РОЛЬ ОЛИГОПЕПТИДАЗЫ В В МЕХАНИЗМАХ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА

LITERATURE
1.
Evaluation of the effect of cellular cardiomyoplasty mesenchymal 

stem cells (MSC) on the indicators of the metabolic activity of 
cardiomyocytes 
in 
experimental 
myocardial 
infarction/ 
Y. 
V. 

Michaylichenko, S. A. Samarin // Fundamental research. – 2015. – No. 1. 
– P. 789-792.
2.
Stem cells for myocardial regeneration / D. Orlic, J. M. Hill, A. 

E. Arai // Circ. Res. - 2002. - Vol. 91. - P. 1092-1102.
DOI:10.12737/12422

РОЛЬ ОЛИГОПЕПТИДАЗЫ В В МЕХАНИЗМАХ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА

А.Г. Михайлова, Л.Д. Румш

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова 
Российской академии наук; 117997 Москва, ГСП-7, ул. Миклухо-Маклая, 

16/10

anna.mikhailova@ibch.ru

Ключевые слова: антимикробные пептиды, олигопептидаза В, Serratia 
рroteamaculans, мелиттин.
В настоящее время широкое распространение бактериальных патогенов, 
резистентных 
к 
большинству 
известных 
лекарственных 
средств, 

представляет серьезную угрозу глобального масштаба. Поэтому возросла 
необходимость 
поиска 
новых 
потенциальных 
антимикробных 
агентов. 

Антимикробные пептиды (АМП) представляются многообещающей альтернативой 
используемым в настоящее время антибиотикам. АМП являются частью 
системы 
врожденного 
иммунитета, 
защищающей 
организм 
хозяина 
от 

патогенных бактерий. Они широко распространены как среди позвоночных, 
так и беспозвоночных. 
Структура АМП высокое содержание остатков положительно заряженных 

аминокислот  и, в особенности, последовательностей из двух и более 
остатков Arg/Lys, а также последовательностей Arg(Lys)-Pro [2], делает 
их потенциальными субстратами  олигопептидазы В (OpdB). OpdB
–
это 

трипсиноподобная 
сериновая 
пептидаза, 
присутствующая 
в 

грамотрицательных патогенных бактериях, а также в одноклеточных 
эукариотах: трипаносомах и лейшманиях. OpdB являются важными факторами 
вирулентности 
при 
трипаносомных 
инфекциях 
и 
лейшманиозах 
[3].  

Физиологическая роль OpdB бактерий до сих пор остается невыясненной; ее 
природные субстраты не обнаружены [3].
Цель исследования: изучение роли
олигопептидазы В
в механизмах 

нарушения 
врожденного 
иммунитета 
грамотрицательными 
патогенными 

микроорганизмами. 
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Рекомбинантный фермент PSP получен по разработанной нами методике [4]. 
Мониторинг гидролиза 
мелиттина 
проводили с использованием ВЭЖХ. 

Инкубировали мелиттин (50–90 мкМ) с PSP (5–30 нМ) в 0,1 М Tris-HClбуфере, pH 8,0; при 25°, собирая аликвоты инкубационной смеси вплоть до 
полного гидролиза субстрата. Анализ инкубационных смесей с помощью ВЭЖХ 
(колонка Luna C8, 2 x 250 мм; «Phenomenex», США); 0,1%-ный раствор ТФУ 

с градиентом ацетонитрила 0–60%, скорость элюции 0,3 мл/мин) проводили 
на хроматографе «Beckman System Gold» (США). Результаты хроматографии 
обрабатывали в программе Мультихром 5,0 («Амперсанд», Россия).
Для доказательства структуры продуктов гидролиза собирали аликвоты 
индивидуальных пиков и анализировали с помощью масс-спектрометрии 
(MALDI-TOF, Ultraflex TOF/TOF, «Bruker», Германия).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект 
данного 
исследования: 
первая 
психрофильная 
OpdB 
(PSP), 

выделенная нами из непатогенного грамотрицательного психротолерантного 
микроорганизма Serratia  proteamaculans, клонированная и функционально 
охарактеризованная [1,4]. Для моделирования действия PSP
на АМП мы 

выбрали биологически активный пептид из пчелиного яда мелиттин 
GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2.
Обнаружено, что при действии PSP первоначально практически одновременно 
образуются два продукта, соответствующие гидролизу мелиттина после 
остатков Arg22 и Lys7: фрагменты 1–22 (GIGAVLKVLTTGLPALISWIKR) и 8–22 
(VLTTGLPALISWIKR). При дальнейшей инкубации наряду с фрагментами 1–22 и 
8–22 
обнаруживаются 
нарастающие 
количества 
фрагментов 
1–21 

(GIGAVLKVLTTGLPALISWIK) и 8–21 (VLTTGLPALISWIK). 
Эффективный гидролиз антимикробного олигопептида меллитина PSP является 
моделью биологических защитных функций OpdB грамотрицательных бактерий. 
Для повышения эффективности использования АМП  антимикробную терапию 
следует дополнить ингибиторами OpdB. PSP может выступать как модельный 
фермент при изучении патогенеза этих инфекционных заболеваний. Однако 
преимуществом PSP
- психрофильной  олигопептидазы В - является низкая 

температурная стабильность с инактивацией уже при 37°С, поэтому фермент 
не представляет опасности  для теплокровных.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Научного Фонда 
(грант 14-50-00131
ЛИТЕРАТУРА
1. Михайлова А.Г., Хайруллин, Р.Ф., Демидюк И.В., Громова,Т.Ю., 
Костров,С.В., Румш Л.Д.// 2011. Биохимия. Т. 76. С. 591–603.
2. Benincasa M., Pelillo C., Zorzet S., Garrovo C., Biffi S., Gennaro
R., Scocchi M. // 2010. BMC Microbiology. V. 10. P. 178-185
3. Coetzer T. H., Goldring J.P., Huson,L.E. // 2008 . Biochimie. V. 90. 
P. 336-344.
4. Mikhailova A.G, Khairullin R.F., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., 
Grinberg N.V., Burova,T.V., Grinberg V.Ya., Rumsh L.D. // 2014.  
Protein Exp. Purif. V. 93. P. 63-76.

ROLE OF OLIGOPEPTIDASE В IN THE INNATE IMMUNITET MECHANISMS

A.G. Mikhailova,  L.D. Rumsh

Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS; 

Miklukho-Maklaya St. 16/10, Moscow 117997, Russia

anna.mikhailova@ibch.ru

Key 
words:
antimicrobial 
peptides, 
oligopeptidase 
B, 
Serratia 

proteamaculans, melittin.

The spread of multi-drug resistant bacterial pathogens poses a serious 
threat to the global society. It is therefore urgent to search for new 
potent antimicrobial agents. Antimicrobial peptides (AMPs) are widely 
recognized as promising alternatives to the currently used antibiotics. 
AMP are an integral part of the innate immune system that protect a 
host from invading pathogenic bacteria AMPs are widespread in living 
organisms, invertebrates and vertebrates.
AMPs contain the sequences of two or more Arg/Lys residues as well as 
Arg(Lys)-Pro sequences [1], which making them potential substrates of 
oligopeptidase B (OpdB).  OpdB is a trypsin-like serine peptidase that 
is present in the Gram-negative pathogenic bacteria as well as in 
ancient unicellular eukaryotes: trypanosomes and leishmania. The OpdB 
enzymes are important virulent factors of trypanosomal infections and 
leishmaniases. The physiological role of bacterial OpdB has not been 
elucidated yet, and no natural substrates have been identified [2].
The aim of this study is to investigate the oligopeptidase B role in 
the mechanisms of the innate immune system perturbing by Gram-negative 
pathogen microorganisms. 
Methods.
The recombinant enzyme PSP was obtained using methods designed in [4].
Melittin hydrolysis was monitored using HPLC. Melittin (50-90 μM) was 
incubated in the presence of 5-30 nM PSP in 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0 and 
25°C, and aliquots were taken from the reaction mixture until the 
substrate was completely hydrolyzed. Incubation mixtures were analyzed 
by HPLC (Luna C8 column, 2 x 250 mm; Phenomenex, USA) using a Beckman 
System Gold chromatograph (USA). Peptides were eluted with 0.1% TFA 
with a 0-60% acetonitrile gradient at a rate of 0.3 ml/min. The results 
of the chromatography were analyzed using the Multikhrom 5.0 program 
(Ampersand, Russia). To identify the products of the hydrolysis, 
aliquots corresponding to separate peakswere analyzed using MALDI-TOF 
spectrometry (Ultraflex_TOF/TOF; Bruker).
Results.
The object of this study is the first known psychrophilic OpdB (PSP) 
isolated 
by 
us 
from 
the 
Gram-negative 
microorganism 
Serratia 

proteamaculans, cloned and functionally characterized [3,4]. To 
investigate the action of PSP on AMPs, we have chosen the biologically 
active peptide from bee venom melittin  GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2.
It was shown that under the action of PSP, the first two simultaneously 
formed products corresponded to the hydrolysis of melittin after 
residues Arg22 and Lys7: fragments 1-22  (GIGAVLKVLTTGLPALISWIKR) and 
8-22 
(VLTTGPALISWIKR). 
The 
subsequent 
incubation 
together 
with 

fragments1-22 and 8-22 results in the accumulation of fragments 1-21 
(GIGAVLKVLTTGLPALISWIK) and 8-21 (VLTTGPALISWIK).
The efficient hydrolysis of the antimicrobial oligopeptide melittin by 
PSP is a model of possible biological protection functions of OpdB from 
Gram-negative microorganisms. For more effective AMP antimicrobial 
therapy the additional OpdB inhibitors are needed.   PSP can be used as 
a model enzyme in the pathogenesis studying of these infections. The 
low temperature stability of this psychrophilic
enzyme, namely 

inactivation at 37°С is an additional advantage because this enzyme is 
not dangerous for warm-blooded.

This work was supported by the Russian Science Foundation (grant 14-5000131).
References.
1.
Benincasa M., Pelillo C., Zorzet S., Garrovo C., Biffi S., Gennaro 

R., Scocchi M. // 2010. BMC Microbiology. V. 10. P. 178-185.
2. Coetzer T. H., Goldring J.P., Huson,L.E. // 2008. Biochimie. V. 90. 
P. 336-344.
3. Mikhailova A.G, Khairullin R.F., Demidyuk I.V., Gromova T.Yu., 
Kostrov S.V., Rumsh L.D. // 2011. Biochemistry (Moscow). V. 76. P. 480–
490.
4. Mikhailova A.G, Khairullin R.F., Demidyuk I.V., Kostrov S.V., 
Grinberg N.V., Burova,T.V., Grinberg V.Ya., Rumsh L.D. // 2014. Protein
Exp. Purif. V. 93. P. 63-76.
DOI:10.12737/12423

ИЗУЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ МИКРОКРИСТАЛЛИЗАЦИИ  РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ 

ДЕТЕЙ КРЫМА

Т.В. Михайлова, Т.А. Дубровина-Парус

Кафедра терапевтической стоматологии, Медицинская академия имени С.И. 
Георгиевского Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского,  

г.Симферополь, Республика Крым, РФ

chudin74@mail.ru

Ключевые слова: показатель микрокристаллизации, минерализующие свойства 
ротовой жидкости, интенсивность кариеса, физико-географический район 
Крыма, 12-летние дети.
Одним из методов, позволяющих оценить процессы, происходящие в полости 
рта, является показатель микрокристаллизации (ПМК) ротовой жидкости. Он 
основан на свойстве ротовой жидкости образовывать кристаллические 
структуры. На
морфологическую структуру кристаллов оказывают влияние 

ряд эндогенных и экзогенных факторов: химический и белковый состав 
ротовой жидкости, физико-химические свойства используемой питьевой воды 
в регионе проживания, экологические факторы среды и др. [1, 3]. 
Структурные изменения закристаллизированной ротовой жидкости могут 
служить диагностическим критерием различных заболеваний, в том числе 
стоматологических [2]. При поражении кариесом зубов и при возникновении 
в полости рта кариесогенной ситуации в смешанной слюне изменяются 
процессы микрокристаллизации, нарушаются ее минерализующие свойства, 
ослабляется устойчивость зубов к кариесу.
Определение ПМК проводили с целью изучения минерализующих свойств 
ротовой жидкости у 12-летних детей в 3-х физико-географических районах 
Крыма. 
ПМК ротовой жидкости определяли по относительной площади, занимаемой 
кристаллоподобными структурами  по методике Курякиной Н.В. (1989) [4].
Измерение ПМК проводили под микроскопом с окулярной сеткой Автандилова 
при увеличении 12,5 (х 300). 
Дети в изучаемых районах были разделены на 2 группы (по 25 человек в 
каждой) в зависимости от интенсивности кариозного процесса: 1-я группа