоцитах и дендритных клетках в ранние сроки посттранс

плантационного периода [72, 165]. В связи с этим для оценки регуляторного эффекта МСК in vivo на течение аутоиммунного 
процесса при РС необходимо создание адекватной in vitro модели МСК-индуцированной иммуносупрессии с патогенетическим обоснованием маркеров, которые позволят оценить иммуномодулирующий эффект клеточной терапии. Предварительная in vitro
оценка иммуносупрессивного потенциала МСК у пациентов с РС 
может представлять собой исключительный интерес с точки 
зрения разработки специфических методов диагностики и индивидуализации терапевтического протокола. 

В данной монографии проведен анализ современных дости
жений в области изучения иммунорегуляторного потенциала 
МСК и применения клеточной терапии для лечения заболеваний с выраженным воспалительным компонентом. Представлены результаты изучения иммуномодулирующих свойств МСК 
пациентов с РС, а также предложен методологический подход 
к оценке эффективности клеточной терапии у пациентов с РС, 
основанный на определении миелин-стимулированной пролиферации Т-лимфоцитов и изменении поверхностного фенотипа 
клеток после аутологичной трансплантации МСК.

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ 
КЛЕТОЧНОЙ ИММУНОТЕРАПИИ 
РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА

1.1. Иммунопатогенез рассеянного склероза. 
Роль Т-лимфоцитов

Рассеянный склероз (РС) – комплексное мультифак
ториальное хроническое прогрессирующее воспалительно-дегенеративное заболевание центральной нервной системы (ЦНС) 
с генетической предрасположенностью и вовлечением клеток 
иммунной системы в развитие патологического процесса. Ассоциация заболевания с генами главного комплекса гистосовместимости (MHC), наличием клеточных инфильтратов в ЦНС, 
возможность создания экспериментальной модели болезни, а также хороший эффект иммуносупрессивной терапии свидетельствуют о ведущей роли аутоиммунных процессов в патогенезе 
РС. Для РС характерно нарушение баланса между регуляторными и потенциально миелин-реактивными клонами Т-лимфоцитов 
с последующим развитием специфического Т-клеточного иммунного ответа, эффекторные реакции которого повреждают 
ком поненты миелиновой оболочки аксонов [125, 126, 305].

РС является наиболее социально и экономически значимой 

проблемой современной неврологии, развивается преимущественно у молодых лиц (18–50 лет). Республика Беларусь относится к зоне повышенного риска PC с распространенностью заболевания свыше 30 случаев на 100 000 населения [5, 6, 10].

Патофизиологически РС проявляется разрушением миелин/

олигодендроцитарного комплекса, а также нейрональной и аксональной дегенерацией. Выделяют 4 клинические формы РС: 
рецидивно-ремиттирующая, первично-прогрессивная, вторичнопрогрессивная и прогредиентно-ремиттирующая. Наиболее часто 
встречается рецидивно-ремиттирующая форма, которая начина
Г л а в а
1

ется с единичной или мультифокальной демиелинизирующей 
атаки, определяемой клинически как изолированный синдром. 
Воспалительные механизмы доминируют на ранних стадиях заболевания и коррелируют с обострением и результатами нейровизуализации (магнитно-резонансная томография (МРТ)). Несмотря на наличие внутренних репаративных процессов при РС, 
у большинства пациентов они не могут компенсировать развивающиеся повреждения нервной ткани [234]. В течение последующих 10 лет рецидивно-ремиттирующая форма, как правило, 
превращается во вторично-прогрессивную с превалированием 
нейродегенеративных процессов над воспалительными, что при водит к прогрессирующей инвалидности.

Формирующиеся в процессе возникновения и развития РС 

патоморфологические изменения структур ЦНС проявляются 
очагами демиелинизации, так называемыми бляшками. Очаги 
демиелинизации связаны с разрушением миелиновой оболочки 
проводящих путей ЦНС, что и обусловливает быстрое развитие 
и стойкий характер очаговых неврологических расстройств, характерных для прогредиентного течения РС. Одновременно 
с демиелинизацией по краям бляшки в ряде случаев могут идти 
процессы ремиелинизации, обусловливающие ремиттирующее 
течение заболевания, однако чаще всего они незначительно выражены, и восстановление миелиновой оболочки по интенсивности и скорости несопоставимо с ее распадом. Запущенные патоиммунохимические дисрегуляции, вызванные особенностями 
системного и нейронального метаболизма при прогредиентном 
течении РС, крайне редко самостоятельно поддаются обратному 
развитию, приводя к стойкой инвалидизации пациентов.  

Этиопатогенез РС многокомпонентный и включает комбина
цию факторов генетической предрасположенности и окружающей среды. Среди ассоциированных с заболеванием генов выделяют антигены гистосовместимости 2-го класса (MHC II) 
(HLA-DRB1)*1501 и (HLA-DRB5)*0101 аллели, аллели рецептора ИЛ-2 и ИЛ-7, что и подразумевает наличие генетической 
предрасположенности к заболеванию. Предположительно мутации 
генов рецептора интерлейкина-1 (ИЛ-1) и антагониста рецепто