Биотехнология

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

Департамент научно-технологической политики и образования

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего образования

«Волгоградский государственный аграрный университет»

Кафедра «Ветеринарно-санитарная экспертиза, заразные болезни 

и морфология»

С.А. Акимова
Г.М. Фирсов

БИОТЕХНОЛОГИЯ

Практикум

Издание 2-е дополненное и переработанное

Волгоград

Волгоградский ГАУ

2018

УДК 573.6
ББК 30.16
А-39

Рецензенты:

кандидат ветеринарных наук, главный государственный ветеринарный инспектор, старший консультант инспекторского отдела комитета 
ветеринарии Волгоградской области Ю.А. Горькавский; кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры «Акушерство и терапия» ФГБОУ 
ВО Волгоградский ГАУ С.П. Перерядкина

Акимова, Светлана Александровна

А-39 Биотехнология: практикум / С.А. Акимова, Г.М. Фирсов. – Изд. 
2-е дополненное и переработанное. – Волгоград: ФГБОУ ВО Волгоградский ГАУ, 2018. – 144 с.

Даны рекомендации по выполнению лабораторных работ по 

дисциплине «Биотехнология», приведены содержание и цель лабораторных работ по дисциплине, даны рекомендации по их выполнению, 
тест-вопросы по дисциплине, а также задания и контрольные вопросы.

Для студентов факультета биотехнологий и ветеринарной меди
цины.

УДК 573.6
ББК 30.16

© ФГБОУ ВО Волгоградский 
ГАУ, 2018
© Акимова С.А., Фирсов Г.М., 
2018 

ВВЕДЕНИЕ

Биотехнология – дисциплина, изучающая возможности исполь
зования живых организмов, их систем или продуктов их жизнедеятельности для решения технологических задач, а также возможности 
создания живых организмов с необходимыми свойствами методом 
генной инженерии.

В традиционном, классическом, понимании биотехнология – это 

наука о методах и технологиях производства различных ценных веществ и продуктов с использованием природных биологических объектов (микроорганизмов, растительных и животных клеток), частей 
клеток (клеточных мембран, рибосом, митохондрий, хлоропластов) и 
процессов.

Корни биотехнологии уходят в далёкое прошлое и связаны с 

хлебопечением, виноделием и другими способами приготовления пищи, известными человеку еще в древности. Например, такой  биотехнологический процесс, как брожение с участием микроорганизмов, 
был известен и широко применялся еще в древнем Вавилоне, о чем
свидетельствует описание приготовления пива, дошедшее до нас виде 
записи на дощечке, обнаруженной в 1981 г. при раскопках Вавилона.

Наукой биотехнология стала благодаря исследованиям и рабо
там французского ученого, основоположника современной микробиологии и иммунологии Луи Пастера (1822-1895).

В ХХ веке происходило бурное развитие молекулярной биоло
гии и генетики с применением достижений химии и физики. Важнейшим направлением исследований явилась разработка методов культивирования клеток растений и животных. И если еще совсем недавно 
для промышленных целей выращивали только бактерии и грибы, то 
сейчас появилась возможность не только выращивать любые клетки 
для производства биомассы, но и управлять их развитием, особенно у 
растений. Таким образом, новые научно-технологические подходы 
воплотились в разработку биотехнологических методов, позволяющих 
манипулировать непосредственно генами, создавать новые продукты, 
организмы и изменять свойства уже существующих. Главная цель 
применения этих методов – более полное использование потенциала 
живых организмов в интересах хозяйственной деятельности человека.

1 ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ПРОИЗВОДСТВЕННЫМИ 

ЛИНИЯМИ И ТЕХНОЛОГИЯМИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ 

ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ. БИОПРЕДПРИЯТИЯ

Цель занятия

Ознакомиться с производственными линиями и технологиями 

изготовления получения биопрепаратов. Изучить типы биопредприятий, их устройство и режимы работы.

Оборудование и материалы

Таблицы-схемы устройства, журнал регистрации студентов, по
лучавших инструктаж по технике безопасности, документация лаборатории и основные утвержденные инструкции по правилам работы 
на биопредприятиях, мультимедийное оборудование, презентации MS
Office Power Point по теме занятия.
Методика проведения занятия и методические указания по теме

Инструктаж и роспись в журнале по технике безопасности.

Объяснение преподавателя

Цели и задачи производственных линий и технологий изготов
ления и получения биопрепаратов.

1.1 Технологические основы биотехнологических производств

Важнейшей задачей любого биотехнологического процесса яв
ляется разработка и оптимизация научно-обоснованной технологии и 
аппаратуры для него. При организации биотехнологических производств частично был заимствован опыт развитой к тому времени химической технологии. Однако биотехнологические процессы имеют 
существенное отличие от химических, в силу того, что в биотехнологии используют более сложную организацию материи – биологическую. Каждый биологический объект (клетка, фермент и т. д.) – это 
автономная саморегулирующаяся система. Природа биологических 
процессов сложна и далеко не выяснена окончательно. Для микробных популяций, например, характерна существенная гетерогенность 
по ряду признаков – возраст, физиологическая активность, устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды. Они также 
подвержены случайным мутациям, частота которых составляет от 10-4

до 10-8. Гетерогенность также может быть обусловлена наличием поверхностей раздела фаз и неоднородностью условий среды.

В общем виде любой биотехнологический процесс включает три 

основные стадии: предферментационную, ферментационную и 
постферментационную.

Принципиальная схема реализации биотехнологических процес
сов в общем виде может быть представлена блок-схемой, в которой 
сделана попытка охватить все варианты ферментационных процессов 
(рис. 1).

Рисунок 1 – Принципиальная схема реализации биотехнологических 

процессов (по У. Э. Виестур и др., 1987): 

1 – реактор для приготовления сред, 2 – вихревой насос, 3 – аппарат 
для приготовления твердых сред, 4 – паровая колонка для подогрева 

сред до температуры стерилизации, 5 – выдерживатель сред 

при температуре стерилизации, 6 – теплообменник для охлаждения 

сред, 7 – мерник-сборник питательной среды, 8 – дозатор, 

9 – анаэробный ферментер, 10 – глубинный аэробный ферментер, 

11 – биокаталитический реактор, 12 – ферментер для поверхностной 
твердофазной ферментации, 13 – то же для поверхностной жидкостной
ферментации, 14 – экстрактор, 15 – сепаратор для отделения биомассы,
16 – система локальной автоматики, 17 – плазмолизатор биомассы, 

18 – дезинтегратор биомассы, 19 – выпарная установка, 

20 – фракционирование дезинтегратов, 21 – сушилка и другие аппараты

для обезвоживания, 22 – аппаратура для расфасовки продукта, 

23 – ионообменные колонны, аппараты для химических и мембранных 

методов выделения, центрифуги, фильтры, кристаллизаторы 

и др. устройства

Условные обозначения: рН – раствор для коррекции рН, П –

компоненты и среды для подпитки, Пос – посевной материал, В –
сжатый воздух, ПАВ – пеногаситель, Ср – стерильная питательная 
среда, БА – биологический агент.

На предферментационной стадии осуществляют хранение и 

подготовку культуры продуцента (инокулята), получение и подготовку питательных субстратов и сред, ферментационной аппаратуры, 
технологической и рециркулируемой воды и воздуха. Поддержание и 
подготовка чистой культуры является очень важным моментом предферментационной стадии, так как продуцент, его
физиолого
биохимические характеристики и свойства определяют эффективность всего биотехнологического процесса.

В отделении чистой культуры осуществляют хранение произ
водственных штаммов и обеспечивают их реактивацию и наработку 
инокулята в количествах, требуемых для начала процесса. При выращивании посевных доз инокулята применяют принцип масштабирования, то есть проводят последовательное наращивание биомассы 
продуцента в колбах, бутылях, далее в серии последовательных ферментеров. Каждый последующий этап данного процесса отличается по 
объему от предыдущего обычно на порядок. Полученный инокулят по 
стерильной посевной линии направляется далее в аппарат, в котором 
реализуется ферментационная стадия. Приготовление питательных 
сред осуществляется в специальных реакторах, оборудованных мешалками.

В зависимости от растворимости и совместимости компонентов 

сред могут быть применены отдельные реакторы. Технология приготовления сред значительно усложняется, если в их состав входят нерастворимые компоненты. В различных биотехнологических процессах применяются различные по происхождению и количествам субстраты, поэтому процесс их приготовления варьирует. Поэтому дозирование питательных компонентов подбирается и осуществляется индивидуально на каждом производстве в соответствии с Технологическим регламентом конкретного процесса. В качестве дозирующего 
оборудования при этом применяются весовые и объемные устройства, 
используемые в пищевой и химической промышленности. Транспорт 
веществ осуществляется насосами, ленточными и шнековыми транспортерами. Сыпучие компоненты подают в ферментеры с помощью 
вакуумных насосов. Часто применяют принцип предварительных смесей, то есть соли предварительно растворяют и затем транспортируют 
по трубопроводам, дозируя их подачу по объему. В силу исключительного разнообразия биотехнологических процессов и применяемых 
для их реализации сред, методов и аппаратуры рассмотрение данных 
элементов далее будет связано с конкретными биотехнологическими 
производствами.

Стадия ферментации является основной стадией в биотехно
логическом процессе, так как в ее ходе происходит взаимодействие 
продуцента с субстратом и образование целевых продуктов (биомасс, 
эндо- и экзопродуктов). Эта стадия осуществляется в биохимическом 
реакторе (ферментере) и может быть организована в зависимости от 
особенностей используемого продуцента и требований к типу и качеству конечного продукта различными способами. Ферментация может 
проходить в строго асептических условиях и без соблюдения правил 
стерильности (так называемая «незащищенная» ферментация); на 
жидких и на твердых средах; анаэробно и аэробно. Аэробная ферментация, в свою очередь, может протекать поверхностно или глубинно 
(во всей толще питательной среды).

1.2 Культивирование биологических объектов

Культивирование биологических объектов может осуществлять
ся в периодическом и проточном режимах, полунепрерывно с подпиткой субстратом. При периодическом способе культивирования 
ферментер заполняется исходной питательной средой и инокулятом 
микроорганизмов (Х0 + S0 на рис. 2). В течение определенного периода 
времени в аппарате происходит взаимодействие микроорганизмов и 
субстрата, сопровождающееся образованием в культуре продукта (Х + 
S → P).

Биохимические превращения в этом аппарате продолжаются от 

десятков часов до нескольких суток. Регуляция условий внутри ферментера – важнейшая задача периодического культивирования микроорганизмов. В ходе периодической ферментации выращиваемая культура проходит ряд последовательных стадий: лаг-фазу, экспоненциальную, замедления роста, стационарную и отмирания. При этом происходят существенные изменения физиологического состояния биообъекта, а также ряда параметров среды. Целевые продукты образуются в экспоненциальной (первичные метаболиты – ферменты, аминокислоты, витамины) и стационарной (вторичные метаболиты – антибиотики) фазах, поэтому в зависимости от целей биотехнологического процесса в современных промышленных процессах применяют 
принцип дифференцированных режимов культивирования. В результате этого создаются условия для максимальной продукции того или 
иного целевого продукта. Периодически ферментер опорожняют, 
производят выделение и очистку продукта, и начинается новый цикл.

Непрерывный процесс культивирования микроорганизмов об
ладает существенными преимуществами перед периодическим. Непрерывная ферментация осуществляется в условиях установившегося 

режима, когда микробная популяция и ее продукты наиболее однородны. Применение непрерывных процессов ферментации создает условия для эффективного регулирования и управления процессами 
биосинтеза.

Если для культивирования продуцента используется один фер
ментатор, то говорят о гомогенно-непрерывном процессе. Если же используется батарея, то это гетеро-непрерывный процесс, так как в каждом ферментаторе, соединенном в батарею, поддерживаются постоянные условия.

При непрерывном культивировании микроорганизмов отсутст
вует смена фаз развития культуры. В таких процессах скорость потока 
питательной среды и отвода культуральной жидкости из системы необходимо отрегулировать, чтобы концентрация клеток оставалась постоянной. В стерильных условиях непрерывный метод обеспечивает 
сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время.

Поддержание динамики равновесия в реакторе осуществляется 

двумя методами: турбидостатным и хемостатным.

Рисунок 2 – Схема биореактора периодического действия

Рисунок 3 – Схема тубулярного биореактора полного вытеснения

Системы непрерывной ферментации могут быть организованы 

по принципу полного вытеснения или полного смешения. Первый 
пример – так называемая тубулярная культура (рис. 3).

Процесс ферментации осуществляется в длинной трубе, в кото
рую с одного конца непрерывно поступают питательные компоненты 
и инокулят, а с другой с той же скоростью вытекает культуральная 
жидкость. Данная система проточной ферментации является гетерогенной.

При непрерывной ферментации в ферментах полного смешения 

(гомогенно-проточный способ) во всей массе ферментационного аппарата создаются одинаковые условия. Применение таких систем 
ферментации позволяет эффективно управлять отдельными стадиями, 
а также всем биотехнологическим процессом и стабилизировать продуцент в практически любом, требуемом экспериментатору или биотехнологу состоянии. Управление подобными установками осуществляется двумя способами (рис. 4).

Рисунок 4 – Схемы биореакторов для проточного культивирования 

микроорганизмов: 

А – хемостат; Б – турбидостат с автоматической регуляцией 
оптической плотности. 1 – поступление среды, 2 – мешалка, 

3 – сток культуры, 4 – насос, 5 – фотоэлемент, 6 – источник света

Турбидостатный способ базируется на измерении мутности 

выходящего потока. Измерение мутности микробной суспензии, вызванное ростом клеток, является мерой скорости роста, с которой 
микроорганизмы выходят из биореактора. Это позволяет регулировать 
скорость поступления свежей питательной среды в ферментер. Второй 
метод контроля, – хемостатный, проще. Управление процессом в 
хемостате осуществляется измерением не выходящего, а входящего 
потока. При этом концентрацию одного из компонентов питательной 
среды (углерод, кислород, азот), поступающего в ферментер, устанавливают на таком уровне, при котором другие питательные компонен

ты находятся в избытке, то есть лимитирующая концентрация задающегося биогенного элемента ограничивает скорость размножения клеток в культуре.

Обеспечение процесса ферментации, с точки зрения инженер
ной реализации, сводится к дозированному поступлению в ферментер 
потоков (инокулята, воздуха (или газовых смесей), питательных биогенов, пеногасителей) и отвода из него тепла, отработанного воздуха, 
культуральной жидкости, а также измерению и стабилизации основных параметров процесса на уровне, требуемом для оптимального 
развития продуцента и образования целевого продукта. В ходе ферментации образуются сложные смеси, содержащие клетки, внеклеточные метаболиты, остаточные концентрации исходного субстрата. При 
этом целевые продукты, как правило, находятся в этой смеси в небольших концентрациях, а многие из них легко разрушаются. Все это 
накладывает существенные ограничения на методы выделения и сушки биологических препаратов.

Постферментационная стадия обеспечивает получение гото
вой товарной продукции и также, что не менее важно, обезвреживание 
отходов и побочных продуктов. В зависимости от локализации конечного продукта (клетка или культуральная жидкость) и его природы на 
постферментационной стадии применяют различную аппаратуру и 
методы выделения и очистки. Наиболее трудоемко выделение продукта, накапливающегося в клетках. Первым этапом постферментационной стадии является фракционирование культуральной жидкости и 
отделение взвешенной фазы – биомассы. Наиболее распространенный 
для этих целей метод – сепарация, осуществляемая в специальных аппаратах – сепараторах, которые работают по различным схемам в зависимости от свойств обрабатываемой культуральной жидкости. Основные проблемы, возникают при необходимости выделения мелковзвешенных частиц с размером 0,5-1,0 мкм и менее (бактериальные 
клетки) и необходимостью переработки больших объемов жидкости 
(производство кормового белка, ряда аминокислот). Для повышения 
эффективности процесса сепарации применяют предварительную 
специальную обработку культуры – изменение рН, нагревание, добавление химических агентов. Для увеличения сроков годности биотехнологических продуктов производят их обезвоживание и стабилизацию. В зависимости от свойств продукта применяют различные методы высушивания. Сушка термостабильных препаратов осуществляется на подносах, ленточном конвейере, а также в кипящем слое. Особо 
чувствительные к нагреванию препараты высушивают в вакуумсушильных шкафах при пониженном давлении и температуре и в рас