Свободнорадикальные процессы и состояние мембран при гипотермии

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение 

высшего профессионального образования

«ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Э. З. Эмирбеков, Н. К. Кличханов

СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ 

И СОСТОЯНИЕ МЕМБРАН 

ПРИ ГИПОТЕРМИИ

Ростов-на-Дону

Издательство Южного федерального университета

2011

УДК 577.1
ББК 28.05
 
Э55

Печатается по решению редакционно-издательского совета

Южного федерального университета

Рецензенты:

доктор биологических наук, профессор, 

зав. кафедрой анатомии, физиологии, гистологии 

Дагестанского государственного университета М. М. Габибов;

доктор биологических наук, профессор, 

директор НИИ биологии ЮФУ Т. П. Шкурат

Монография подготовлена и издана в рамках национального проекта «Образование» 

по «Программе развития федерального государственного образовательного учреждения 

высшего профессионального образования “Южный федеральный университет” 

на 2007–2010 гг.»

 
Эмирбеков Э. З.

Э55 Свободнорадикальные процессы и состояние мембран при гипотермии / Э. З. Эмирбеков, 

Н. К. Кличханов. – Ростов-на-Дону: Издательство Южного федерального университета, 2011. – 
200 с. – Ил.: 33. Табл.: 43. Библиогр.: 665.

ISBN 978-5-9275-0876-1

В монографии систематизированы и обобщены современные литературные данные и большой 

экспериментальный материал о влиянии гипотермии на структурно-функциональное состояние 
мембран при гипотермии различной глубины и длительности. Представлены результаты о значении 
окислительного стресса в повреждении мембран при гипотермии. Большое внимание уделяется 
окислительной модификации белков как одного из специфических и надежных маркеров при свободнорадикальной патологии. Подробно освещаются особенности свободнорадикальных процессов 
в нервной ткани и крови. Приводятся данные о влиянии гипотермии на мембранносвязанные ферменты и структурно-динамическое состояние мембран. Дан анализ механизмов защитного действия 
опиоидного пептида даларгина.

Книга представляет интерес для научных сотрудников, биохимиков, физиологов и врачей, 

интересующихся проблемами гипотермических состояний и их фармакологической коррекции 
с использованием антиоксидантов и опиоидных пептидов, а также аспирантов и студентов биологических и медицинских факультетов университетов.

Ил. – 33. Табл. – 43. Библиогр. – 665.

УДК 577.1
ББК 28.05

ISBN 978-5-9275-0876-1

© Эмирбеков Э. З., Кличханов Н. К., 2011
© Южный федеральный университет, 2011
© Оформление. Макет. Издательство
 
Южного федерального университета, 2011

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

Сокращения и условные обозначения. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

 
Глава 1. Влияние гипотермии на биохимический состав крови . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

 
Глава 2. Механизмы изменения интенсивности свободнорадикальных 

процессов при гипотермии  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

 
2.1. Влияние низкой температуры окружающей среды и тела 

на интенсивность свободнорадикальных процессов в тканях . . . . . . . . . . . 12

 
2.2. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов крови 

и коры головного мозга крыс при гипотермии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

 
2.2.1. Влияние гипотермии на интенсивность процессов 

перекисного окисления липидов и активность компонентов 
антиоксидантной защиты крови. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

 
2.2.2.  Влияние гипотермии на интенсивность процессов 

перекисного окисления липидов и активность компонентов 
антиоксидантной защиты коры головного мозга . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

 
2.3.  Влияние гипотермии на интенсивность окислительной 

модификации белков . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

 
2.3.1.  Механизмы окислительной модификации белков в физиологических 

условиях и при патологических и экстремальных состояниях  . . . . . . . . . . 31

 
2.3.2.  Влияние гипотермии на уровень карбонильных производных 

в белках плазмы крови  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

 
2.3.3.  Влияние гипотермии на тиол-дисульфидное равновесие 

в белках плазмы крови, мембран эритроцитов и синаптосом . . . . . . . . . . . 38

 
2.3.4.  Структурная модификация окисленных белков и их оборот . . . . . . . . . . . . 42

 
Глава 3.  Влияние гипотермии на мембранные ферменты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

 
3.1.  Влияние гипотермии на Na, K-ATФазу мембран эритроцитов 

и синаптосом мозга . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

 
3.1.1.  Структура, механизм действия и особенности регуляции 

Na, K-АТФазы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

 
3.1.2.  Влияние гипотермии на Na, K-АТФазу мембран эритроцитов крыс . . . . . 73

 
3.1.3.  Влияние гипотермии на Na, K-АТФазу мембран синаптосом 

из коры головного мозга крыс . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

 
3.2.  Влияние гипотермии на ацетилхолинэстеразу мембран эритроцитов 

и синаптосом мозга . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

 
3.2.1. Структура, механизм действия и температурная зависимость 

активности ацетилхолинэстеразы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

 
3.2.2.  Температурная зависимость активности ацетилхолинэстеразы 

мембран эритроцитов крыс при гипотермии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

 
3.2.3.  Температурная зависимость активности ацетилхолинэстеразы 

мембран синаптосом коры головного мозга крыс при гипотермии . . . . . 106

 
Глава 4.  Влияние гипотермии на поверхностный заряд и структурно
динамические характеристики мембран эритроцитов крыс . . . . . . . . . . . . 110

 
Глава 5.  Динамика кислотного и внутрисосудистого гемолиза эритроцитов 

крыс при гипотермии  . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

 
Глава 6.  Защитные механизмы опиоидного пептида даларгина 

при гипотермии и других стрессорных состояниях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

 
6.1.  Биохимические и физиологические механизмы действия даларгина 

в норме и при стрессорных состояниях . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

 
6.2.  Коррекция даларгином свободнорадикальных процессов 

и структурно-функционального состояния мембран при гипотермии . . . 129

 
6.2.1.  Влияние даларгина на содержание белковых и липидных 

компонентов в сыворотке крови крыс при гипотермии  . . . . . . . . . . . . . . . 129

 
6.2.2.  Влияние даларгина на интенсивность процессов перекисного 

окисления липидов крови и коры головного мозга крыс 
при гипотермии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132

 
6.2.3.  Влияние даларгина на гемолитическую стойкость эритроцитов 

и структурно-динамическое состояние их мембран . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137

Заключение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

Литература . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148

ПРЕДИСЛОВИЕ

Способность приспосабливаться к меняющимся условиям среды – одна 

из важнейших особенностей живых существ. Их распространение, численность и биоразнообразие в значительной мере определяются эффективностью 
адаптационных механизмов. Из всего многообразия адаптаций к отдельным 
экологических факторам (температуре, содержанию кислорода в среде, солености воды, освещенности, влажности) или к иным типам природной среды 
(высокогорью, морским глубинам, жизни в пещерах, в пустынях и др.) особенно интересны температурные. Температурные адаптации характеризуются 
значительным разнообразием в соответствии с теми реальными ситуациями, 
с которыми сталкиваются живые организмы в природе. С современной точки 
зрения существуют две качественно различающиеся стратегии адаптации – 
резистентная и толерантная (Проссер, 1977; Кулинский, Ольховский, 1992; 
Hochachka, Somero, 2002).

Примером стратегии резистентности является реакция гомойотермов на 

острое охлаждение, которая сопровождается резкой активацией реакций терморегуляции, повышением потребления кислорода организмом и тканями и активацией катаболических процессов (Кулинский, Ольховский, 1992; Эмирбеков, 
Львова, 1985). Однако длительное и жесткое холодовое воздействие приводит 
к истощению энергетических резервов организма, падению температуры тела 
и развитию дискоординации метаболических процессов (Покровский и др., 
1984; Эмирбеков, Львова, 1985; Тимофеев, Прокопьева, 1997).

Переохлаждение является частой причиной возникновения случайной ги
потермии у человека. Помимо переохлаждения у гомойотермов и человека гипотермия может возникнуть под действием самых различных факторов (долгое 
пребывание в холодной воде, гипоксия, отравления и др.). Гипотермия может 
развиваться в острой стадии некоторых заболеваний, таких как застойная сердечная недостаточность, уремия, сахарный диабет, передозировка лекарственных препаратов, острая дыхательная недостаточность, гипогликемия.

Глубокая гипотермия является опасным для жизни гомойотермного орга
низма состоянием; пролонгирование глубокой гипотермии увеличивает риск 
летального исхода. Механизмы, ведущие к летальному исходу при глубокой 
гипотермии, многообразны и до сих пор не вполне ясны (Петров, Гублер, 1961; 
Акимов и др., 1977; Тимофеев, 1983; Эмирбеков, Львова, 1985). Ряд данных 
указывает на возможную роль свободнорадикальных процессов в развитии 

патологии при гипотермии (Шепелев, Юфит, 1974; Львова и др., 1993, 2002; 
Erecinska et al., 2003). Однако в настоящее время не установлены механизмы 
активации свободнорадикальных процессов в тканях при низких температурах тела, пусковые и доминирующие факторы этих процессов, а также их роль 
в изменении структурно-функциональных характеристик мембран клеток различных тканей. Знание этих механизмов представляет не только теоретический 
интерес, но имеет практическое значение, поскольку позволяет выработать 
стратегию защиты тканей от активных метаболитов кислорода.

В настоящее время гипотермия находит широкое применение не только 

в экспериментальной биологии, но и в различных областях клинической медицины. Общая и локальная гипотермия используется, главным образом, в целях 
снижения кислородных запросов тканей и устранения ишемических и гипоксических явлений (Мешалкин, Верещагин, 1985; Бабийчук и др., 1990; Kataoka, 
Yanase, 1998; Lyden et al., 2006). Использование гипотермии позволяет значительно уменьшить последствия инсультов, инфарктов, ишемии-реперфузии 
(Eisenburger et al., 2001; Krieger et al., 2001; Olsen et al., 2003; Lyden et al., 2006; Liu, 
Yenari, 2007). В то же время не совсем ясны механизмы, посредством которых 
гипотермия оказывает защитное действие (Seppelt, 2005).

В связи с использованием гипотермии в разных областях лечебно
профилактической медицины практическое значение имеет поиск веществ, 
защищающих организм от этого патологического воздействия. В нашей 
лаборатории в качестве протекторных веществ при гипотермии использовались мочевина, аргинин, полиамины, α-токоферол (Эмирбеков, Львова, 1985; 
Эмирбеков и др., 1991). Важную роль в сдерживании стресс-индуцированных 
свободнорадикальных процессов играют эндогенные регуляторные пептиды 
и их синтетические аналоги, в частности, опиоидный гексапептид даларгин 
(Лишманов, Маслов, 1994). По данным научной литературы, даларгин применялся для коррекции некоторых патологических состояний (Слепушкин и др., 
1988; Лишманов и др., 1997; Николаев, Слепушкин, 2000; Заболотских и др., 
2002; Маслов и др., 2002; 2004). В нашей работе с помощью даларгина корректировали состояние гипотермии у крыс.

СОКРАЩЕНИЯ И УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

 
АНС – 1-анилинонафталин-8-сульфонат

 
АОА – антиокислительная активность

 
АОС – антиокислительная система

 
АТФ – аденозинтрифосфат

 
АТХ – ацетилтиохолин

 
АФК – активные формы кислорода

 
АХЭ – ацетилхолинэстераза

 
ЛПВП – липопротеины высокой плотности

 
ЛПНП – липопротеины низкой плотности

 ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности
 
МДА – малоновый диальдегид

 
МКО – металл-катализируемое окисление

 
НАДН – никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

 НАДФН – никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
 НЭЖК – неэстерифицированные жирные кислоты
 
ПОЛ – перекисное окисление липидов

 
СМП – среднемолекулярные пептиды

 
СОД – супероксиддисмутаза

 
ЭДТА – этилендиаминтетраацетат

 
ColQ – коллаген Q

 
EGF – epidermal growth factor (эпидермальный фактор роста)

 ERK1/2 – extracellular signal-regulating kinase
 
Grb2 – adaptor protein (белки-адапторы)

 
MAPK – mitogen-activated protein kinases

 
MEK – киназа MAPK

 
NF-κB – nuclear factor- κB

 NMDA – N-метил-D-аспартат (NMDA-рецепторы)
 
ORL1 – opioid receptor like (опиоидподобный рецептор)

 
PKA – протеинкиназа А

 
PRAD – proline-rich attachment domain (богатый пролином прикрепленный домен)

 PRiMA – proline-rich membrane anchor (мембранный якорь богатый пролином)
 
Raf – MAPK киназа киназы

 
Ras – низкомолекулярные ГТФ-связывающие белки

 
Shc – белки-адапторы (белок, содержащий SH-2 домен)

 
Sos – GTP/GTF exchanger для Ras

 
Src – нерецепторная тирозинкиназа

 
АР-1 – activator protein-1

 
РКG – протеинкиназа G

 
РКС – протеинкиназа С

Глава 1

ВЛИЯНИЕ ГИПОТЕРМИИ 

НА БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ КРОВИ

Начиная с первых исследований Г. Селье (Судаков, 1997), в работах многих 

авторов установлено, что охлаждение является типичным стрессорным раздражителем, приводящим к выделению нейросекретов гипоталамуса, гормонов 
гипофиза, коры надпочечников, вызывающих в организме симпатокомплекс 
«реакции напряжения» (Майстрах, 1975; Гурин, 1989; Кулинский, Ольховский, 
1992; Лишманов и др., 1997).

Усиление синтеза и секреции кортикостероидов и катехоламинов наблю
дается не только при действии низкой температуры, но и на начальных этапах 
снижения температуры тела. Показано, что на начальных этапах снижения 
температуры тела (на 2–3 °С) и при умеренной гипотермии (30 °С) содержание адреналина и норадреналина в надпочечниках, крови (Коровин, 1973; 
Абдуллаев, 1982) и различных отделах головного мозга крыс (Эмирбеков и др., 
1978) существенно увеличивается. По данным А. П. Шкестерс и соавторов 
(1991), при умеренной гипотермии в плазме крови крыс содержание адреналина повышается в 2,5 раза, а норадреналина – в 4 раза.

Достоверное повышение содержания норадреналина в стволе головного 

мозга, сердце и, особенно, буром жире, адреналина в надпочечниках в начальном периоде гипотермии показано и на мышах (Плотников, Кулинский, 1983).

Т. В. Козырева с сотр. (1999) показали, что снижение ректальной темпера
туры крыс на 0,5 °С (~2 мин) в результате быстрого охлаждения (0,004 °С/с) 
приводило к повышению в крови содержания как норадреналина (в 2,6 раза), 
так и адреналина (в 2,8 раза). При аналогичном по глубине медленном 
охлаждении (0,002 °С/с), приводящем к снижению ректальной температуры 
на те же 0,5 °С (примерно за 4 мин), содержание катехоламинов в крови достоверно не изменялось. При быстром охлаждении относительно большой 
глубины и снижении ректальной температуры на 3–4 °С (~15 мин) содержание катехоламинов в крови возрастало по сравнению с исходным: норадреналина в 3,7 раза, адреналина – в 3,5 раза. При глубоком медленном (~30 мин) 
охлаждении содержание норадреналина в крови возрастало в 3,0 раза, 
а адреналина – в 2,2 раза. Полученные авторами результаты еще раз подтверждают факт активации симпатической нервной системы при действии 
внешнего холода и развитии гипотермии, а также свидетельствуют о том, 

Глава 1. Влияние гипотермии на биохимический состав крови 
9

что эта активация может происходить по-разному в зависимости от скорости охлаждения и глубины.

Следствием усиленного синтеза и секреции катехоламинов и глюкокорти
коидов является стимуляция ими распада депонированных липидов и гликогена, 
с последующим поступлением жирных кислот и глюкозы в кровь и далее усиление их окисления в тканях, что ведет к повышению термогенеза (Эмирбеков, 
Львова, 1985, 2002; Тимофеев, Прокопьева, 1997). Немаловажный вклад в теплообразование вносит мышечная дрожь (Тимофеев, Прокопьева, 1997).

В нашей лаборатории С. П. Львова установила (Эмирбеков, Львова, 2002), 

что при действии сильного холодового стресса, ведущего к развитию умеренной 
гипотермии (30 °С), у крыс существенно снижаются запасы гликогена в печени 
(табл. 1). Достоверное понижение уровня этого полисахарида на начальных 
этапах умеренной гипотермии имеет место также в трапециевидной (на 34,5 %) 
и жевательной (на 21,3 %) мышцах, принимающих важное участие в мышечной 
дрожи. Вместе с тем в мышцах задних конечностей уровень гликогена при кратковременной умеренной гипотермии не меняется. Однако при пролонгировании этого состояния в течение 3-х часов во всех скелетных мышцах содержание 
гликогена понижается в 3,5–8 раз, а в печени почти полностью истощается.

Таблица 1

Содержание гликогена (в мг %) при умеренной гипотермии в тканях крыс 

(Эмирбеков, Львова, 2002)

№
Вариант 
опыта
Печень
Мозг
Мио кард

Мышцы

жеватель
ная

трапециевидная

икро
ножная

камбаловидная

1
Контроль
1674  ±  40
55  ±  2,4
109  ±  6,4
384  ±  21
376  ±  28
403  ±  31
372  ±  42

2
Гипотермия, 

30 °С

1242  ±  60
47  ±  5,0
–
302  ±  25
246  ±  24

Р1–2<0,01

385  ±  22
397  ±  21

3
Гипотермия, 

30 °С,
3 часа

196  ±  12

Р1–3<0,001

40  ±  2,6

Р1–3<0,01

111  ±  14
52  ±  1,4

Р1–3<0,001

50  ±  2,8

Р1–3<0,001

58  ±  6,0

Р1–3<0,001

101  ±  10

При гипотермии наиболее выражен липолитический эффект катехола
минов, реализуемый через b1-адренорецепторы (Кулинский, Ольховский, 
1992). Так, по данным Е. К. Алимовой и соавт. (1973, 1984), уже в первые 
минуты действия холодового раздражителя, еще до снижения температуры 
тела, в крови крыс возрастает концентрация неэстерифицированных жирных 
кислот (НЭЖК). По мере снижения температуры тела НЭЖК накапливаются как в плазме крови, так и тканях (Алимова и др., 1973, 1984; Плотников, 
Безгачев, 1981; Эмирбеков, Львова, 1985; Эмирбеков и др., 1995). Полученные 
нами данные согласуются с этими результатами (табл. 2).

Свободнорадикальные процессы и состояние мембран при гипотермии

Если увеличение количества жирных кислот в крови гомойотермного орга
низма на начальных этапах охлаждения – четко установленный факт, то данные 
по их динамике при глубокой гипотермии не так однозначны (Плотников, 
Безгачев, 1981; Гурин, 1986). По-видимому, это в значительной мере зависит 
от скорости охлаждения и длительности гипотермии. В наших экспериментах 
(табл. 2) охлаждение крыс до 20 °С в течение часа приводит к нормализации 
уровня НЭЖК в сыворотке крови.

Таблица 2

Содержание липидных компонентов 

в сыворотке крови крыс при гипотермии, 

постгипотермическом периоде (M ± m; n = 6–12)

№
Группа животных
НЭЖК, мкмоль/л
Холестерин, ммоль/л Триглицериды, ммоль/л

1
Контроль
642,4 ± 43,8
1,44 ± 0,07
0,74 ± 0,04

2
Гипотермия 30 °С
1290,1 ± 54,1

Р1–2<0,001

1,87 ± 0,34

Р1–2<0,05

1,23 ± 0,12

Р1–2<0,01

3
Гипотермия 20 °С
565,3 ± 23,8

Р2–3<0,001

3,23 ± 0,23

Р1–3<0,001
Р2–3<0,001

0,94 ± 0,05

Р1–3<0,02

4
Через 1 сутки после 

самосогревания

–
1,81 ± 0,20
0,94 ± 0,11

5
Через 7 суток после 

самосогревания

–
3,50 ± 0,17

Р15<0,001

0,75 ± 0,05

Содержание НЭЖК в крови особенно сильно возрастает при пролонгиро
ванной 3-часовой гипотермии 30 °С и 20 °С (Эмирбеков, Львова, 1985).

При умеренной, и особенно, глубокой гипотермии существенно повы
шается содержание холестерина в сыворотке (табл. 2). Повышение уровня 
общего холестерина в крови и увеличение доли его свободной формы при 
гипотермии были обнаружены и ранее (Алимова и др., 1984; Эмирбеков 
и др., 1995). Повышение содержания холестерина в сыворотке крови при 
гипотермии, видимо, связано как с существенным ускорением его синтеза 
в печени и поступлением в кровь (Алимова и др., 1984), так и с замедлением процесса его выведения из крови (Гурин, 1986). Определенное значение 
при этом имеет, вероятно, и поступление холестерина в сыворотку из 
мембран клеток. Об этом свидетельствует тот факт, что при гипотермии 
содержание холестерина увеличивается в составе липопротеинов высокой 
плотности (ЛПВП) (Гурин, 1986), т.е. тех липопротеинов, которые забирают холестерин с плазматических мембран клеток крови и периферических 
тканей (Климов, Никульчева, 1999). При гипотермии обнаружено снижение содержания холестерина в мембранах эритроцитов крыс (Линчевская, 
Кондратьева, 1989).