Основы методологии и методы исследования аномалий и патологий амфибий

Министерство образования и науки Российской Федерации


Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б. Н. Ельцина





В. Л. ВЕРШИНИН





ОСНОВЫ МЕТОДОЛОГИИ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ АНОМАЛИЙ И ПАТОЛОГИЙ АМФИБИЙ




Рекомендовано в качестве учебного пособия для студентов, обучающихся по программам бакалавриата и магистратуры по направлениям подготовки 060301 «Биология», 060401 «Биология», 050306 «Экология», 050406 «Экология».


            2-е издание, стереотипное









Москва
Издательство «ФЛИНТА» Издательство Уральского университета 2017



   УДК597.6:591.4.068.1
    В37

Рецензенты:
Филинкова Т. Н., кандидат биологических наук, доцент кафедры биологии, экологии и методики их преподавания УрГПУ;
Жигальский О. А., доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией ИЭРиЖ УрО РАН.



    Вершинин В. Л.
В37    Основы методологии и методы исследования аномалий и патологий
     амфибий [Электронный ресурс] : [учеб. пособие] / В. Л. Вершинин — 2-е изд., стер. — М. : ФЛИНТА : Изд-во Урал. ун-та, 2017. — 80 с.
     ISBN 978-5-9765-3063-8 (ФЛИНТА)
     ISBN 978-5-7996-1420-1 (Изд-во Урал. ун-та)


     Учебное пособие составлено на основе литературных и авторских материалов 3 7-летней практики мониторинга аномалий земноводных. Цель издания - координация исследований для получения сравнимых результатов на основе единых методик. Обозначены методологические подходы, приведены классификации аномалий, примеры структуры баз данных, методы сбора, обработки, каче-ственного и количественного анализа.
     Книга адресована зоологам и экологам, специалистам, работающим в области морфогенеза, экологического мониторинга, преподавателям, студентам-биологам.

УДК597.6:591.4.068.1








ISBN 978-5-9765-3063-8 (ФЛИНТА)        ©ВершининВ.Л.,2015
ISBN 978-5-7996-1420-1 (Изд-во Урал. ун-та)



       СОДЕРЖАНИЕ



ВВЕДЕНИЕ. ОСНОВЫ МЕТОДОЛОГИИ....................5
Глава 1. ПРОФИЛИРОВАНИЕ МОРФООБЛИКА И СТРУКТУР ОРГАНИЗМА...............................10
Глава 2. ПЛАНИРОВАНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И СБОР ПЕРВИЧНОГО МАТЕРИАЛА........................15
Рандомизация.......................................15
Репрезентативностьвыборок..........................16
Выборочные методы .................................17
Использование таблиц случайных чисел...............21
Независимость......................................23
Объем выборки......................................24
Оценка ошибок......................................26
Соглашение о пяти процентах .......................27
Мощность, величина эффекта и объем выборки ........28
Статистическая значимость и реальная достоверность.33
Глава 3. СТРУКТУРЫ БАЗ ДАННЫХ......................37
Глава 4. КЛАССИФИКАЦИИ АНОМАЛИЙ ...................40
Принципы классификации аномалий....................40
Аномалии икры и кладок амфибий ....................45
Патологии развития эмбрионов остромордой лягушки, Rana arvalis.......................................46
Аномалии личинок амфибий ..........................49
Классификация внешних морфологических аномалий бесхвостых амфибий.................................52
Классификация девиантных форм скелета бесхвостых амфибий ...........................................54

3



�арианты внешних морфологических аномалий хвостатых амфибий..............................58
Классификация инфекций и инвазий амфибий.......61
Патологии печени и других органов .............61
Глава 5. МЕТОДИКИ ПРОСВЕТЛЕНИЯ МЯГКИХ ТКАНЕЙ..................................63
Метод Даусона..................................63
Приготовление и применение бинарного красителя.64
Методика изготовления и применения бинарного красителя......................................65
Протокол по просветлению и окраске хрящевых и костных структур для исследования............66
Глава 6. СХЕМА РАСЧЕТНЫХ ПАРАМЕТРОВ
ПОЛУЧЕННЫХПЕРВИЧНЫХДАННЫХ......................68
Простые показатели.............................68
Расчетные показатели ..........................69
Интерпретация результатов......................70
Глава 7. БИОИНДИКАЦИОННОЕ ЗНАЧЕНИЕ АНОМАЛИЙ.......................................72
Биоиндикационные параметры ....................74

4



       ВВЕДЕНИЕ.
        ОСНОВЫ МЕТОДОЛОГИИ

            От того, что мы будем знать, зависит то, чем мы станем...
Жан Ростан

    Любой признак обладает генетической основой, определяющей пределы реализации его формообразовательной потенции. Дефинитивный облик складывается в ходе онтогенеза в результате интеграции носителя генотипа в конкретные условия среды.
    По современным представлениям [Инге-Вечтомов, 2010], изменчивость формируется на основе сложного взаимодействия реплицируемого генотипа и экспрессии регуляторов морфогенеза, в котором условия среды играют роль медиатора.
    Формирование в ходе онтогенеза любых фенотипических признаков как структурных (например, пятипалая конечность), так и окрасочных (характерный для вида рисунок) происходит при вну-тригеномных взаимодействиях систем генов-регуляторов [Kondo, Mura, 2010; Hox Genes, 2012] по принципу реакционно-диффузионной модели А. Тьюинга [Turing, 1952]. От уровня экспрессии генов-интеграторов морфогенеза в конкретных условиях среды зависит дефинитивный облик особи.
    Исследования, ограниченные рамками морфологической «нормы» (в пределах модальных классов кривой нормального распределения), связаны главным образом с изучением внутривидового разнообразия, определяющегося гомеостатированием популяций вида в условиях разнообразной в пределах ареала среды [Вавилов, 1967]. Эти сведения связаны не столько с незавершенностью процессов эволюции, сколько с различной адаптированностью популяций, слагающих вид. Поэтому такой подход закрывает возможность к получению информации именно об эволюционных преобразованиях (трендах), так как крайние, наиболее уклоняющиеся (варианты по Ч. Дарвину) значения являются членами того же множества [Вершинин, 2009].
    Эволюционный процесс, проявляющийся в постоянной трансформации генетических систем, в определенном смысле «не различает» видов как таковых (что созвучно номиналистским пред

5



�тавлениям Ж.-Б. Ламарка о виде как о формальной категории, существующей только в человеческом сознании) и направлен на их разрушение (дестабилизацию) или преобразование [Ламарк, 1935].
    Известно, что девиантные или аномальные формы одних видов встречаются у близких видов того же таксона в качестве нормы [Evolution, 1988]. У генетически близких форм - видов одного рода могут быть гомологичные гены и проявляющие одинаковую изменчивость [Вавилов, 1967]. В соответствии с законом гомологических рядов, в близких таксонах многие признаки проявляются параллельно. Исследование гомологических рядов показывает, что они наиболее отчетливо прослеживаются на уровне родов [Розанов, 1973]. Гомологические ряды - отражение блочного модульного принципа структуры биологических систем, подразумевающего, что эволюционные преобразования одноименных структур связаны с перераспределением функциональных блоков близких или идентичных уразличных организмов [Уголев, 1990].
    Как эволюционные инновации, так и морфозы (аномалии) далеко выходят за пределы модальной части распределения. Кроме того, что закономерности формирования морфозов и эволюционных преобразований обладают «единой логикой», так как и те и другие базируются на одной материальной основе, определенным образом их канализирующей, поскольку, в соответствии с принципом блочности, «все ныне сущее возникло за счет комбинаторики исходно возникшего небольшого числа неких инвариантных доменов, которые далее комбинировались в разных сочетаниях» [Инге-Вечтомов, 2004]. Эволюция действует путем «перелицовки старого» [Jacob, 1977], так как ее возможности лежат в пределах биохимических особенностей вида (варианты, для формирования которых нет никакой наследственной основы для возникновения, не появятся) [Тимофеев-Ресовскийидр., 1973].
    Одним из важнейших следствий основ и механизмов морфогенеза является единство закономерностей на молекулярном и морфологическом уровнях, подчиняющихся принципу блочности биологических структур и их преобразования (тандемные дупликации, полимеризация, дивергенция, олигомеризация, редукция, новообразование) [Догель, 1954; Северцов, 1939; Ohno, 1970; Britten,Davidson, 1971].

6



   Как феномен тераты с давних времен привлекали внимание человечества, что имеет множество документальных подтверждений [Леруа, 2011]. Однако сами по себе важные коллекционные материалы (своеобразные «кунсткамеры») еще не обеспечивают понимания. Необходим перевод накопленной информации об аномалиях в область рационального знания. Путь этот в первую очередь лежит в направлении понимания их эволюционного значения, молекулярных механизмов морфогенеза вкупе с экологической и регуляторной составляющими, на основе знаний о которых становится возможным переход к оценке здоровья среды (биоиндикации).
    Первый шаг в нужном направлении был сделан в XVIII в. В. Гете [Goethe, 1790] на растениях, а позднее Жоффруа Сент-Илером [Saint-Hilaire, 1822] в XIX в. на животных и человеке. Изучение аномалий в строении растений способствовало появлению книги В. Гете «Метаморфоз растений» [Goethe, 1790] с изложением гипотезы о происхождении органов высших растений. Ж. Сент-Илер [Saint-Hilaire, 1822] использовал сведения по тератологии для подкрепления своих трансформистских взглядов. Нельзя не вспомнить, что именно пелории льнянки навели К. Линннея (в 1776 г.) на мысль о возможности появления новых видов.
    Для каждого вида характерно наличие специфического спектра и частот морфологических аномалий, это «функция способа морфогенеза» пока данный вид существует [Коваленко, 2003].
    Соотношение потенциального и реализованного спектров аномалий определенным образом характеризует среду, в которой существует популяция. Можно сказать, что условия, в которых экспрессируют Hox-гены (регуляторы и координаторы морфогенеза), «профилируют» морфооблик популяции, в том числе и спектр аномалий.


Библиографические ссылки

    Вавилов Н. И. Закон гомологичных рядов в наследственной изменчивости: Линнеевский вид как система. Л.: Наука, 1967. С. 1-92.
    Вершинин В. Л. Девиантные формы морфологической изменчивости амфибий как метод исследования микроэволюционных процессов // Эко

7



�огия в высшей школе: синтез науки и образования : материалы Всерос. науч.-практ. конф. 30 марта - 1 апреля 2009 г. Ч. 1. Челябинск: Изд-во Челяб. гос. пед. ун-та, 2009. С. 13-19.
    Догель В. А. Олигомеризация гомологичных органов как один из главных путей эволюции животных. Л.: Изд. ЛГУ, 1954. С. 338.
    Инге-Вечтомов С. Г. Блочный принцип в теории эволюции. Перспективы и парадоксы // Фундаментальные зоологические исследования. Теория и методы. М. - СПб.: Т-во научных изданий КМК, 2004. С. 74-87.
    Инге-Вечтомов С. Г. Изменчивость, матричный принцип и теория эволюции // Чарльз Дарвин и современная биология : труды Международ. науч. конф. «Чарльз Дарвин и современная биология» (21-23 сентября 2009 г., Санкт-Петербург). СПб.: Нестор-История, 2010. С. 49-60.
    Коваленко Е. Е. Эффект нормы признака и его теоретическое значение // Эволюционная биология: история и теория. СПб., 2003. Вып. 2. С. 66-87.
    Ламарк Ж.-Б. Философия зоологии. Т. 1. Л.-М.: Биомедгиз, 1935. 330 с.
    ЛеруаА. U Мутанты. М.: Астрель: CORPUS, 2011. 560 с.
    Розанов А. Ю. Закономерности морфологической эволюции археоциат и вопросы ярусного расчленения нижнего кембрия. М.: Наука, 1973. 164 с.
    Северцов А. Н. Морфологические закономерности эволюции. М. Л.: Изд-во АН СССР, 1939. 610 с.
    Тимофеев-Ресовский Н. В., Яблоков А. В., Глотов Н. В. Очерк учения о популяции. М.: Наука, 1973. 278 с.
    Уголев А. М. Концепция универсальных функциональных блоков и дальнейшее развитие учений о биосфере, экосистемах и биологических адаптациях // Эволюция биохимии и физиологии. 1990. Т. 26, № 4. С. 441-454.
    Britten R., Davidson Е. Repetitive and Non-repetitive DNA Sequences and a Speculation on the Origin of Evolutionary Novelty // Quart. Rev. Biol. 1971. V. 46. P. 111-138.
    Evolution and morphogenetic rules: the shape of the vertebrate limb in ontogeny and phylogeny / G. F. Oster, N. Shubin, J. D. Murray, P. Alberch // Evolution. 1988. V. 42, № 5. P. 862-884.
    Goethe J. W. Versuch die Metamorphose der Pflanzen zu erklaren. Gotha: C. W. Ettinger, 1790. 86 S.
    Hox Genes Regulate Digit Patterning by Controlling the Wavelength of a Turing-Type Mechanism / R. Sheth, L. Marcon, M. F. Bastida, M. Junco, L. Quintana, R. Dahn, M. Kmita, J. Sharpe, M. A. Ros // Science. 2012. V. 338. P. 1476-1980.

8



    JacobF Evolutionandtinkering// Science. 1977. V. 196. P. 1161-1166.
     Kondo S., Miura T. Reaction-Diffusion Model as a Framework for Understanding Biological Pattern Formation // Science. 2010. V. 329. P. 16161620.
     Ohno S. Evolution by gene duplication. Springer-Verlag. New York, 1970. 160p.
     Saint-Hilaire G. Philosophie anatomique. II. Paris, 1822. 372 p.
     Turing A. M.The Chemical Basis of Morphogenesis // Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences (Aug. 14, 1952). V. 237, № 641. P. 37-72.

9



�лава 1





                ПРОФИЛИРОВАНИЕ МОРФООБЛИКА И СТРУКТУР ОРГАНИЗМА




   Появление интеграторов морфогенеза (Нох-генов и др.) около 700-800 млн лет назад было крупнейшим ароморфозом, повлекшим за собой взрыв формообразования [Ferrier, Holland, 2001; Erwin, Davidson, 2002; Peterson, Eernisse, 2001].
   Фактически Hox-гены - центральные регуляторы многих генных сетей морфогенеза, чью работу контролируют также компоненты сигнальных каскадов и тканеспецифичные транскрипционные факторы [Hombria, Lovegrove, 2003; Колчанов, Суслов].
   Сейчас известно, что многие особенности внешнего облика каждого из отделов тела особей определяются гомеотическими генами, контролирующими развитие осевых структур, сегментацию, закладку конечностей и пр. [Малахов, 2004а; Малахов, 2004б], а точнее продуктами их экспрессии, уровнем, временем, длительностью, местом действия и их взаимодействием [Turing, 1952].
   Мутации таких генов приводят к изменениям идентичности органов, гетеротопии [Баттулин, 2014]. Сходные эффекты могут быть связаны не только с изменением ключевой последовательности, но и с регуляцией работы генов (эпигенетическими механизмами), когда обычный ген экспрессирует в необычном месте или в необычное время.
   Гетерохронии как отклонения онтогенеза меньше влияющие на выживаемость особей, не вызывая резких нарушений канализации отдельных процессов, могут привести в конечном итоге к значительным изменениям морфологии [Alberch, 1981]. Амплификация мелких изменений в ходе развития может существенно влиять на дефинитивный облик.
   Спектр профилируемых вариантов морфологии из области модальной части распределения признака определяет адаптивный потенциал («ресурс») популяции в пределах существующей нормы реакции и представляет собой главным образом то, что ортодоксы СТЭ определяют как модификационную изменчивость.


10



   Напротив, спектр профилируемых морфологических вариантов из краевой области нормального распределения, относимых к «фенодевиантам» [Алтухов, 2003], позволяет оценить эволюционный резерв формообразовательной потенции популяции или вида.
    По сходству аминокислотных последовательностей четыре кластера паралогичных Нох-генов позвоночных (сформировавшихся благодаря двум полногеномным дупликациям) делят на 3 ортологичные группы - антериорную, центральную и постери-орную [Changes in Нох, 2010]. Все 5 генов антериорной группы высококонсервативны [Баттулин, 2014; Колчанов, Суслов]. Области экспрессии Нох-генов располагаются вдоль тела животного в том же порядке, что и гены в хромосоме (принцип колинеарности). Порядок экспрессии схож у беспозвоночных и позвоночных, несмотря на их давнюю дивергенцию.
    Нормальный морфогенез всех структур жестко определяется соблюдением целого комплекса условий, профилирующих определенный морфооблик. Так, отсутствие ребер на 7-м шейном позвонке человека требует, чтобы присутствовали гены: НохА4, НохА5, HoxB5, НохА6, HoxB6, а все остальные постериорно расположенные Hox-гены отсутствуют [Леруа, 2010].
    Одна из функций Hox-генов позвоночных - дифференциация метамерного осевого скелета (позвонков), которая регулируется экспрессией Hox4, Hox5, Hoxa, Hox9, Hox 10, Hox 11 - генов [Pearson et al., 2005; Wellik, 2009].
    Поскольку развитие каждого из метамеров позвоночных контролируется двумя-четырьмя паралогами, компенсирующими недостатки в экспрессии друг друга отклонения в этих отделах, сравнительно редки.
    Особенности регуляторики зоны экспрессии гена HoxC8, контролирующего формирование грудной клетки, определяют специфику строения и положения этого отдела в разных систематических группах [Бородин, 2009].
    Различие зон экспресии гена HoxC6 определяет различия в позвоночнике и в грудном отделе [Баттулин, 2014].
    У большинства позвоночных зачатки передних конечностей формируются у передней границы области экспрессии гена HoxC6. Совместная экспрессия HoxC6 и HoxC8 приводит к фор

11



�ированию позвонков грудного отдела, несущих ребра. Так как HoxC8 подавляет развитие зачатка конечностей, то конечность может сформироваться только в отделе, экспрессирующем HoxC6 и не экспрессирующем HoxC8.
    Разметка зоны поляризующей активности осуществяется благодаря экспрессии гена Shh (нарушения работы зоны поляризующей активности приводят к тяжелым уродствам кистей и стоп), зачатки скелета маркирует экспрессия гена Sox9 [Digit loss..., 2013].
    Формирование пятипалых конечностей и их поясов у наземных тетрапод связано с экспрессией генов HoxD с9по 13.
    Существует две отдельных фазы (волны) экспрессии генов HoxD в ходе формирования конечностей тетрапод. Первая способствует формообразованию в проксимальных отделах конечности, тогда как вторая - наиболее дистантной части конечности (пальцы) [Tanaka, 2009].
    В зависимости от различных сочетаний отключения генов-регуляторов - HoxA 13, HoxD 11-13 и Gli3 (transcription factor Gli 1 etc.) - возможно формирование в ходе морфогенеза всех вариантов: от пятипалой конечности до многолучевого «плавника» [Hox Genes..., 2012].
    Эволюционные изменения длительности экспрессии HoxD 12-13 приводят к полифалангии. HoxD-гены ответственны за число пальцев, образование перепонки и высокую изменчивость отделов конечности [Cohn, Bright, 1999]. Нарушение экспрессии гена Tbx5 может приводить к полному отсутствию передних конечностей у новорожденных [Cohn, Bright, 1999].
    Развитие глаз позвоночных определяется районами и уровнем экспрессии генов Pax2 и Pax6, которые регулируются белком Shh [Gilbert, 2010]. Изменения регионов экспресии этих генов у пещерной рыбы Astyanax mexicanus привело к отсутствию нормально сформированных глаз.
    В соответствии с современными преставлениями о процессах морфогенеза изучение морфологических аномалий, кроме их инвентаризации, подразумевает отказ от простого описательного феноменологического подхода в пользу анализа и синтеза. После того как стало очевидно, какую ценную информацию может принести исследование аномалий, необходимо определить что и как делать.

12